李盼，史平玲，葛可可，張文華，胡旭萌，周佳木，魏圓夢(mèng)，李苗，宋宗明

(鄭州大學(xué)人民醫(yī)院/河南省人民醫(yī)院/河南省立眼科醫(yī)院/河南省眼科研究所/河南大學(xué)人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003)

缺血缺氧在許多視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮了重要的作用，如早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、老年性黃斑變性等視網(wǎng)膜疾病[1]。視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞是視網(wǎng)膜組織駐留的免疫監(jiān)測(cè)細(xì)胞[2]。靜息狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞負(fù)責(zé)檢測(cè)機(jī)體微環(huán)境的變化，并對(duì)損傷和感染等刺激作出快速應(yīng)答[3]。低氧也能夠誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生活化，并分泌大量的炎癥因子和趨化因子[2]，活化小膠質(zhì)細(xì)胞不僅能夠引起視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷及新生血管生成[4-5]，還能導(dǎo)致代謝異常[6]，最終造成不可逆的視力損害。但是低氧誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞代謝異常的機(jī)制尚未完全闡明。因此，探索低氧誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞代謝紊亂的作用機(jī)制可為缺血缺氧性視網(wǎng)膜疾病尋找新的治療靶點(diǎn)提供新思路。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是新興的利用新一代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)，可以快速獲取某種干預(yù)后組織或細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本信息，具有高分辨率、高通量、高靈敏度、使用便捷等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、動(dòng)物、植物等研究領(lǐng)域中[7]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)低氧處理的小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，旨在探討低氧對(duì)BV2細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞來(lái)源 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)。

1.1.2主要儀器及試劑 胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司，含1 g·L-1鏈霉素和青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、胰蛋白酶-EDTA消化液、RIPA組織/細(xì)胞快速裂解液、TBST緩沖液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，脫脂奶粉購(gòu)自北京克爾慧科技有限公司，羊抗兔IgG-HRP、羊抗兔IgG-FITC、鼠單克隆抗體PFKP購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，ECL雙敏化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自安諾倫(北京)生物科技有限公司，PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)自上海雅酶生物科技有限公司，羅丹明123、兔多克隆抗體TPI1、兔單克隆抗體PGK1購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，羊抗鼠IgG-HRP購(gòu)自愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司，蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑購(gòu)自MCE公司，NC膜購(gòu)自Merck Millipore公司，Trizol Reagent試劑購(gòu)自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)所需試劑TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa Biotechnology公司，引物由中國(guó)上海生工生物工程股份有限公司合成，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)，StepOnePlusTMReal-Time PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)，研究型熒光正置顯微鏡(Nikon 80i)，化學(xué)發(fā)光儀(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) BV2細(xì)胞培養(yǎng)于21% O2(體積分?jǐn)?shù))、5% CO2(體積分?jǐn)?shù))、37 ℃的三氣培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)液采用含有10 g·L-1胎牛血清的DMEM，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合度時(shí)進(jìn)行傳代。從三氣培養(yǎng)箱中拿出細(xì)胞，移出培養(yǎng)液，PBS輕輕漂洗1遍，用1 mL含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)變圓時(shí)即可加入含10 g·L-1胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液終止消化，1 000 r·min-1離心5 min后棄去上清，用培養(yǎng)液重懸沉淀，按每毫升1×106個(gè)細(xì)胞的密度接種細(xì)胞至直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中。

1.2.2細(xì)胞分組 細(xì)胞在21% O2(體積分?jǐn)?shù))、5% CO2(體積分?jǐn)?shù))、37 ℃的三氣培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜，常氧組在21% O2(體積分?jǐn)?shù))、5% CO2(體積分?jǐn)?shù))、37 ℃的三氣培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h，低氧組放入1% O2(體積分?jǐn)?shù))、5% CO2(體積分?jǐn)?shù))、37 ℃的三氣培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h。細(xì)胞分組為：常氧12 h組、低氧12 h組、常氧24 h組、低氧24 h組。

