程培雪，馬 迅，李 偉，劉劍楠，劉 平，王靜靜，陳田田，楊 旭，滕海森

(1. 上海理工大學(xué) 材料與化學(xué)學(xué)院，上海 200093；2. 上海交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，上海200011)

0 引 言

隨著種植技術(shù)的日趨成熟，種植修復(fù)已成為牙周疾病或外傷導(dǎo)致失牙的重要治療手段。因此，對(duì)口腔種植材料的需求也在增加。而鈦金屬作為種植體的首選材料，具有良好的生物相容性和機(jī)械性能，但由于鈦本身不具有抗菌性能，所以存在細(xì)菌感染發(fā)生率高等問(wèn)題[1]。因此，通過(guò)對(duì)鈦種植體表面改性處理，使其獲得良好的抗菌性能具有十分重要的意義。

為了使鈦植入體表面獲得良好的抗菌性能，表面改性技術(shù)特別是涂層技術(shù)成為一種有效的策略。多種多樣的涂層例如負(fù)載抗生素涂層[2]、抗粘附的涂層[3]、負(fù)載納米抗菌涂層[4]等迅速發(fā)展。然而，負(fù)載抗生素具有療效不穩(wěn)定、釋放速率難以控制、細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等問(wèn)題，而抗粘附涂層很難準(zhǔn)確地評(píng)估其在體內(nèi)臨床條件下的有效性，因此在很大程度上限制了其應(yīng)用[5]。相比之下,負(fù)載納米抗菌涂層如金屬系涂層的抗菌效果則更加穩(wěn)定[6]。

銅作為金屬系抗菌劑是人體所需的微量元素之一，而且價(jià)格低廉，適量的銅無(wú)細(xì)胞毒性，并且有一定的抗菌性能[7-9]，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域作為抗菌劑引起越來(lái)越多的關(guān)注。制備納米銅涂層的方法有很多，例如物理氣相沉積法(PVD)、化學(xué)氣相沉積法(CVD)、金屬有機(jī)化合物熱分解法、液相化學(xué)還原法、水熱法等。其中磁控濺射作為物理氣相沉積法具有所需設(shè)備少、成膜速率高且均勻性好，涂層與基體之間具有較強(qiáng)的結(jié)合力等優(yōu)點(diǎn)[10]，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛。

近年來(lái)銅抗菌材料的研究也受到了越來(lái)越多的關(guān)注。Liu等[11]針對(duì)純Ti與Ti-Cu合金種植體做了對(duì)比，結(jié)果表明Ti-Cu合金對(duì)變形鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌的抗菌效果更佳，并做了細(xì)胞的增殖和粘附實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Ti-Cu合金的生物相容性與純Ti類似。李慕勤等[12]在環(huán)境溫度為50 ℃的情況下，在試樣表面鍍銅3 min，通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)試發(fā)現(xiàn)銅涂層的抗菌率達(dá)到98.3%，抗菌效果非常明顯。Heidenau等[13]基于凝膠-溶膠法在Ti合金表面制備了Cu-TiO2涂層，抑制了表皮葡萄球菌在鈦合金表面的增殖，且對(duì)大鼠結(jié)締組織成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響。韋春貝等[14]利用雙靶磁控濺射在不銹鋼表面制備了TiN/Cu-Zn涂層，并研究了多層結(jié)構(gòu)對(duì)膜層耐腐蝕性能和抗菌性能的影響。結(jié)果表明，Cu-Zn層比較薄時(shí)，膜層的耐腐蝕性能比較好，抗菌性能對(duì)TiN層厚度較為敏感；隨著Cu-Zn層厚度的增加耐腐蝕性能顯著下降，而當(dāng)Cu-Zn層較厚時(shí)，抗菌性能對(duì)TiN層厚度不敏感，均具有良好的抗菌性能

Cu是動(dòng)物和高等植物中必不可少的微量元素且具有良好的抗菌活性，然而，銅過(guò)量時(shí)又具有較高的毒性，影響正常細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，本文采用磁控濺射法在純Ti表面制備不同納米Cu含量的Ti-Cu復(fù)合涂層，研究納米Cu含量對(duì)Ti-Cu復(fù)合涂層表面形貌、粗糙度、疏水性、細(xì)胞毒性和抗菌性能的影響，在符合生物安全材料標(biāo)準(zhǔn)的情況下提高鈦種植體的抗菌性能。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 樣品制備與分組

