陳蘭茜 張宏達(dá) 朱碩儒

胰腺癌是一種死亡率較高、患癌初期特征不明顯、預(yù)后較差的惡性腫瘤。據(jù)2018 年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，胰腺癌的發(fā)病率和死亡率分別位居全球常見(jiàn)癌癥發(fā)病率和死亡率的第11 位和第7 位。患者的5 年生存率在所有癌癥中最低，僅為9%，1 年生存率僅為24%，且胰腺癌患病率呈增長(zhǎng)狀態(tài)，患病年齡呈年輕化趨勢(shì)[1]。近年來(lái)，研究證實(shí)胰腺癌進(jìn)展過(guò)程中多個(gè)信號(hào)通路均有參與，而Wnt 信號(hào)通路在胰腺癌細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫等過(guò)程中扮演重要角色[2]。β-catenin 廣泛存在于機(jī)體細(xì)胞中，作為Wnt 通路較為重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子被發(fā)現(xiàn)，屬于多功能胞質(zhì)蛋白的一種。Wnt/Wnt1、βcatenin 蛋白可影響組織細(xì)胞功能，在癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演重要角色[3]。microRNA 的生物學(xué)特性極為廣泛，還有一定的內(nèi)因性調(diào)節(jié)功能，對(duì)人體一半的蛋白基因都有調(diào)節(jié)作用，對(duì)mRNA 的分解有一定的促進(jìn)作用，同時(shí)還能對(duì)目標(biāo)基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄進(jìn)行阻礙。miR-21 是目前臨床上研究的致癌基因之一[4]。眾多癌細(xì)胞中都存在miR-21的異常表達(dá)，如：肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌等，miR-21 表達(dá)增加促進(jìn)了腫瘤的增生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移[5]。根據(jù)病因和目標(biāo)療法的研究基礎(chǔ)，miR-21 和Wnt 信號(hào)已被納入胰腺癌的治療中，但其作用機(jī)制尚不明確[6]。因此，本次研究通過(guò)對(duì)miR-21 介導(dǎo)Wnt 信道通路的機(jī)制進(jìn)行研究，分析其對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本次研究于2021 年3 月進(jìn)行。人胰腺腺癌細(xì)胞株ASPC-1（由上海肅攀公司生產(chǎn)）來(lái)源于人胰腺癌患者腹水中的細(xì)胞，在M-NSG小鼠皮下接種后，能正常成瘤。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取出ASPC-1 細(xì)胞，接種細(xì)胞為圓形，懸浮1 d 后逐漸貼壁，2 d 時(shí)細(xì)胞完全貼壁，貼壁細(xì)胞呈梭形或多邊形，等到細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用0.25%的胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，用吸管輕輕吹打，把細(xì)胞制成懸液后移到培養(yǎng)瓶中，對(duì)細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，收集第5代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。將收集的細(xì)胞制成1×105/ml 的液體，將細(xì)胞懸液放置16 孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～80%時(shí)取出細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 收集生長(zhǎng)至60%～80%的ASPC-1 細(xì)胞，將細(xì)胞放置培養(yǎng)皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染過(guò)程均按照Lipofectamine 2 000 說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行，將細(xì)胞分為三組：As 組、Ay 組和Nc 組。As 組為正常ASPC-1 細(xì)胞，Ay 組為ASPC-1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染+miR-21-inhibitions 細(xì)胞，Nc 組為ASPC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染+miR-21-陰性對(duì)照細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞4 h 后，將細(xì)胞上清液去除，更換培養(yǎng)基后對(duì)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。其中miR-21-inhibitions 細(xì)胞、miR-21-陰性對(duì)照細(xì)胞由上海吉瑪公司生產(chǎn)。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)Wnt1、β-catenin 水平變化ASPC-1細(xì)胞總RNA 采用Trizol 法來(lái)提取，根據(jù)逆轉(zhuǎn)試劑盒（由武漢塞維爾公司生產(chǎn)）將總RNA 提取反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用DNA 熒光染料SYBR GreenⅠ對(duì)miR-21、Wnt1、β-catenin 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，內(nèi)參采用U6，60°C 10 min，95 ℃、72°C 各30 s，95 ℃5 min，循環(huán)次數(shù)以40次為準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)次數(shù)至少3 次，用相對(duì)定量2-ΔΔCT計(jì)算miR-21、Wnt1、β-catenin水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.4 Westernblot 法檢測(cè)Wnt1、β-catenin 蛋白表達(dá) 取出100 μg 的胰蛋白酶提取液，將其加入到6 孔板中，將2 ml 的培養(yǎng)基再次注入培養(yǎng)板中，把轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞移到EP管中后和胰蛋白酶提取液混合，放入冰箱中冷凍，10 min后細(xì)胞裂變成為E溶液；在EP管中再次加入2 ml的胰蛋白酶提取液，讓細(xì)胞裂變?yōu)镕 溶液，將E 溶液和F 溶液充分混勻后制成工作液，放置37 ℃的環(huán)境中靜止20 min，待細(xì)胞冷卻后計(jì)算Wnt1、β-catenin蛋白濃度。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ASPC-1 細(xì)胞凋亡程度 將ASPC-1 細(xì)胞注入6 孔培養(yǎng)板中，1 d 后將少量的胰蛋白酶加入到培養(yǎng)板進(jìn)行消化，4 h 后將細(xì)胞置于-20 ℃甲醛溶液中冷藏，1 d 后將細(xì)胞離心去除上清液，用磷酸鹽緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多次沖洗，用5 μl 標(biāo)記lFITC 的AnnexinⅤ與5 μl PI 染色混勻，采用流式細(xì)胞儀分析ASPC-1 細(xì)胞凋亡程度。