1.2.3RT-qPCR 收集常氧組和低氧組細(xì)胞，采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)RNA濃度，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說(shuō)明書(shū)將提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，95 ℃變性15 s。內(nèi)參基因均選用β-actin，引物序列見(jiàn)表1，采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量，每組4個(gè)樣本，每個(gè)樣本重復(fù)3次。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.4免疫熒光染色 將BV2細(xì)胞接種于6孔板中的細(xì)胞爬片上，用含10 g·L-1的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜，分別在常氧和低氧條件下處理12 h和24 h，取出細(xì)胞爬片用4 g·L-1的多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)室溫固定10 min，PBS洗滌3次；使用含0.2 g·L-1Triton X-100(Sigma公司)的PBS室溫破膜30 min，PBS洗滌3次；10%(體積分?jǐn)?shù))山羊血清(北京索萊寶科技有限公司)室溫封閉30 min。標(biāo)記一抗，抗CD11b鼠克隆抗體-PE(50-0112-U100，Tonbo Biosciences公司)和抗IBA-1兔單克隆抗體(17198，Cell Signaling Technology)，按1∶100稀釋，避光4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次，標(biāo)記二抗，羊抗兔IgG-FITC (bs-0295G-FITC，Bioss)，使用PBS按1∶200稀釋二抗，Hoechst33342按1∶1 000稀釋,避光室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，加入防熒光淬滅封固劑進(jìn)行封固，每組3個(gè)樣本，通過(guò)研究型熒光正置顯微鏡(Nikon 80i)觀察拍照。

1.2.5線粒體膜電位檢測(cè) 細(xì)胞常氧和低氧分別處理12 h和24 h。陽(yáng)性對(duì)照組為CCCP(終濃度為10 μmol·L-1)加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，提前處理細(xì)胞30 min。收集細(xì)胞，緩沖液漂洗細(xì)胞1次，加入1 mL羅丹明123(終濃度為5 μmol·L-1)，避光37 ℃孵育30 min，離心后棄上清，緩沖液漂洗細(xì)胞1次，加入500 μL緩沖液重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡(Western blot，WB) BV2細(xì)胞分別常氧和低氧處理12 h和24 h，收集細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液，使用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎細(xì)胞，16 000 g 4 ℃離心20 min，收集上清，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取等量蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)印至NC膜上，脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，一抗PFKP、TPI1、PGK1按1∶1 000稀釋后4 ℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，二抗羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP按1∶5 000稀釋后室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌3次，使用ECL雙敏化學(xué)發(fā)光試劑和化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.2.7轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析 每個(gè)實(shí)驗(yàn)分組均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，總RNA的提取、質(zhì)檢及文庫(kù)的構(gòu)建由武漢華大科技有限公司完成，使用BGISEQ-500平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，然后以FASTQ格式輸出原始數(shù)據(jù)，用Trimmomatic軟件將低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過(guò)高的reads去除，得到高質(zhì)量序列，使用HISAT軟件將高質(zhì)量序列比對(duì)到NCBI參考基因組序列(GCF_000001635.26_GRCm38.p6)，使用Bowtie2軟件將高質(zhì)量序列比對(duì)到NCBI參考基因組序列(GCF_000001635.26_GRCm38.p6)，獲得轉(zhuǎn)錄本并計(jì)算其表達(dá)量，即每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的片段(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads，F(xiàn)PKM，即在每百萬(wàn)個(gè)reads值中，來(lái)自某基因每千個(gè)堿基長(zhǎng)度的reads值)。以Pearson相關(guān)系數(shù)表示相同處理樣本間基因表達(dá)模式的相關(guān)性。使用R軟件的Pheatmap包對(duì)常氧組和低氧組進(jìn)行差異表達(dá)分析，顯著差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)的篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC(fold change)| ≥1且Q≤0.05。采用華大基因多組學(xué)Dr.Tom系統(tǒng)進(jìn)行DEGs數(shù)量統(tǒng)計(jì)，并對(duì)DEGs進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號(hào)通路分析和基因本體(gene ontology，GO)功能注釋分析，用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network，PPI)分析，其中節(jié)點(diǎn)大小、顏色深淺代表該基因權(quán)重的高低，節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深代表權(quán)重越高。