本文利用磁控濺射儀(JGP-450，沈陽(yáng)科學(xué)儀器有限公司)在純Ti基體上制備Ti-Ag納米復(fù)合涂層。選用直徑50 mm，厚度3 mm，純度99.99%的Ti靶和Cu靶，并切成6塊，然后將不同塊的Ti靶和Cu靶拼接成一個(gè)整體，使用該方法拼接成具有不同面積比的Ti-Cu復(fù)合靶，Cu∶Ti的比例分別為1∶99、2∶98、3∶97、4∶96和5∶95，如圖1以5∶95為例。基體為純Ti片，直徑10 mm，厚度1 mm，用800#、1000#、1200#、1500#、2000#的耐水砂紙對(duì)Ti片進(jìn)行拋光打磨至鏡面，在超聲震蕩機(jī)內(nèi)利用丙酮、無(wú)水乙醇以及去離子水進(jìn)行超聲清洗各20 min，然后自然晾干。

利用磁控濺射儀濺射之前，需對(duì)磁控濺射儀抽真空，直至真空度低于5×10-4Pa，通入Ar，設(shè)置壓強(qiáng)，啟輝，預(yù)濺射15 min左右，除去靶材表面殘留的雜質(zhì)。在濺射功率為40 W，濺射氣壓為0.8 Pa，氬氣流量為30 mL/min下濺射1.5 min，制備不同Cu含量的Ti-Cu納米復(fù)合涂層，實(shí)驗(yàn)流程圖如圖2。根據(jù)復(fù)合靶中Ti和Cu面積比的不同將涂層組分為Cu-1組、Cu-2組、Cu-3組、Cu-4組、Cu-5組。

圖2 實(shí)驗(yàn)流程圖Fig.2 Experimental flow chart

1.2 樣品表征

使用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM，Quanta FEG450，F(xiàn)EI公司)觀察樣品的表面形貌；X射線衍射儀(XRD，D8 Advance，Bruker公司)分析樣品物相，測(cè)量范圍30～80°；采用原子力顯微鏡(AFM，Dimension Icon，Bruker公司)觀察各組樣品的三維形貌同時(shí)進(jìn)行粗糙度的測(cè)量；使用界面張力測(cè)量?jī)x(JC2000C1，上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司)進(jìn)行水接觸角的測(cè)量，用量角法測(cè)量樣品不同位置的水接觸角，每組分別測(cè)量5組平行數(shù)據(jù)，最后計(jì)算出每組數(shù)據(jù)的平均值，所有測(cè)試均在室溫下進(jìn)行。

1.3 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

按照MEM培養(yǎng)基：馬血清為9∶1的比例配制細(xì)胞完全培養(yǎng)基，所有樣品均為固體，每組樣品均用含量為75%的酒精棉球進(jìn)行擦拭，然后用無(wú)菌去離子水對(duì)樣品進(jìn)行3次沖洗，最后將樣品放置于37 ℃保溫箱內(nèi)進(jìn)行烘干。將各組樣品放入無(wú)菌平皿內(nèi)并做好標(biāo)記，轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)(SW-CJ-2FD，上海篤特科學(xué)儀器有限公司)內(nèi)，通過(guò)紫外線照射對(duì)樣品進(jìn)行2 h的殺菌，然后把樣品放到新的無(wú)菌離心管內(nèi)，同時(shí)做好標(biāo)記。按照10 mL∶1 cm2的比例加入完全培養(yǎng)基，放入37 ℃ CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(WIGGENSWCI-180，北京桑翌實(shí)驗(yàn)儀器研究所)72 h，制備成浸提液。此為母液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠成纖維細(xì)胞(L929，上海賽百慷生物)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，按照6×103/孔的比例在96孔板中進(jìn)行接種?？偣卜譃?個(gè)組別，依次為：空白對(duì)照組(純高糖培養(yǎng)基)、陽(yáng)性對(duì)照組(苯酚)、陰性對(duì)照組(聚乙烯)、Ti組、Cu-1組、Cu-2組、Cu-3組、Cu-4組、Cu-5組。在5%CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，培養(yǎng)24 h后丟棄上清液，按照100 mL/孔加入浸提液，在24 h、48 h、72 h后停止細(xì)胞的培養(yǎng)，避光條件下，每孔各加入10 mL CCK-8試劑(Invigentech，貨號(hào)：IV08-100)，并于5%CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。通過(guò)酶標(biāo)儀(TECAN，型號(hào)：SPARK 10M)檢測(cè)細(xì)胞在450 nm處的吸光度值OD。根據(jù)式(1)計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力(relative growth rate，RGR)，根據(jù)表1判斷樣品的毒性等級(jí)和安全標(biāo)準(zhǔn)。