1.2.6 Transwell 檢測(cè)ASPC-1 細(xì)胞遷移能力 饑餓處理三組細(xì)胞12 h 后，將DMSO 溶液加入細(xì)胞中，24 h 后離心，重懸細(xì)胞成為5×105/ml 的細(xì)胞懸液，在細(xì)胞懸液中注入Transwell 小室后在培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)結(jié)束后可上室，拭去未遷移細(xì)胞，用甲醛固定細(xì)胞8 min，用結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，用顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀(guān)察。

1.2.7 MTT 檢測(cè)ASPC-1 細(xì)胞活力 ASPC-1 細(xì)胞離心，5 min 后將細(xì)胞接種于96 孔板中培養(yǎng)，每孔注入細(xì)胞溶液200 μl，保持環(huán)境為37°C，CO2濃度為5%，培養(yǎng)24 h 后將MTT 溶液加入細(xì)胞中，3 h 后和DMSO溶液混勻，酶標(biāo)儀測(cè)定光密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni 校正法。設(shè)P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢測(cè)三組細(xì)胞miR-21、Wnt1、βcatenin水平變化見(jiàn)表2

表2 三組細(xì)胞miR-21、Wnt1、β-catenin水平變化

由表2 可見(jiàn)，三組miR-21、Wnt1、β-catenin 水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=55.47、14.30、123.60，P均＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，As 組、Nc 組miR-21、Wnt1、β-catenin 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），與As 組、Nc 組比較，Ay 組miR-21、Wnt1、β-catenin 水平有明顯下降（P均＜0.05）。

2.2 Westernblot 法檢測(cè)Wnt1、β-catenin 蛋白表達(dá)見(jiàn)表3

表3 三組Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)情況

由表3 可見(jiàn)，三組Wnt1、β-catenin 蛋白表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=3.54、5.85，P均＜0.05）。兩兩比較，As 組、Nc 組Wnt1、β-catenin 蛋白表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），與As組、Nc 組比較，Ay 組Wnt1 蛋白表達(dá)有明顯下降，βcatenin蛋白表達(dá)明顯上升（P均＜0.05）。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ASPC-1 細(xì)胞凋亡程度 As 組細(xì)胞凋亡率為（13.51±2.31）%，Nc 組細(xì)胞凋亡率為（13.53±2.22）%，Ay 組細(xì)胞凋亡率為（7.32±1.56）%，三組間細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.27，P＜0.05）。兩兩比較，As 組、Nc 組ASPC-1 細(xì)胞凋亡率沒(méi)有明顯差異（P＞0.05），Ay 組ASPC-1 細(xì)胞凋亡率較As組、Nc組明顯下降（P均＜0.05）。

2.4 Transwell 檢測(cè)ASPC-1 細(xì)胞遷移能力見(jiàn)封二圖1

圖1 ASPC-1細(xì)胞遷移能力

由封二圖1可見(jiàn)，As組、Nc組ASPC-1細(xì)胞遷移能力比較，差異不明顯，與As 組、Nc 組遷移能力比較，Ay組ASPC-1細(xì)胞遷移能力明顯下降。

2.5 MTT檢測(cè)ASPC-1細(xì)胞活力見(jiàn)表4

表4 三組ASPC-1細(xì)胞活力比較

由表4 可見(jiàn)，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 時(shí)，三組間ASPC-1 細(xì)胞活力比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=9.62、24.47、126.10，P均＜0.05）。兩兩比較，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 時(shí)，AS 組與Nc 組細(xì)胞活力無(wú)明顯差異（P＞0.05），Ay 組細(xì)胞活力均低于As 組、Nc組（P均＜0.05）。