2 結(jié)果

2.1 低氧可誘導(dǎo)BV2細(xì)胞活化CD11b抗體用于鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞，IBA-1抗體用于鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。在BV2細(xì)胞中，常氧組和低氧組CD11b均染色陽(yáng)性，常氧組IBA-1染色陰性，低氧組IBA-1染色陽(yáng)性，如圖1所示，表明低氧處理可使BV2細(xì)胞活化。

藍(lán)色代表Hoechst33342染色的細(xì)胞核，紅色代表CD11b標(biāo)記的細(xì)胞，綠色代表IBA-1標(biāo)記的細(xì)胞，400×，n=3。

2.2 低氧對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響為了確定低氧處理BV2細(xì)胞后是否引起線粒體膜電位變化，使用羅丹明123染色并進(jìn)行流式分析，常氧組12 h和低氧組12 h、常氧組12 h和常氧組24 h線粒體膜電位相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；常氧組24 h和低氧組24 h、低氧組12 h和低氧組24 h線粒體膜電位相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

A為低氧12 h組與常氧12 h組、低氧24 h組與常氧24 h組的線粒體膜電位相對(duì)表達(dá)水平比較；B為常氧24 h組與常氧12 h組、低氧24 h組與低氧12 h組的線粒體膜電位相對(duì)表達(dá)水平比較；*P<0.05。

2.3 低氧處理12 h和24 h的差異基因表達(dá)分析BV2細(xì)胞分別在21% O2(體積分?jǐn)?shù))和1% O2(體積分?jǐn)?shù))條件下培養(yǎng)12 h和24 h，收集細(xì)胞樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，以|log2FC|≥1，Q≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行顯著DEGs篩選，1% O2(體積分?jǐn)?shù))處理BV2細(xì)胞12 h共篩選860個(gè)顯著DEGs，有672個(gè)上調(diào)基因，188個(gè)下調(diào)基因。1% O2(體積分?jǐn)?shù))處理BV2細(xì)胞24 h共篩選587個(gè)顯著DEGs，其中498個(gè)上調(diào)基因，89個(gè)下調(diào)基因。使用Venn圖比較兩組顯著DEGs，結(jié)果顯示12 h和24 h顯著DEGs中有410個(gè)基因相同，在369個(gè)共同上調(diào)基因中，低氧處理24 h與低氧處理12 h相比，表達(dá)增加的基因有109個(gè)，其余260個(gè)基因表達(dá)下降；在41個(gè)共同下調(diào)基因中，有9個(gè)基因表達(dá)增加，32個(gè)基因表達(dá)下降(圖3)。通過(guò)火山圖展示DEGs的分布(圖4)。通過(guò)聚類(lèi)熱圖分析顯著DEGs變化(圖5)。

藍(lán)色表示低氧處理12 h后顯著DEGs，黃色表示低氧處理24 h后顯著DEGs，交叉部分表示低氧處理12 h和24 h顯著DEGs中的相同基因。

A為12 h DEGs火山圖；B為24 h DEGs火山圖；紅色點(diǎn)代表顯著上調(diào)基因，綠色點(diǎn)代表顯著下調(diào)基因，灰色點(diǎn)代表差異不顯著的基因。

A為12 h DEGs聚類(lèi)熱圖；B為24 h DEGs聚類(lèi)熱圖；C為低氧處理12 h和24 h的410個(gè)DEGs聚類(lèi)熱圖；紅色代表表達(dá)上調(diào)基因，顏色越深，表達(dá)越高；綠色代表表達(dá)下調(diào)基因，顏色越深，表達(dá)越低。

2.4 低氧處理12 h和24 h DEGs的GO功能注釋分析對(duì)DEGs進(jìn)行GO生物進(jìn)程分析發(fā)現(xiàn)，低氧12 h組與常氧12 h組相比，低氧24 h組與常氧24 h組相比，上調(diào)DEGs均顯著富集在細(xì)胞對(duì)低氧的反應(yīng)、糖酵解過(guò)程、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)通路等方面，下調(diào)DEGs均顯著富集在細(xì)胞對(duì)DNA損傷刺激的反應(yīng)、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期等方面。常氧24 h組與常氧12 h組相比，上調(diào)DEGs未顯著富集到GO條目，下調(diào)DEGs顯著富集在抗壞血酸穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)遞質(zhì)攝取的負(fù)調(diào)控、5-羥色胺攝取的調(diào)控等方面。低氧24 h組與低氧12 h組相比，上調(diào)DEGs顯著富集在長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝過(guò)程、有機(jī)酸生物合成過(guò)程、異生物分解代謝過(guò)程等方面，下調(diào)DEGs顯著富集在調(diào)節(jié)生長(zhǎng)遞質(zhì)攝取、螯合鈣離子、神經(jīng)遞質(zhì)的再攝取等方面(圖6)。