(1)

表1 細(xì)胞RGR判斷其毒性等級(jí)與安全標(biāo)準(zhǔn)

1.4 外抗菌實(shí)驗(yàn)

該實(shí)驗(yàn)采用的細(xì)菌為具核梭桿菌，采用腦心浸液肉湯(BHI)瓊脂平板培養(yǎng)，然后在標(biāo)準(zhǔn)厭氧條件下(80%N2、10%H2、10%CO2，37 ℃)培養(yǎng)24 h，傳代、稀釋培育后，選取濃度值為106CFU/ml菌液，備用。將前述制備的樣品用75%的酒精棉球擦拭，然后用去離子水沖洗試件3遍，37 ℃保溫箱內(nèi)烘干。將各組樣品經(jīng)紫外線照射殺菌2 h后，轉(zhuǎn)移到新的無(wú)菌平皿內(nèi)并標(biāo)記。將滅菌后的樣品與具核梭桿菌共培養(yǎng)24 h后，置于1 mLPBS中，輕振使樣品上粘附的細(xì)菌脫落，然后將菌液稀釋105倍，接種于新的BHI瓊脂培養(yǎng)基中并做好標(biāo)記，將標(biāo)記好的培養(yǎng)基放置于厭氧箱中，然后抽真空，充入CO2混合氣，37 ℃恒溫孵箱內(nèi)厭氧培養(yǎng)48 h后，對(duì)具核梭桿菌進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)，通過(guò)計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算各樣品抗菌率。

(2)

式中：R為抗菌率，%；A為實(shí)驗(yàn)組樣品平均回收菌落數(shù)，cfu/片；B為純Ti對(duì)照組樣品平均回收菌落數(shù)，cfu/片。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同Cu含量對(duì)Ti-Cu納米復(fù)合涂層微觀形貌的影響

不同Cu含量的Ti-Cu納米復(fù)合涂層的SEM圖如圖3，由圖3可見(jiàn)，Ti片表面比較光滑，而涂層組樣品表面分布有納米級(jí)顆粒。隨著Cu含量的增加，Ti片表面顆粒也越來(lái)越多。圖4為各涂層組樣品的XRD圖，從圖中可知沒(méi)有Cu相產(chǎn)生，說(shuō)明Ti-Cu納米復(fù)合涂層中Cu含量過(guò)少，且Cu的尺寸為納米級(jí)別的，顯示不出來(lái)。在衍射角2θ為76.1°附近出現(xiàn)了Ti的衍射峰。根據(jù)圖4與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)照結(jié)果，可以得知為Ti(112)晶面。

圖3 不同納米Cu含量涂層的SEM圖(a)Ti、(b)Cu-1、(c)Cu-2、(d)Cu-3、(e)Cu-4、(f)Cu-5Fig.3 SEM images of coatings with different nano Cu content: (a)Ti, (b)Cu-1, (c)Cu-2, (d)Cu-3, (e)Cu-4, (f)Cu-5

圖4 不同納米Cu含量涂層的XRD圖譜Fig.4 XRD patterns of coatings with different nano Cu content

2.2 不同Cu含量對(duì)Ti-Cu納米復(fù)合涂層粗糙度的影響

圖5和圖6分別為AFM分析的三維形貌和表面粗糙度。如圖5所示，Ti組和涂層組的三維形貌有很大差別。Ti對(duì)照組表面如圖5(a)比較光滑，無(wú)顆粒狀結(jié)構(gòu)。而涂層組表面被均勻分布的Ti/Cu顆粒所覆蓋。由圖6可知，純Ti表面粗糙度Ra為1.12±0.18 nm，涂層組表面粗糙度Ra相對(duì)于純Ti對(duì)照組有明顯地增加，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。并且隨著Ti-Cu涂層中納米Cu含量的增加，涂層組的粗糙度也按照Cu-1、Cu-2、Cu-3、Cu-4、Cu-5的順序依次在增加，粗糙度值分別為5.16±0.40 nm、8.45±0.90 nm、10.45±0.70 nm、13.70±0.80 nm、16.1±s0.75 nm，其中Cu-5組粗糙度最大。

