張奕雯，駱楊平

高脂血癥是指血漿中甘油三酯（TG）和（或）膽固醇（TC）升高，也包括低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）升高和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）降低，可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化（AS）、冠心病（CHD）、胰腺炎等。據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，目前我國(guó)成人高脂血癥的患病率高達(dá)40.40%[1]，預(yù)測(cè)從2010～2030年，每年的心血管事件將增加50%[2]，因此有效控制血脂水平，對(duì)防控心腦血管疾病、降低心血管事件發(fā)生尤為重要。目前廣泛應(yīng)用的他汀類等調(diào)脂藥物，調(diào)脂效果較好，但是作用機(jī)制單一、副作用多，在應(yīng)用過(guò)程中仍受限，因此開(kāi)發(fā)更加有效、更加安全的降脂藥物是不可或缺的。

高脂血癥在中醫(yī)學(xué)屬于“眩暈”“脅痛”范疇，亦有“脂濁”之說(shuō)，治療原則為消痰化瘀、健脾和胃。脂必泰膠囊是由紅曲、澤瀉、白術(shù)、山楂四味中藥組方[3]，其中紅曲有消痰化瘀功效，澤瀉、白術(shù)、山楂有健脾和胃功效，該組方正中高脂血癥的病機(jī)，為治療高脂血癥提供新思路。

脂必泰膠囊的成分較為復(fù)雜、作用靶點(diǎn)不確定，常規(guī)的藥理學(xué)研究方法難以全面闡明其治療高脂血癥的機(jī)制，本文主要借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)脂必泰膠囊治療高脂血癥的主要活性成分、作用靶點(diǎn)、作用通路等方面進(jìn)行探討，進(jìn)一步明確脂必泰膠囊治療高脂血癥的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 脂必泰活性成分、靶點(diǎn)篩選使用傳統(tǒng)藥物數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP、Herb、SymMap、TCMID和TCM-ID數(shù)據(jù)庫(kù)收集脂必泰的活性成分，依次在各數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入“山楂”、“澤瀉”、“白術(shù)”、“紅曲”四味中藥收集匯總成分，在TCMSP中選擇藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18%作為篩選條件，并在TCMSP篩選相應(yīng)成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.2 高脂血癥基因靶點(diǎn)收集通過(guò)對(duì)CTD、TTD、DisGeNET、OMIM、Genecards和DigSee等多種疾病數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，檢索關(guān)鍵詞為“hyperlipemia”，盡可能收集更為全面的高脂血癥靶點(diǎn)資料，去除重復(fù)的靶點(diǎn)作為高脂血癥靶點(diǎn)資料。

1.3 脂必泰-高脂血癥共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析借助韋恩圖工具（Draw wenn diagram）將脂必泰作用靶點(diǎn)映射到高脂血癥靶點(diǎn)，獲取脂必泰-高脂血癥共同靶點(diǎn)基因。運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建活性成份-疾病-靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析。

1.4 共同靶點(diǎn)蛋白-蛋白（PPI）互作分析運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)分析共同靶點(diǎn)的蛋白-蛋白互作分析，物種選擇“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.400，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置不變，結(jié)果保存為TSV文本輸出，并將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)一步分析，運(yùn)用“cytoHubba”插件獲得關(guān)鍵靶蛋白。

1.5 基因本體論（GO）生物過(guò)程分析以及京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）信號(hào)通路富集分析使用R的clusterProfiler軟件包（R 4.0.2 for Windows）進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，其中GO分析包括生物學(xué)過(guò)程（BP）、細(xì)胞學(xué)組分（CC）、生物學(xué)功能（MF），設(shè)置p value Cut-off=0.05，q value Cut-off=0.2為具有意義的富集結(jié)果。