3 討論

胰腺癌屬于消化道常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，全球胰腺癌的發(fā)病率有小幅度上升，國(guó)外胰腺癌病死率已居第四位，在我國(guó)也有較高的死亡率，胰腺癌首發(fā)癥狀以上腹部異常疼痛或不適最為常見(jiàn)，屬于預(yù)后最差的惡性腫瘤之一[7，8]。癌癥侵襲和細(xì)胞因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等有密切的聯(lián)系[9]。近年來(lái)研究證實(shí)，miRNA 介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，同時(shí)有研究表明在胰腺癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中miR-21 發(fā)揮重要作用，并且其在腫瘤的生物學(xué)活性中取得很大的研究進(jìn)展[10]。miR-21 主要位于跨膜蛋白基因編碼區(qū)域，轉(zhuǎn)錄后對(duì)相關(guān)基因有負(fù)調(diào)控的作用[11]。大數(shù)據(jù)證實(shí)顯示胰腺癌細(xì)胞促進(jìn)腫瘤相關(guān)纖維細(xì)胞miR-21 表達(dá)，miR-21 的過(guò)表達(dá)會(huì)加速癌細(xì)胞的侵襲，而沉默miR-21 表達(dá)可抑制細(xì)胞的侵襲[12]。Liu等[13]指出，將抗miR-21 的慢性毒質(zhì)粒注入胰腺癌細(xì)胞株中，能抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖能力，且呈時(shí)間依賴(lài)性，其中下調(diào)miR-21 能有效地抑制胰腺癌的細(xì)胞增殖。

本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與As 組、Nc 組比較，Ay 組Wnt1、β-catenin 水平有明顯下降，且Wnt1 結(jié)果蛋白表達(dá)及ASPC-1 細(xì)胞凋亡率亦明顯下降，而βcatenin 蛋白表達(dá)明顯上升（P均＜0.05）。有研究證實(shí)，有效地調(diào)控Wnt 通路能有效抑制胰腺癌細(xì)胞中相關(guān)蛋白的活性，同時(shí)也會(huì)一定程度地增加化療藥物的敏感性[14,15]。在胃癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了Wnt通路的存在，當(dāng)激活Wnt通路時(shí)，限制了其靶器官的分化，保留了干細(xì)胞的特異性的同時(shí)也加快了癌細(xì)胞的分化，最終導(dǎo)致腫瘤的形成[16]。多數(shù)癌癥患者機(jī)體中Wnt1、β-catenin 的表達(dá)都有明顯升高，異常表達(dá)的Wnt/Wnt1、β-catenin 可加劇機(jī)體免疫細(xì)胞的損傷，例如，抑制腫瘤中的Wnt信號(hào)表達(dá)，降低癌細(xì)胞的放射敏感性，進(jìn)而讓放療和化療的效果得到一定程度的提高[17]。miRNA的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，成為近幾年的研究熱點(diǎn)。最近研究表明miR-21 在肝癌、胰腺癌等多種人類(lèi)腫瘤表達(dá)下調(diào)，miR-21表達(dá)下調(diào)后，對(duì)靶基因PTEN 降解減少，PTEN 蛋白表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)而負(fù)向調(diào)節(jié)AKT 通路使其喪失活性。AKT 通路的失活觸發(fā)下游一系列生物學(xué)行為改變，包括抑制細(xì)胞遷移和增殖能力。

本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與As 組、Nc 組比較，Ay 組ASPC-1 細(xì)胞遷移能力和細(xì)胞活力明顯下降（P均＜0.05），提示miR-21 能影響細(xì)胞增殖、凋亡和調(diào)控以及肝纖維化過(guò)程。近些年來(lái)，與胰腺癌相關(guān)的miRNA 不斷被發(fā)現(xiàn)，miR-21 在胰腺癌下?lián)艿蛲鲞^(guò)程中的調(diào)控機(jī)制也逐漸被證實(shí)[18]。促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡可通過(guò)抑制miR-21 的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)，使胰腺癌細(xì)胞恢復(fù)功能活性[19]。通過(guò)對(duì)肺癌中轉(zhuǎn)基因小鼠和Wnt 信號(hào)通路的研究發(fā)現(xiàn)，活化Wnt 信號(hào)會(huì)讓其在肺泡上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)[20]，因此，Wnt 信號(hào)可調(diào)控Wnt1、β-catenin 促進(jìn)癌癥的進(jìn)展。在胰腺癌組織及胰腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-21 水平高于正常組織，因此，調(diào)控miR-21 可影響細(xì)胞增殖與凋亡。

綜上所述，miR-21 低表達(dá)能明顯抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路活性來(lái)實(shí)現(xiàn)。