圖5 樣品表面AFM形貌：(a)Ti, (b)Cu-1, (c)Cu-2, (d)Cu-3, (e)Cu-4, (f)Cu-5Fig.5 AFM morphology of sample surface: (a)Ti, (b)Cu-1, (c)Cu-2, (d)Cu-3, (e)Cu-4, (f)Cu-5

材料表面粗糙度是影響微生物粘附的一個(gè)主要因素[15]。粗糙的種植體表面有利于細(xì)菌粘附，而光滑的表面可以減少細(xì)菌粘附[16-18]。然而，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，表面粗糙度與細(xì)菌粘附[19]的數(shù)量并不是正相關(guān)的。Bollen等[20]研究了粗糙度與細(xì)菌粘附的關(guān)系，結(jié)果表明，Ra>0.2 μm時(shí)，表面粗糙度的增加可以促進(jìn)細(xì)菌粘附，而Ra<0.2 μm時(shí)，細(xì)菌的粘附不隨粗糙度的變化而變化。本實(shí)驗(yàn)中原子力顯微鏡(AFM)分析結(jié)果表明，涂層組表面的粗糙度雖然都有所提高，但所有樣品的表面粗糙度均保持在0.2 μm以下，所以，本實(shí)驗(yàn)中各組樣品的表面粗糙度對(duì)細(xì)菌粘附的影響不大。

圖6 不同納米Cu含量涂層的粗糙度Fig.6 Roughness of coatings with different Cu content

2.3 不同Cu含量對(duì)Ti-Cu納米復(fù)合涂層疏水性的影響

圖7為各樣品的水接觸角。一般認(rèn)為，水接觸角小于90°時(shí)該表面具有親水性，表面自由能高；水接觸角大于90°時(shí)該表面具有疏水性，表面自由能低[21-22]，植入材料的疏水性對(duì)細(xì)菌的粘附以及生物膜的形成都有一定的影響，尤其影響細(xì)菌在其表面的初始粘附。通常親水性的表面比疏水性表面更有利于細(xì)菌粘附和增殖[23]。本實(shí)驗(yàn)中，由圖7可知，對(duì)照組純Ti的水接觸角為80.67°±0.82°，與對(duì)照組相比，各鍍Ti-Cu納米復(fù)合涂層組樣品表面的水接觸角均增大，且差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。隨著納米Cu含量的增加，水接觸角增加，Cu-1、Cu-2、Cu-3、Cu-4、Cu-5組涂層的水接觸角分別為95.58±0.92°、98.17±0.62°、100.33±0.51°、103.17±0.85°、107.42±1.23°。

圖7 不同納米Cu含量涂層的水接觸角Fig.7 Water contact angle of coating with different Cu content

2.4 不同Cu含量對(duì)Ti-Cu納米復(fù)合涂層細(xì)胞毒性的影響

圖8和表2分別是細(xì)胞吸光度值OD、RGR及細(xì)胞毒性等級(jí)結(jié)果。由圖8可知，在24，48，72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，納米Cu涂層組、Ti組、陰性對(duì)照組的OD值與空白對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，對(duì)比陽(yáng)性對(duì)照組在所有時(shí)間點(diǎn)與其他實(shí)驗(yàn)組的OD值，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 各組L929細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間的RGR與細(xì)胞毒性等級(jí)

大量的研究表明，納米Cu具有細(xì)胞毒性和遺傳毒性。納米Cu的細(xì)胞毒性受到多種因素的影響，例如納米Cu的大小，形狀，濃度等。通常納米Cu的濃度越高，其細(xì)胞毒性越大，甚至可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK-8法檢測(cè)各組樣品的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明，陰性對(duì)照組、Ti組和各納米Cu涂層組細(xì)胞相對(duì)活力均大于90%，毒性等級(jí)為Ⅰ級(jí)，未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，符合生物安全材料的標(biāo)準(zhǔn)。這是由于涂層組樣品有較少的Cu，從而未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗菌結(jié)果表明，通過(guò)磁控濺射技術(shù)在純鈦表面沉積的Ti-Cu納米復(fù)合涂層具有明顯的抗菌作用，并且Cu含量越高，涂層的抗菌效果也越好。雖然人們對(duì)Cu的抗菌機(jī)制已經(jīng)有長(zhǎng)期的研究，但是關(guān)于其抗菌機(jī)制也沒(méi)有統(tǒng)一定論，目前大家公認(rèn)的主要有以下兩種理論：