A為低氧12 h組與常氧12 h組DEGs GO功能富集分析；B為低氧24 h組與常氧24 h組DEGs GO功能富集分析；C為常氧24 h組與常氧12 h組DEGs GO功能富集分析；D為低氧24 h組與低氧12 h組DEGs GO功能富集分析；柱狀圖高度代表GO的富集程度，柱狀圖越高代表Q值越小，富集程度越高。

2.5 低氧處理12 h和24 h DEGs的KEGG富集分析對(duì)低氧12 h組與常氧12 h組DEGs進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)DEGs顯著富集在HIF-1α信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路、糖酵解/糖異生、果糖和甘露糖代謝、淀粉和蔗糖代謝等代謝進(jìn)程，下調(diào)DEGs顯著富集在細(xì)胞周期、同源重組、DNA復(fù)制等進(jìn)程。對(duì)低氧24 h組與常氧24 h組DEGs進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)DEGs顯著富集在HIF-1α信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路糖酵解/糖異生、磷酸戊糖途徑、果糖和甘露糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、花生四烯酸等代謝進(jìn)程，下調(diào)DEGs顯著富集在細(xì)胞周期、同源重組、Fanconi貧血通路等進(jìn)程(圖7)。常氧24 h組與常氧12 h組、低氧24 h組與低氧12 h組因DEGs較少，富集的KEGG通路也較少。

A為低氧12 h組與常氧12 h組DEGs KEGG分析；B為低氧24 h組與常氧24 h組DEGs KEGG分析；橫線上方表示顯著上調(diào)基因富集的KEGG通路，橫線下方表示顯著下調(diào)基因富集的KEGG通路；柱狀圖代表KEGG富集程度，柱狀圖越高代表Q值越小，富集程度越高；折線圖代表KEGG通路對(duì)應(yīng)的靶基因數(shù)目，越高代表靶基因越多。

2.6 低氧處理12 h和24 h的410個(gè)相同顯著DEGs的基因PPI分析將410個(gè)相同顯著DEGs通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖8。本研究經(jīng)KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)低氧對(duì)BV2細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控與代謝相關(guān)通路關(guān)聯(lián)的可能性大，見(jiàn)圖9。

A為低氧處理12 h和24 h的410個(gè)相同顯著DEGs的PPI圖；B為富集程度排名前10的基因；節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，表示與其關(guān)聯(lián)靶基因數(shù)目越多。

A為代謝相關(guān)基因的PPI圖；B為富集程度排名前10的基因；菱形表示代謝通路，節(jié)點(diǎn)越大，表示包含的靶基因數(shù)目越多；圓形表示靶基因，節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，表示與其關(guān)聯(lián)靶基因數(shù)目越多，其中紅色表示上調(diào)基因，綠色表示下調(diào)基因。

2.7 低氧處理后與代謝相關(guān)基因的蛋白表達(dá)變化為了確定低氧處理后是否引起代謝相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生變化，需進(jìn)行蛋白水平驗(yàn)證。常氧24 h組與常氧12 h組、低氧24 h組與低氧12 h組相比，PGK1、PFKP、TPI1蛋白相對(duì)表達(dá)量變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低氧12 h組與常氧12 h組、低氧24 h組與常氧24 h組相比，PGK1、PFKP、TPI1蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖10。