1.6 成分-靶蛋白分子對(duì)接在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)和ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)中下載相應(yīng)的蛋白的PDB文件和化合物成分的mol2格式文件，運(yùn)用AutoDock軟件完成分子對(duì)接，對(duì)接使用Lamarckian genetic algorithm（LGA）算法。計(jì)算結(jié)合能（BE）（kJ mol-1）來(lái)評(píng)估脂必泰活性成分與高脂血癥靶蛋白的結(jié)合活性，一般小于-5.0 kal/mol的對(duì)接結(jié)合能被認(rèn)為具有良好的結(jié)合相互作用，最后運(yùn)用PyMOL軟件進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 脂必泰活性成分、靶點(diǎn)篩選在設(shè)置“OB≥30，DL≥0.18”的條件下共獲得山楂9種，澤瀉9種，白術(shù)15種，紅曲暫未收集具備條件的成分，去除重復(fù)及無(wú)靶點(diǎn)的成分后共獲得23種有效活性成分，210個(gè)靶點(diǎn)，具體活性成分見(jiàn)表1，由表可知，生物口服利用度最高的是百部堿（stemonine），類藥性最高的是澤瀉醇C醋酸酯（alisol C monoacetate）。

表1 脂必泰活性成分列表

2.2 脂必泰-高脂血癥共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

2.2.1 高脂血癥基因靶點(diǎn)收集對(duì)CTD、TTD、DisGeNET等疾病數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，去除重復(fù)靶點(diǎn)后共獲得1833個(gè)高脂血癥相關(guān)度較高的靶點(diǎn)基因，通過(guò)韋恩圖工具將脂必泰潛在作用靶點(diǎn)映射到獲得的高脂血癥相關(guān)靶點(diǎn)中，共獲得129個(gè)共同靶點(diǎn)（圖1）。

圖1 脂必泰與高脂血癥靶點(diǎn)韋恩圖

2.2.2 共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析運(yùn)用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），該網(wǎng)絡(luò)圖中包含共 154個(gè)節(jié)點(diǎn)和302條作用線。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析得出，活性成分中度值最高的是槲皮素，其次是山奈酚、異鼠李素、芒柄花素。

圖2 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 共同靶點(diǎn)PPI互作分析運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件中分析蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的TSV文件，該網(wǎng)絡(luò)中包含128個(gè)節(jié)點(diǎn)，2443條邊，結(jié)果見(jiàn)圖3，節(jié)點(diǎn)代表Degree值的大小，Degree值越大，說(shuō)明這個(gè)節(jié)點(diǎn)作用越大。運(yùn)用“cytoHubba”插件進(jìn)一步分析，根據(jù)發(fā)現(xiàn)TOP10的核心靶點(diǎn)為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGFA）、腫瘤蛋白P53（TP53）、半胱天冬蛋白酶3（CASP3）、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、AP-1轉(zhuǎn)錄因子（JUN）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）。

圖3 PPI互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO和KEGG富集分析應(yīng)用R中的clusterProfiler分析GO富集和KEGG通路富集，相關(guān)基因靶點(diǎn)主要富集了2322條生物學(xué)過(guò)程，43條細(xì)胞組成分，161條生物學(xué)功能，根據(jù)P值的8-*顯著性取各前10的條目見(jiàn)圖4。顯而易見(jiàn)，BP涉及對(duì)脂多糖反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、對(duì)細(xì)菌源分子反應(yīng)（response to molecule of bacterial origin）、活性氧代謝過(guò)程（reactive oxygen species metabolic process）、營(yíng)養(yǎng)水平（response to nutrient levels）、氧氣水平反應(yīng)（response to oxygen levels）等，CC涉及膜筏（ membrane raft）、膜微結(jié)構(gòu)域（membrane microdomain）、質(zhì)膜筏（plasma membrane raft）、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物（RNA polymerase Ⅱ transcription factor complex）等，MF涵蓋核受體活性（nuclear receptor activity）、轉(zhuǎn)錄因子活性（transcription factor activity），直接配體調(diào)控序列特異性DNA結(jié)合（direct ligand regulated sequencespecific DNA binding）、類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity）、細(xì)胞因子活性（cytokine activity）、絲氨酸水解酶活性（serine hydrolase activity）等。