2.5 不同Cu含量對(duì)Ti-Cu納米復(fù)合涂層抗菌性能的影響

圖9為個(gè)樣品表面細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果，如圖9所示，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的培養(yǎng)，樣品表面的菌落在瓊脂平板上生長(zhǎng)。結(jié)果表明，細(xì)菌在Ti組樣品表面存活良好，稀釋后涂覆到平板中在培養(yǎng)基表面大量繁殖，培養(yǎng)基的表面出現(xiàn)大量菌落，表明Ti組表面沒(méi)有殺菌作用。對(duì)應(yīng)載Cu涂層組的培養(yǎng)基中菌落明顯減少。樣品的抗菌率見(jiàn)表3，以對(duì)照組Ti組的細(xì)菌存活率100%為標(biāo)準(zhǔn)，Cu-1、Cu-2、Cu-3、Cu-4、Cu-5組樣品表面的抗菌率分別為83%、85%、 89%、93%和95%，表明Cu元素的加入使材料獲得抗菌性能，且對(duì)具核梭桿菌具有較強(qiáng)的抗菌作用，隨著納米Cu含量的增高，抗菌效果也越好，Cu-5組抗菌率最高，達(dá)到95%。

圖9 各樣品表面細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果 (a)Ti、(b)Cu-1、(c)Cu-2、(d)Cu-3、(e)Cu-4、(f)Cu-5Fig.9 Counting results of bacterial culture on the surface of each sample: (a)Ti, (b)Cu-1, (c)Cu-2, (d)Cu-3, (e)Cu-4, (f)Cu-5

表3 具核梭桿菌菌落計(jì)數(shù)(±s，n=3)及抗菌率(%)Table 3 Colony count and antibacterial rate of Fusobacterium nucleate

(1)銅離子釋放殺菌

銅離子表面帶正電荷，對(duì)于細(xì)菌而言，細(xì)胞膜表面帶負(fù)電荷。當(dāng)受到靜電引力作用時(shí)，銅離子很容易吸附在細(xì)菌細(xì)胞膜上，且一步步透過(guò)細(xì)胞壁穿入細(xì)菌內(nèi)部，和相關(guān)的酶、蛋白質(zhì)等產(chǎn)生一定的化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到破壞核酸和DNA合成的目的。通過(guò)以上過(guò)程銅離子可以干擾細(xì)菌的正常功能，影響其內(nèi)部pH值，使其無(wú)法正常分裂繁殖，也即達(dá)到了消滅細(xì)菌或抑制細(xì)菌增殖的目的[24-25]。

(2)接觸殺菌

有研究發(fā)現(xiàn)，含銅涂層中未析出的銅離子也會(huì)有一定的抑菌效果[26]。當(dāng)細(xì)菌與材料表面的銅涂層接觸時(shí)，涂層中含的銅離子和細(xì)菌表面發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)菌的細(xì)胞膜破損，進(jìn)而造成細(xì)菌停止呼吸，細(xì)菌活性喪失，進(jìn)而完成殺菌或抑菌[27-28]。也有研究表明，接觸式的殺菌與細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)部的不飽和脂肪酸的ROS催化反應(yīng)有關(guān)，ROS可以干擾細(xì)菌生存所必需的一些基本成分活性，導(dǎo)致細(xì)菌死亡[29]。

3 結(jié) 論

基于磁控濺射技術(shù)，在純Ti表面鍍Ti-Cu納米復(fù)合涂層，對(duì)其微觀結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進(jìn)行了表征，并通過(guò)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和抗菌實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品的生物相容性和抗菌性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究得出以下結(jié)論:

(1)利用磁控濺射技術(shù)，在純Ti表面成功沉積Ti-Cu納米復(fù)合涂層，并且隨著涂層中納米Cu含量的增加，涂層表面粗糙度和水接觸角均依次增大，Cu-5組的粗糙度和水接觸角均最大，分別為(16.10±0.75)nm和107.41°±1.23°。

(2) CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞毒性結(jié)果表明，Ti-Cu納米復(fù)合涂層改性的純Ti未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，各組材料的毒性等級(jí)均為I級(jí)，符合物安全性材料的標(biāo)準(zhǔn)。

(3) 體外抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ti-Cu納米復(fù)合涂層改性的Ti植入材料對(duì)具核梭桿菌抗菌率均達(dá)到80%以上，有較強(qiáng)的抗菌作用，并且隨著納米Cu含量的增加，涂層的抗菌性也越好，Cu-5組抗菌性最好，抗菌率高達(dá)95%。