A、B為蛋白表達(dá)電泳圖；C、D、E和F為蛋白表達(dá)柱狀圖；*P<0.05。

2.8 RT-qPCR驗(yàn)證DEGs低氧分別處理12 h和24 h后，經(jīng)過(guò)高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，分別篩選出12 h和24 h低氧組與常氧組的DEGs，經(jīng)過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)12 h和24 h有410個(gè)DEGs相同，通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件從中篩選出前10個(gè)關(guān)鍵基因?yàn)镚APDH、PGK1、PFKL、HK2、PFKP、ALDOA、TPI1、ALDOC、GPI1、PGM2。再?gòu)?10個(gè)相同的DEGs中篩選出56個(gè)與代謝相關(guān)的基因，并通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件篩選出前10個(gè)關(guān)鍵基因?yàn)镻FKL、TPI1、PFKP、PGK1、ALDOART1、HK2、GPI1、ALDOA、ALDOC、GAPDH，從2個(gè)基因集中篩選出的前10個(gè)關(guān)鍵基因有9個(gè)是相同的，對(duì)其中6個(gè)及VEGFA基因進(jìn)行RT-qPCR以驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，常氧24 h組與常氧12 h組、低氧24 h組與低氧12 h組相比，PFKP、PGK1、TPI1、PFKL、GPI1、ALDOC、VEGFA表達(dá)變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；低氧12 h組與常氧12 h組、低氧24 h組與常氧24 h組相比，PFKP、PGK1、TPI1、PFKL、GPI1、ALDOC、VEGFA表達(dá)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖11。此結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。

A為低氧12 h組與常氧12 h組DEGs的mRNA相對(duì)表達(dá)量；B為低氧24 h組與常氧24 h組DEGs的mRNA相對(duì)表達(dá)量；C為常氧24 h組與常氧12 h組DEGs的mRNA相對(duì)表達(dá)量；D為低氧24 h組與低氧12 h組DEGs的mRNA相對(duì)表達(dá)量；*P<0.05。

3 討論

低氧能夠誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，引起ROP或DR等視網(wǎng)膜疾病的神經(jīng)損傷和新生血管生成，造成不可逆的視力損害。目前治療這些疾病的方法主要有視網(wǎng)膜激光光凝、玻璃體腔注射抗VEGF藥和玻璃體切割手術(shù)等，這些方法雖然有一定療效，但并不能完全控制疾病病情[8-9]，因此需要尋找治療這些視網(wǎng)膜疾病的新靶點(diǎn)和新方法。本研究以小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2細(xì)胞建立體外低氧模型，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究低氧對(duì)BV2細(xì)胞的作用機(jī)制。

研究表明IBA-1可用于鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞的活化[10-11]。文獻(xiàn)報(bào)道低氧可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化[12]。本研究結(jié)果顯示，低氧處理可使BV2細(xì)胞IBA-1表達(dá)升高，證實(shí)了低氧可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化。文獻(xiàn)中多采用低氧誘導(dǎo)8 h、12 h和24 h進(jìn)行研究[3,13-14]，但本課題組發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)8 h顯著差異基因極少，因此，本研究采用低氧誘導(dǎo)12 h和24 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果顯示，低氧處理12 h顯著差異基因最多，并且表達(dá)量最高。因?yàn)樯飉RNA隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)活性下降，可能與自由基、酶活性相關(guān)[3,14]。研究表明，低氧可損傷線粒體功能，導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生、線粒體膜電位降低和代謝改變[15]。本研究結(jié)果示低氧處理后小膠質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電位下降。缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)在缺氧模型中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，HIF-1α能夠調(diào)節(jié)糖酵解酶，并增強(qiáng)O2及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，從而保護(hù)機(jī)體免受缺氧損傷[16]。缺氧可誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)上調(diào)，引起小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，進(jìn)而促進(jìn)腦缺血后的神經(jīng)元變性[14]。HIF-1α作為低氧反應(yīng)基因啟動(dòng)子中的低氧反應(yīng)元件，通過(guò)改善組織氧合、上調(diào)靶基因、調(diào)節(jié)代謝進(jìn)程從而適應(yīng)低氧環(huán)境。低氧誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞白細(xì)胞介素-17表達(dá)增加，通過(guò)上調(diào)VEGFA表達(dá)、促進(jìn)炎癥反應(yīng)而與視網(wǎng)膜新生血管性疾病緊密相關(guān)[17]。研究表明TGF-β信號(hào)可在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中有效激活VEGFA的表達(dá)，從而促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管的生成[18]。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)HIF-1、白細(xì)胞介素-17和TGF-β信號(hào)通路顯著富集，表明HIF-1、白細(xì)胞介素-17和TGF-β信號(hào)通路在低氧誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化中也發(fā)揮重要的作用。Rap1可調(diào)節(jié)各種細(xì)胞類(lèi)型中整合素和其他黏附分子的功能，在細(xì)胞遷移、細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的控制中發(fā)揮重要作用[19]。目前關(guān)于Rap1信號(hào)的研究主要集中其在免疫和造血系統(tǒng)及惡性腫瘤中的作用[20]。但低氧條件下Rap1信號(hào)在小膠質(zhì)細(xì)胞中的作用尚未報(bào)道，本研究結(jié)果示低氧能夠誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞Rap1信號(hào)通路激活。

