向 征 石赟懿 譚 鋼

角膜感覺神經(jīng)的分布十分豐富，主要由三叉神經(jīng)的眼支經(jīng)睫狀神經(jīng)到達角膜，將感覺從眼表傳遞到大腦[1]。角膜神經(jīng)在維持眼表內(nèi)環(huán)境平衡方面起著至關(guān)重要的作用[2]。角膜神經(jīng)不僅通過精細的感覺機制來保護眼表，而且還通過各種神經(jīng)營養(yǎng)因子保護角膜上皮的完整性。神經(jīng)纖維的任何損傷都可能導(dǎo)致神經(jīng)營養(yǎng)性角膜疾病，包括神經(jīng)營養(yǎng)性角膜病[3]和眼神經(jīng)性疼痛[4]。目前,外用神經(jīng)生長因子(NGF)滴眼液對于治療神經(jīng)營養(yǎng)性疾病有著良好的療效，NGF滴眼液中包含的神經(jīng)營養(yǎng)因子在角膜神經(jīng)再生過程中發(fā)揮重要的作用[5]。在體內(nèi)，角膜上皮細胞和角膜神經(jīng)纖維生成的神經(jīng)營養(yǎng)因子影響著角膜神經(jīng)的存活以及再生[6]。因此，研究角膜神經(jīng)再生過程中神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達水平具有重要意義。

氣體信號分子一氧化氮(NO)是一種具有多種生物學(xué)功能的小信號分子，對機體的穩(wěn)態(tài)平衡起到了重要的作用[7]。NO在細胞中有兩大功能，調(diào)節(jié)和細胞毒性。在低濃度水平時，NO是一種發(fā)揮細胞保護作用的調(diào)節(jié)劑，而在高濃度水平時，它的作用以細胞毒性為主。作為一種神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，NO可以調(diào)節(jié)睡眠、食欲、體溫、神經(jīng)生長和基因表達[8]。NO在傷口愈合中的作用已被研究了數(shù)十年，并在細胞和動物模型中被證明能促進角膜上皮傷口愈合。低濃度的NO可以增加角膜上皮細胞的增殖和遷移能力，ERK和p38MAPK信號通路均參與了這一過程。此外，動物實驗顯示角膜堿燒傷后局部應(yīng)用NO可促進角膜創(chuàng)面愈合[9]。本研究探討NO對角膜神經(jīng)再生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物取30只成年清潔級雄性SD 大鼠(南華大學(xué)動物實驗中心)，體重(200±20)g，分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度設(shè)定為(24±2)℃，不限水源和飼料，人工控制照明，保持12 h晝夜更替。動物使用合格證號：SCXK(湘)2019-0014。本研究動物處理遵循《實驗動物管理條例》(2017修訂版)的規(guī)定。

1.1.2 細胞及主要試劑小鼠神經(jīng)母細胞瘤(Neuro-2a)細胞和MEM培養(yǎng)基購自中喬新舟生物科技有限公司,胎牛血清購自美國Gibco公司，CCK-8試劑盒購自德國Biotech公司，NGF、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)均購自美國Abcam公司，抗體βⅢ-微管蛋白購自美國CST公司，MAP2和SMI312抗體均購自北京Biolegend有限公司，NGF、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、GDNF、色素上皮源性因子(PEDF)、CNTF引物均購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)將Neuro-2a細胞加入含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中，放入75 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，置入37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)基每2 d更換1次，最后使用2.5 g·L-1胰蛋白酶進行消化處理。

