樊明強(qiáng)，丁濤，楊向向

【關(guān)鍵字】N-乙酰半胱氨酸；miR-145；去整合素金屬蛋白酶17；動(dòng)脈粥樣硬化；氧化應(yīng)激；小鼠

盡管動(dòng)脈粥樣硬化在預(yù)防、診斷和治療方面的研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但其仍然是全球范圍內(nèi)患者的主要死亡原因之一[1,2]。研究表明，氧化應(yīng)激和氧自由基可能是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[3]。最近有報(bào)道表明[4]，N-乙酰半胱氨酸（NAC）是一種有效的抗氧化劑，可以在體內(nèi)抑制動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型的疾病進(jìn)展[5]。然而，關(guān)于NAC如何通過抗氧化抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的分子機(jī)制尚不明確?；诖?，本研究以動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型和小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞BEND3為研究對(duì)象，旨在探討NAC緩解動(dòng)脈粥樣硬化氧化應(yīng)激損傷的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料具有C57BL/6背景的載脂蛋白E（ApoE） -/-小鼠獲自維通利華。NAC購自Selleck公司（貨號(hào)：S1623）。小鼠血管內(nèi)皮BEND3細(xì)胞購自普諾賽公司（貨號(hào)：CL-0598）。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基購自武漢圣達(dá)威科技有限公司（貨號(hào)：CM-0598）。Opti-MEM培養(yǎng)基購自成都古蒙生物科技有限公司（貨號(hào)：31985071）。Lipofectamine 3000試劑購自上海懿貝瑞生物醫(yī)藥科技有限公司（貨號(hào)：L3000008）?？菇饘匐拿附Y(jié)構(gòu)域蛋白17（ADAM17）抗體和抗GAPDH抗體購自Abcam公司（貨號(hào)：ab57484、ab8245）。總膽固醇（TC）檢測(cè)試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司（貨號(hào)：XY-47435-1）。三酰甘油（TG）檢測(cè)試劑盒購自上海吉至生化科技有限公司（貨號(hào)：BC0625）。小鼠高密度脂蛋白（HDL）檢測(cè)試劑盒購自武漢捷誠(chéng)宇恒科技有限公司（貨號(hào)：JL18893）。小鼠低密度脂蛋白（LDL）檢測(cè)試劑盒購自艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司（貨號(hào)：AB-C2946B）。丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：S0131S）?；钚匝酰≧OS）檢測(cè)試劑盒購自南京建成海浩生物科技有限公司（貨號(hào)：E004-1-1）。TRIzol試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司（貨號(hào)：B610409-0025）。HiScript II Q RT SuperMix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司（貨號(hào)：R222-01）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理小鼠血管內(nèi)皮BEND3細(xì)胞在添加了10%胎牛血清、1%（v/v）青霉素/鏈霉素和1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并置于37℃、5%二氧化碳和95%空氣的環(huán)境中。本研究使用Opti-MEM培養(yǎng)基和Lipofectamine 3000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。NAC溶解于DMSO中，并配置濃度為10 mM的母液。按照是否使用NAC處理小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞BEND3分為兩組：①NAC處理組（使用終濃度為10 μM NAC處理BEND3細(xì)胞24 h）；②NAC不處理組（使用與NAC處理組中相同體積的DMSO處理BEND3細(xì)胞24 h）。

1.2.2 免疫印跡收集小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞BEND3蛋白質(zhì)樣品以進(jìn)行免疫印跡。使用的一抗是抗ADAM17抗體和抗GAPDH抗體。通過化學(xué)發(fā)光試劑盒可視化蛋白質(zhì)，并使用Image Pro Plus軟件進(jìn)行分析。

1.2.3 RNA抽取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用TRIzol試劑分離來自小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞BEND3的總RNA，并使用用于qPCR的HiScript ⅡQRT SuperMix反轉(zhuǎn)錄為cDNA。隨后，qPCR在StepOne Plus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems）中進(jìn)行。使用Ct比較方法（2-△△Ct）計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)。

1.2.4 小鼠高脂飲食建立動(dòng)脈粥樣硬化模型所有動(dòng)物研究均根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》進(jìn)行，并得到醫(yī)院倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。將7周齡的雄性apoE-/-小鼠隨機(jī)分為3組：①正常對(duì)照組（Control），給小鼠喂食未經(jīng)NAC處理的正常食物（n=8）；②動(dòng)脈粥樣硬化組（AS），給小鼠喂食未經(jīng)NAC處理的高脂飲食（n=8）；③NAC處理組，小鼠接受NAC處理的高脂飲食（n=8）。每周兩次通過胃內(nèi)給藥NAC（50 mg/kg）治療小鼠。每周測(cè)量各組小鼠體重。在喂食高脂飲食12周后，將所有小鼠處死進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。取小鼠主動(dòng)脈包埋在OCT化合物中，切成10 μm的切片，以便對(duì)主動(dòng)脈竇的動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)行組織學(xué)分析。