圖4 GO富集分析氣泡圖

KEGG通路富集分析獲得了168條通路，圖5展示了前20條顯著性較高的通路，由圖可知，脂必泰治療高脂血癥涉及的通路有脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路（Lipid and atherosclerosis）、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、IL-17信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）、TNF信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、HIF-1信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）等。

圖5 KEGG通路富集條形圖

2.5 成分-靶蛋白分子對(duì)接選擇PPI結(jié)果的10個(gè)核心靶點(diǎn)與之對(duì)應(yīng)成分?jǐn)?shù)較多的7種關(guān)鍵成分進(jìn)行分子對(duì)接，運(yùn)行AutoDock軟件共進(jìn)行70次。對(duì)接結(jié)果分析，所有對(duì)接結(jié)合能均小于-5.0 kal/mol，部分結(jié)果見(jiàn)表2，由表可知，豆甾醇與AKT1結(jié)合度最高，β-谷甾醇與多種關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合度高。取結(jié)合能較高的8對(duì)結(jié)果在Pymol軟件中進(jìn)行可視化。由圖6可知，豆甾醇與AKT1有氫鍵相連，并于ARG-273、TYR-272殘基相互作用，β-谷甾醇與PTGS2、TNF、TP53等具有氫鍵連接，與AKT1的HIS-180有π鍵-烷基相互作用。所有成分與核心蛋白的殘基均有氫鍵連接，進(jìn)一步說(shuō)明分子與蛋白之間結(jié)合緊密，進(jìn)而表明，脂必泰的治療作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)這些核心靶點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

圖6 脂必泰有效成分與靶點(diǎn)蛋白分子對(duì)接

表2 脂必泰有效成分與靶點(diǎn)蛋白分子對(duì)接結(jié)合能

3 討論

作為心血管疾病的一項(xiàng)主要危險(xiǎn)因素，高脂血癥與遺傳易感性、飲食攝入、機(jī)體代謝、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、促炎性脂肪因子等因素密切相關(guān)。血脂和脂蛋白的水平、氧化應(yīng)激、炎癥、內(nèi)皮細(xì)胞損傷等因素是高脂血癥影響AS進(jìn)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。脂必泰膠囊目前廣泛應(yīng)用于臨床治療，且與他汀類等西藥相比，被證明綜合調(diào)脂作用強(qiáng)、不良反應(yīng)少、安全高[4]，由于脂必泰膠囊是由四種中藥組成，而中藥的成分復(fù)雜、靶點(diǎn)眾多等原因，其作用機(jī)制一直是研究的重難點(diǎn)，目前脂必泰膠囊是如何調(diào)節(jié)血脂水平仍尚未闡明，本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)可能的作用靶點(diǎn)及機(jī)制一一闡述。