1.2.2 CCK-8 檢測細胞活性收集對數(shù)生長期的Neuro-2a細胞，調(diào)整細胞密度并將細胞分布于96孔板中，每孔100 μL，約1×103個細胞。將細胞置于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細胞貼壁。在細胞貼壁之后加入亞硝酸鈉(NaNO2)處理細胞，濃度分別為0.00 μmol·L-1、0.01 μmol·L-1、0.10 μmol·L-1、10.00 μmol·L-1、100.00 μmol·L-1、1000.00 μmol·L-1、10 000.00 μmol·L-1，處理時間為6 h、24 h、48 h和72 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，孵育2 h后測定其在450 nm處的光密度并計算出細胞活性。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況將Neuro-2a細胞以每孔4×106個鋪于6孔板中，每孔用含NaNO2的培養(yǎng)基處理24 h，NaNO2濃度分別為0 μmol·L-1、10.00 μmol·L-1、1000.00 μmol·L-1。具體操作步驟如下：使用移液槍吸去各孔內(nèi)液體，PBS浸洗3次，加入適量的胰蛋白酶消化細胞，使細胞分離并吹散，隨后加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化后，將細胞混勻收集于離心管中 1000 r·min-1離心5 min；吸去上清棄掉，使用100 μL 1×結(jié)合緩沖液將1×105個細胞重懸之后用流式細胞術(shù)上機專用試管收集；每管加入5 μL Annexin V-FITC以及5 μL碘化丙啶工作液，混勻后置于室溫避光反應(yīng)10 min，上述操作在冰上完成，配置完成之后盡快使用流式細胞儀進行分析，細胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.4 免疫熒光染色βⅢ-微管蛋白是神經(jīng)元微管網(wǎng)絡(luò)的一個組成部分，是神經(jīng)元早期有絲分裂的標志物，與正在進行的神經(jīng)發(fā)生相關(guān)[10]。神經(jīng)元的細胞體和樹突可表達MAP2，其在神經(jīng)發(fā)生中起關(guān)鍵作用[11]。SMI312是一種泛軸突神經(jīng)絲標記物，可選擇性地對抗高度磷酸化的成熟軸突[12]。為了評估βⅢ-微管蛋白、MAP2和SMI312的表達，將Neuro-2a細胞接種于24孔板上，每組培養(yǎng)液中分別加入0 μmol·L-1、10.00 μmol·L-1、1000.00 μmol·L-1的NaNO2，培養(yǎng)3 d。洗滌細胞，用40 g·L-1多聚甲醛固定細胞，并用Triton X-100 滲透、洗滌后，用體積分數(shù)10%山羊血清封閉，然后加入βⅢ-微管蛋白、MAP2 和SMI312 一抗孵育過夜。洗滌后加二抗孵育1 h，最后使用DAPI染細胞核，在熒光顯微鏡下拍照。所有實驗重復(fù)3次，驗證可重復(fù)性。

1.2.5 大鼠角膜堿燒傷模型建立、分組、角膜上皮愈合率計算建模前3 d 大鼠角膜滴左氧氟沙星滴眼液，每天4次。將30只SD 大鼠隨機分組，10只作為NC組，其余20只大鼠按照4 mL·kg-1給予100 g·L-1水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，并給予鹽酸奧布卡因滴眼液滴眼行表面麻醉2次，將用1 mol·L-1NaOH浸潤過的實驗濾紙置于大鼠右眼角膜中央40 s，之后用生理鹽水沖洗結(jié)膜囊60 s，建立角膜堿燒傷模型，再隨機分為PBS組和NO組，每組10只。從堿燒傷當(dāng)天開始，PBS組給予PBS治療,NO組給予10.00 μmol·L-1NaNO2與PBS混合治療，每6 h滴1滴，持續(xù)1周。分別于堿燒傷后1 d、2 d、7 d拍攝右眼眼表照片。用熒光素鈉染色后觀察并記錄大鼠角膜上皮愈合情況，計算角膜上皮愈合率。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測大鼠角膜堿燒傷處理后7 d，進一步對收集的角膜上皮組織進行勻漿處理，對勻漿組織進行神經(jīng)營養(yǎng)因子檢測。角膜上皮神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF、BDNF、GDNF、PEDF、CNTF mRNA的相對表達量均以GAPDH基因作為內(nèi)參。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成。NGF正向引物序列為5’-TCATCCACCCACCCAGTCTTCC-3’，反向引物序列為5’-TCCGTGGCTGTGGTCTTATCTCC-3’；BDNF正向引物序列為5’-TGGAACTCGCAATGCCGAACTAC-3’，反向引物序列為5’-TCCTTATGAACCGCCAGCCAATTC-3’；GDNF正向引物序列為5’-CGCTGACCAGTGACTCCAATATGC-3’，反向引物序列為5’-AGTGCCGCCGCTTGTTTATCTG-3’；CNTF正向引物序列為5’-AGGTGACTTCCATCAGGCAATACATAC-3’，反向引物序列為5’-TGTTCCAGAAGCACCATTAACTCCTC’；PEDF正向引物序列為5’-CAATCCTGACATCCACAGCACCTAC-3’，反向引物序列為5’-ACACAATTCTGGAGGCACTCTTGAAG-3’。擴增條件：95 ℃預(yù)變性15 s，95 ℃變性15 s、57 ℃退火30 s、74 ℃延伸30 s，進行45個循環(huán)；隨后進行熔解曲線分析：95 ℃反應(yīng)15 s，60 ℃反應(yīng)30 s，95 ℃反應(yīng)15 s，最后置于4 ℃直至實驗結(jié)束。以GAPDH基因作為內(nèi)參，用相對定量方法2-△△Ct進行計算，計算各基因mRNA的相對表達量。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達水平采用Western blot檢測角膜組織中各蛋白的表達水平，在角膜組織中加入裂解液及蛋白酶抑制劑混合后低溫研磨并離心，取上清液，而后采用BCA法定量并配平，最后于95 ℃煮10 min完成蛋白提取。配制上層濃縮膠、下層分離膠電泳分離蛋白后進行轉(zhuǎn)膜；然后用50 g·L-1脫脂奶粉封閉2 h，加一抗稀釋液(1500)，在4 ℃冰箱孵育1晚；第2天用TBST洗膜15 min×3次后加二抗稀釋液(18000)，常溫孵育1 h并再用TBST漂洗3次后顯影。以ImageJ軟件處理圖像，將目的條帶與GAPDH內(nèi)參所得比值作為蛋白相對表達水平，依次檢測各組大鼠角膜組織中βⅢ-微管蛋白、NGF、GDNF、CNTF的蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用統(tǒng)計學(xué)軟件GraphPad Prism8進行實驗數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測NO對Neuro-2a細胞活性的影響該實驗設(shè)置了7個NaNO2濃度梯度和4個時間梯度，其中10.00 μmol·L-1NaNO2處理Neuro-2a細胞24 h后可顯著提高細胞活性；1000.00 μmol·L-1、10 000.00 μmol·L-1NaNO2處理Neuro-2a細胞6 h后對細胞活性無明顯影響，24 h后可顯著降低細胞活性。因此篩選出具有代表性的NaNO2濃度10.00 μmol·L-1、1000.00 μmol·L-1作為后續(xù)實驗中的處理濃度(表1)。