1.2.5 血清生化學(xué)指標(biāo)及ROS、MDA水平的檢測(cè)根據(jù)制造商的說明書，檢測(cè)小鼠血清中TC、TG、HDL、LDL等生化指標(biāo)，檢測(cè)小鼠血管組織中ROS、MDA水平以及NAC處理組和不處理組BEND3細(xì)胞的ROS和MDA水平。所有結(jié)果使用通過酶標(biāo)儀進(jìn)行相應(yīng)吸光度的讀取。

1.2.6 高通量測(cè)序?qū)AC處理和不處理的BEND3細(xì)胞進(jìn)行小RNA文庫的制備。當(dāng)總RNA的純度、濃度和完整性均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，將每個(gè)樣品的總RNA用于制備miRNA測(cè)序（miRNA-seq）文庫，該文庫包括以下步驟：①3'-銜接子連接；②5'-銜接子連接；③使用Illumina實(shí)時(shí)引物和擴(kuò)增引物進(jìn)行cDNA合成；④PCR擴(kuò)增；⑤135～155 bp PCR擴(kuò)增片段的大小選擇（對(duì)應(yīng)于約15～35 nt的小RNA）。構(gòu)建文庫后，使用Agilent DNA 1000芯片試劑盒通過Agilent 2100生物分析儀評(píng)估測(cè)序文庫的質(zhì)量和濃度。將樣品稀釋至最終濃度為8 pM。將文庫變性為單鏈DNA分子，捕獲在Illumina流動(dòng)池上，原位擴(kuò)增為簇，最后根據(jù)制造商的說明在Illumina HiSeq 2000平臺(tái)上測(cè)序36個(gè)循環(huán)。使用TruSeq快速SR聚類試劑盒聚類在Illumina cBot上，并通過在Illumina上使用TruSeq快速SBS試劑盒對(duì)cDNA文庫進(jìn)行測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Tukey檢驗(yàn)的方差分析用于組間分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成情況和血脂水平比較將7周齡的雄性apoE-/-小鼠隨機(jī)分為3組：即正常對(duì)照組（Control）、動(dòng)脈粥樣硬化組（AS）和NAC處理組。喂養(yǎng)12周后，取各組小鼠主動(dòng)脈制作切片進(jìn)行組織學(xué)分析。與對(duì)照組相比，HE染色可見AS組小鼠的血管腔內(nèi)有明顯斑塊形成，而NAC組小鼠無明顯斑塊（圖1A）。且與對(duì)照組相比，AS組血清中TC、TG、 LDL的水平顯著升高（P＜0.05），HDL的水平顯著降低（P＜0.05），NAC組血清中TC、TG、 LDL的水平無顯著變化（P＞0.05），（圖1B、1C、1D和1E）。

圖1 小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成情況和血脂水平比較

2.2 NAC處理后小鼠血管組織和小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞BEND3氧化應(yīng)激指標(biāo)比較與對(duì)照組相比，AS組小鼠血管組織中MDA和ROS水平顯著上升（P＜0.05），NAC組小鼠血管組織中MDA和ROS水平無顯著改變（P＞0.05）。與AS組相比，NAC組小鼠血管組織中MDA和ROS水平均顯著下降（P＜0.05），（圖2A、2B）。細(xì)胞水平，與不處理組相比，NAC處理組中小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞BEND3的MDA和ROS水平均顯著下降（P＜0.05），（圖2C、2D）。

圖2 NAC處理后小鼠血管組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞BEND3氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

2.3 NAC處理后BEND3細(xì)胞miRNA高通量測(cè)序結(jié)果與不處理組相比，NAC處理組中BEND3細(xì)胞通過miRNA高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)包括miR-145在內(nèi)多種miRNAs發(fā)生上調(diào)（圖3A）。在BEND3細(xì)胞中過表達(dá)上述上調(diào)的miRNAs后，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-7017-5p和miR-145時(shí)ROS的水平顯著降低（P＜0.05），圖3B。敲低miR-145后，BEND3細(xì)胞的ROS水平上升（P＜0.05）；但敲低miR-7017-5p后，BEND3細(xì)胞的ROS水平無顯著差異（P＞0.05），圖3C。