本研究得出脂必泰膠囊的活性成分有槲皮素、山奈酚、異鼠李素、芒柄花素等，其調(diào)節(jié)血脂的核心靶點(diǎn)包括AKT1、IL-6、TNF、VEGFA、TP53、CASP3、PTGS2、MAPK1、JUN、MAPK8等，涉及炎癥因子、轉(zhuǎn)錄因子、脂質(zhì)代謝相關(guān)因子等方面。目前已有相關(guān)研究[5-7]發(fā)現(xiàn)與脂質(zhì)代謝相關(guān)靶點(diǎn)有AKT1、TP53、TNF、IL-6等，與本研究結(jié)果相同。其中AKT參與多種生物學(xué)過(guò)程，包括代謝、胰島素信號(hào)傳導(dǎo)、血管生成等信號(hào)，通過(guò)刺激碳水化合物反應(yīng)性元素結(jié)合蛋白（ChREBP）的活性來(lái)調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和胰島素敏感性，及脂肪細(xì)胞的合成[8]，一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究表明鹽誘導(dǎo)激酶2（SIK2）可通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（SREBP1c）和SREBP2的上調(diào)，促進(jìn)脂肪酸和膽固醇的合成[9]，推斷脂必泰膠囊可能是抑制PI3K/AKT通路，從而降低脂質(zhì)水平。IL-6、TNF是兩種細(xì)胞因子，它們生物學(xué)功能豐富，主要參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等，已成為衡量高脂血癥的指標(biāo)。炎癥反應(yīng)可刺激脂肪細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，影響其增殖分化、細(xì)胞因子分泌及對(duì)胰島素敏感性等生物學(xué)過(guò)程，進(jìn)而導(dǎo)致血脂異常和脂肪蓄積[10]。相關(guān)研究表明，槲皮素、山奈酚可通過(guò)抑制TNF和IL-6的水平、核因子κB（NF-κB）的活化，阻斷主動(dòng)脈組織和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中的NFκB/AP-1信號(hào)通路、Nrf2/HO-1信號(hào)通路，保護(hù)血管調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡[11,12]。CASP3作為一種凋亡蛋白酶在AS斑塊中表達(dá)，與細(xì)胞凋亡和動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)。高脂血癥可促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化形成ox-LDL，在CASP3介導(dǎo)下升高NF-κB水平，加速內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，加重AS程度[13]。其中山奈酚可通過(guò)下調(diào)TP53，激活CASP3/9和聚ADP核糖聚合酶（PARP）的水平來(lái)減弱細(xì)胞凋亡[12]。以上研究說(shuō)明，脂必泰膠囊可能通過(guò)上述核心成分共同作用于相關(guān)靶點(diǎn)來(lái)調(diào)節(jié)脂質(zhì)的合成和代謝，從而發(fā)揮降脂、抗氧化、抗炎等豐富的作用，同時(shí)脂必泰膠囊的其他活性成分也可能通過(guò)其他靶點(diǎn)起到調(diào)脂作用。

在KEGG通路富集分析中，其中脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路是顯著性最高的，主要是由于血管中LDL進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化修飾成ox-LDL，巨噬細(xì)胞吞噬受損內(nèi)皮上的ox-LDL，并轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，誘發(fā)炎癥反應(yīng)并合成和分泌更多的生長(zhǎng)因子及促炎介質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)斑塊生長(zhǎng)及加重炎癥反應(yīng)[14]。Jia等[15]研究表明槲皮素通過(guò)調(diào)節(jié)PCSK9、CD36、PPAR+、LXR+和ABCA1的表達(dá)，從而防止AS在apoE-/-小鼠中的發(fā)展。在AGE-RAGE信號(hào)通路中，晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）在氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、AS中發(fā)揮重要作用，AGE與其受體RAGE參與并介導(dǎo)的NADPH氧化酶等多種信號(hào)通路促使NOS生成，激活NF-κB，并分泌大量炎性因子，最終會(huì)加快AS的進(jìn)展[16]。血脂異常加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷又使抗炎因子和促炎因子失衡，包括TNF信號(hào)通路、IL-17通路等被激活，進(jìn)一步加重血管內(nèi)皮的損傷，促進(jìn)AS斑塊的形成[17]。HIF-1是作為缺氧傳感器，缺氧環(huán)境下HIF-1通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和增加脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPs 3、4、7）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外脂肪酸（FA）攝取，上調(diào)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（LRP1）和極低密度脂蛋白受體（VLDLR）促進(jìn)脂蛋白的內(nèi)吞作用，最終導(dǎo)致缺氧條件下的脂質(zhì)積累[18]。以上分析可以推測(cè)出脂必泰膠囊可以通過(guò)脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路，達(dá)到抗AS、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌代謝、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)血脂水平。

綜上所述，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示了多成分、多靶點(diǎn)、多通路之間的緊密相互作用，并增加了對(duì)于脂必泰膠囊治療高脂血癥的作用機(jī)制了解。但是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是根據(jù)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析的，可能受到數(shù)據(jù)庫(kù)的完整性影響，同時(shí)也未能考慮藥物活性成分在人體中藥代動(dòng)力學(xué)中的改變，在該分析的基礎(chǔ)上仍需完善體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果。