表1 不同濃度NaNO2和處理時間Neuro-2a細胞活性

2.2 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率使用濃度為0.00 μmol·L-1、10.00 μmol·L-1、1000.00 μmol·L-1的NaNO2處理Neuro-2a細胞24 h后，測得細胞凋亡率分別為18.60%、13.00%、19.48%；與0.00 μmol·L-1組相比，10.00 μmol·L-1組細胞凋亡率降低(P<0.01),當(dāng)NaNO2濃度升高至1000.00 μmol·L-1時細胞凋亡率回升至0.00 μmol·L-1時的水平(P>0.05)，甚至顯示出細胞毒性作用(圖1)。

圖1 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率

2.3 不同濃度NaNO2處理后Neuro-2a細胞神經(jīng)元標志物的免疫熒光染色情況使用0.00 μmol·L-1、10.00 μmol·L-1、1000.00 μmol·L-1的NaNO2處理Neuro-2a細胞3 d后，觀察βⅢ-微管蛋白(綠色)、MAP2(紅色)和SMI312(紅色)的免疫熒光染色結(jié)果顯示：與0.00 μmol·L-1組相比，10.00 μmol·L-1組βⅢ-微管蛋白、MAP2和SMI312三種神經(jīng)元標志物相對表達量均增加(均為P<0.05)，1000.00 μmol·L-1組三種神經(jīng)元標志物相對表達量均略有降低，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)(圖2)。

圖2 不同濃度NaNO2處理后Neuro-2a細胞βⅢ-微管蛋白(綠色)、MAP2(紅色)和SMI312(紅色)的免疫熒光染色結(jié)果和相對表達量 A:免疫熒光染色；B:相對表達量。兩組相比，*P<0.05,**P<0.01。B圖中橫坐標1、2、3分別表示0.00 μmol·L-1組、10.00 μmol·L-1組、1000.00 μmol·L-1組。

2.4 NO在角膜傷口愈合中的作用基于前述細胞實驗結(jié)果，NaNO2作用濃度為10.00 μmol·L-1時可顯著提高細胞活性，在動物實驗中采用該濃度局部治療堿燒傷后大鼠角膜，結(jié)果顯示：堿燒傷后1 d、3 d、7 d，與PBS組相比，NO組大鼠角膜上皮愈合率均升高(均為P<0.05)，同時堿燒傷所致的角膜混濁得到明顯改善，該結(jié)果進一步證實了NO對角膜損傷的修復(fù)作用(圖3)。

圖3 NO在角膜傷口愈合中的作用 A:各組大鼠角膜堿燒傷后不同時間點角膜上皮愈合情況；B:各組大鼠角膜堿燒傷后不同時間點角膜上皮愈合率。與PBS組相比**P<0.01,***P<0.001。D1、D3、D7分別表示堿燒傷后1 d、3 d、7 d。

2.5 各組大鼠角膜組織中神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA的表達在堿燒傷后7 d，采用實時熒光定量PCR檢測角膜上皮神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF、BDNF、GDNF、PEDF、CNTF mRNA的相對表達量，結(jié)果顯示：與PBS組相比，NO組大鼠角膜組織NGF、GDNF、CNTF mRNA的相對表達量均增高(均為P<0.05)(圖4)。