圖3 N-乙酰半胱氨酸處理后BEND3細(xì)胞miRNA高通量測(cè)序結(jié)果

2.4 miR-145靶向ADAM17緩解小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞BEND3氧化應(yīng)激水平通過miRDB在線分析發(fā)現(xiàn)miR-145潛在靶向多個(gè)基因。通過siRNA敲低上述基因后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲低ADAM17時(shí)，小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞BEND3的ROS顯著下降（P＜0.05），圖4A。在小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞BEND3中過表達(dá)miR-145后，去整合素金屬蛋白酶17（ADAM17）的mRNA和蛋白水平顯著下降（P＜0.05）；在小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞BEND3中敲低miR-145后，ADAM17的mRNA和蛋白水平顯著上升（P＜0.05），（圖4B、4C、4D）。此外，miR-145靶向ADAM17的3'端非編碼區(qū)（圖4E）。敲低ADAM17后，小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞BEND3的MDA和ROS水平均顯著下降（P＜0.05），（圖5A、5B）；過表達(dá)ADAM17后，小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞BEND3的MDA和ROS水平均顯著上升（P＜0.05），（圖5C、5D）。

圖4 miR-145靶向ADAM17的3' 端非編碼區(qū)

圖5 ADAM17緩解小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞BEND3氧化應(yīng)激水平

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化及其并發(fā)癥（如心肌梗塞和中風(fēng)）是全球范圍內(nèi)患者的主要死亡原因之一，因此，開發(fā)有效的方法來預(yù)防和治療該疾病至關(guān)重要[6]。已有研究報(bào)道，N-乙酰半胱氨酸（NAC）能夠預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化[7]，但其分子機(jī)制尚不明確。在本研究中，通過NAC處理小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞和高通量測(cè)序，鑒定出NAC預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化的潛在機(jī)制。

NAC是一種含硫醇的抗氧化劑，目前用于多種與氧化應(yīng)激相關(guān)疾?。ㄈ缏灾夤苎缀蛯?duì)乙酰氨基酚中毒）的治療[8]。已有報(bào)道，NAC由于其巰基而具有直接和間接的抗氧化活性[9]。此外，NAC脫乙?；筢尫懦霭腚装彼幔瑥亩黾恿思?xì)胞中抗氧化劑分子還原型谷胱甘肽巰基（GSH）的形成[10]。本研究中，HE染色可見動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的血管腔內(nèi)有明顯斑塊。同時(shí)，與對(duì)照組相比，AS組小鼠血清中TC、TG、LDL的水平顯著升高（P＜0.05）、HDL的水平顯著降低（P＜0.05）；與AS組相比，NAC組小鼠血管組織中MDA和ROS水平均顯著下降（P＜0.05）。與不處理組相比，NAC處理組小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞BEND3的MDA和ROS水平均顯著下降（P＜0.05）。此外，本研究中我們還發(fā)現(xiàn)，NAC可以通過調(diào)節(jié)氧化相關(guān)通路基因miR-145的表達(dá)來進(jìn)行抗氧化作用。過表達(dá)上述miR-145后，BEND3細(xì)胞的ROS水平降低（P＜0.05）。敲低miR-145后，BEND3細(xì)胞的ROS水平上升（P＜0.05）。因此，NAC可能具有直接和間接抗氧化的雙重作用。

miRNA是一組高度保守的非編碼單鏈分子，長(zhǎng)度為22～25個(gè)核苷酸[11]。miRNA能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯，從而參與各種生命活動(dòng)[12]。近年來[13]，發(fā)現(xiàn)miRNA廣泛參與心血管疾病，在介導(dǎo)心肌細(xì)胞行為、血管生成以及祖細(xì)胞和干細(xì)胞的功能修復(fù)中至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-145后ADAM17的mRNA和蛋白水平顯著下降（P＜0.05）；敲低miR-145后，ADAM17的mRNA和蛋白水平顯著上升（P＜0.05）。因此，miR-145靶向ADAM17的3'端非編碼區(qū)以降解其mRNA，并減少了ADAM17的蛋白表達(dá)水平。

去整合素金屬蛋白酶17（ADAM17）是金屬蛋白酶家族的重要成員[14]。這種金屬蛋白酶介導(dǎo)關(guān)鍵細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體和其他靶標(biāo)的細(xì)胞間相互作用、信號(hào)傳導(dǎo)和蛋白水解[15]。ADAM17可以促進(jìn)自發(fā)性高血壓大鼠和血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓小鼠的高血壓心臟肥大[16]。在本研究中，敲低ADAM17后，小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞BEND3的MDA和ROS水平均顯著下降（P＜0.05）。過表達(dá)ADAM17后，小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞BEND3的MDA和ROS水平均顯著上升（P＜0.05）。已有研究發(fā)現(xiàn)[17]，ADAM17誘導(dǎo)的三磷酸腺苷或脂多糖刺激的TGF-α和酪氨酸激酶受體的脫落參與了ROS的產(chǎn)生，但對(duì)于其中的分子機(jī)制目前知之甚少，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，NAC通過調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-145/ ADAM17軸，降低MDA和ROS水平來發(fā)揮緩解動(dòng)脈粥樣硬化氧化應(yīng)激損傷的作用。