研究表明ITGB3可在低氧時(shí)翻譯激活[21]。ITGB3還參與腫瘤血管生成、代謝重編程、干細(xì)胞維持、免疫調(diào)節(jié)等進(jìn)程[22]。本研究結(jié)果示低氧處理后ITGB3基因表達(dá)上調(diào)。ARG1主要參與氨基酸的代謝途徑，可通過(guò)抑制缺氧缺血誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)在視網(wǎng)膜損傷進(jìn)程中起到保護(hù)作用[23]。缺氧導(dǎo)致HIF-α表達(dá)增加，誘導(dǎo)SLC2A1的表達(dá)，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上以增加對(duì)缺氧神經(jīng)元進(jìn)行糖酵解的葡萄糖供應(yīng)[24]。這些基因主要與低氧引起的代謝紊亂有關(guān)。

研究表明，在高海拔地區(qū)，隨著O2水平的下降，ATP的產(chǎn)生從線粒體中氧依賴的氧化磷酸化過(guò)程轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞質(zhì)中氧不依賴的糖酵解過(guò)程[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧處理12 h與24 h有410個(gè)相同的DEGs，KEGG富集分析示這些基因主要與代謝通路相關(guān)。本研究結(jié)果顯示PFKL、TPI1、PFKP、PGK1、GPI1、ALDOC在低氧誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中顯著高表達(dá)。PFKP、PFKL、PGK1可通過(guò)調(diào)控糖酵解和代謝重編程過(guò)程參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[26-27]。研究表明，參與糖酵解的GPI1可能是Th17介導(dǎo)的自身免疫性疾病的良好藥物靶點(diǎn)[28]。缺氧動(dòng)物大腦和骨骼肌中糖酵解酶ALDOC的轉(zhuǎn)錄水平升高[29]。低氧處理后HIF-1α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活，上調(diào)下游靶基因VEGFA表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞代謝和血管生成[30]。本研究結(jié)果顯示低氧能夠誘導(dǎo)VEGFA表達(dá)增加。因此PFKL、TPI1、PFKP、PGK1、GPI1、ALDOC、VEGFA基因均在糖酵解過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中TPI1還參與糖異生生物進(jìn)程。本研究也發(fā)現(xiàn)PFKL、TPI1、PFKP、PGK1、GPI1、ALDOC主要與低氧誘導(dǎo)的代謝通路相關(guān)，可能是誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞代謝進(jìn)程紊亂的關(guān)鍵基因，能夠作為治療缺氧性視網(wǎng)膜疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

本研究的不足之處：缺血缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞模型不能完全模擬體內(nèi)缺氧情況，還需要進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證；只分析了低氧干預(yù)后顯著DEGs及信號(hào)通路的改變，但關(guān)鍵基因及信號(hào)通路的功能分析驗(yàn)證仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ITGB3、ARG1、SLC2A1基因可能為治療缺血缺氧性視網(wǎng)膜疾病的潛在靶點(diǎn)，HIF-1、白細(xì)胞介素-17、TGF-β、Rap1信號(hào)通路及代謝相關(guān)通路可能在缺血缺氧性視網(wǎng)膜疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，為治療缺血缺氧性視網(wǎng)膜疾病的新藥研究提供了新的分子機(jī)制，因此這些靶向通路和基因的表達(dá)有望為缺血缺氧性視網(wǎng)膜疾病帶來(lái)新的治療方法，為臨床轉(zhuǎn)化研究提供理論基礎(chǔ)。