圖4 堿燒傷后7 d,各組大鼠角膜組織中神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA的表達 兩組相比，*P<0.05,**P<0.01。

2.6 各組大鼠角膜組織中βⅢ-微管蛋白、NGF、GDNF、CNTF的蛋白表達情況Western blot檢測結(jié)果顯示：堿燒傷后7 d,與NC組相比，PBS組和NO組大鼠角膜組織βⅢ-微管蛋白、NGF、GDNF、CNTF的蛋白表達水平均增高(均為P<0.05)。與PBS組相比，NO組大鼠角膜組織βⅢ-微管蛋白、NGF、GDNF、CNTF的蛋白表達水平均明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(圖5)。

圖5 各組大鼠角膜組織中βⅢ-微管蛋白、NGF、CNTF、GDNF的蛋白表達情況 A:Western blot檢測各組大鼠角膜組織中βⅢ-微管蛋白、NGF、CNTF、GDNF的蛋白表達情況；B:蛋白相對表達量，兩組相比，*P<0.05,**P<0.01。

3 討論

神經(jīng)營養(yǎng)因子是中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中對神經(jīng)元的生長以及成熟神經(jīng)元的維持起重要作用的調(diào)節(jié)因子。目前人們對角膜神經(jīng)受損后角膜神經(jīng)再生的機制還知之甚少，但神經(jīng)營養(yǎng)因子在角膜神經(jīng)再生過程中的積極作用已經(jīng)得到了證實。NGF、CNTF和GDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子能夠結(jié)合角膜上皮中的相關(guān)受體，激活相關(guān)的信號通路，進而在角膜上皮的損傷修復(fù)以及角膜神經(jīng)再生過程中發(fā)揮重要的作用[13]。研究發(fā)現(xiàn),人重組NGF可促進中至重度神經(jīng)營養(yǎng)性角膜疾病傷口的愈合[14]。因此，觀察角膜神經(jīng)再生過程中神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達水平是研究角膜神經(jīng)再生的重要指標之一。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，生理濃度的NO參與記憶的形成和腦血流量的調(diào)節(jié)，從而起到神經(jīng)保護的作用。高濃度的NO介導(dǎo)神經(jīng)毒性，導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病和中風(fēng)[15]。本次在細胞水平的實驗結(jié)果提示：低濃度的NO可提高Neuro-2a細胞的細胞活性以及神經(jīng)元標志物的表達，表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)營養(yǎng)作用，而高濃度的NO則對于Neuro-2a細胞產(chǎn)生了明顯的細胞毒性。我們推測，NO可能是通過內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)共同發(fā)揮作用。eNOS在腦血管內(nèi)皮細胞和運動神經(jīng)元中均含量豐富；在正常的生理過程中，eNOS生成的NO可調(diào)節(jié)血液循環(huán)，并在長期電位增強中充當(dāng)信使[16]。nNOS在不同類型的外周神經(jīng)細胞中均有表達，其在神經(jīng)細胞和雪旺細胞中的表達也已在體外得到證實。當(dāng)外周神經(jīng)受到壓力或損傷時，受損軸突周圍的雪旺細胞會表達nNOS[17]。因此，觀察eNOS和nNOS的共同作用對角膜神經(jīng)再生過程中神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的影響是本研究的關(guān)鍵。

基于前述細胞實驗結(jié)果，我們篩選出NaNO2的最佳神經(jīng)營養(yǎng)濃度為10.00 μmol·L-1，以此濃度外用治療大鼠角膜堿燒傷，結(jié)果顯示：NO對于角膜上皮損傷的修復(fù)有著顯著的促進作用。為了研究角膜損傷修復(fù)過程中神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的變化，在堿燒傷后7 d我們對收集的大鼠角膜組織進行了實時熒光定量PCR和Western blot檢測，結(jié)果表明：與PBS組相比，NO組大鼠角膜組織神經(jīng)元標志物βⅢ-微管蛋白表達水平以及NGF、GDNF、CNTF這3種神經(jīng)營養(yǎng)因子的mRNA和蛋白表達水平均增高。這說明在角膜上皮損傷修復(fù)的過程中，NO顯著促進了相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)因子的生成，表現(xiàn)出明顯的角膜神經(jīng)營養(yǎng)作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，氣體信號分子NO能促進神經(jīng)細胞的生長以及相關(guān)神經(jīng)元標志物的表達；在大鼠角膜堿燒傷模型中，局部應(yīng)用外源性NO進行治療，可對角膜上皮和角膜神經(jīng)產(chǎn)生明顯的營養(yǎng)作用。以上結(jié)果表明，NO很可能是治療角膜神經(jīng)病變的重要藥物成分之一。