孟慶余 李春華 馬靈杰 高永靜

（南通大學疼痛醫(yī)學研究院，特種醫(yī)學研究院，南通 226019）

疼痛是一種與實際或潛在的組織損傷相關(guān)的不愉快的感覺和情緒情感體驗，或與此相似的經(jīng)歷[1]。慢性疼痛是指持續(xù)或反復發(fā)作3 個月以上的疼痛[2]，包括炎性疼痛、神經(jīng)病理性疼痛、癌性疼痛等[3]，影響了全球30%以上的成年人。慢性疼痛可導致病人行動不便、日?；顒邮芟蕖⑸钯|(zhì)量降低等，造成極大的個人和社會負擔。目前對慢性疼痛的藥物治療主要包括非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥 (NSAIDs)、阿片類藥物、5-羥色胺再攝取抑制劑、三環(huán)類抗抑郁藥物等。這些藥物一方面會帶來毒副作用和不良反應(yīng)，另一方面，部分藥物（如阿片類藥物）會引起耐受和依賴。盡管如此，通過上述治療也并不能有效地緩解慢性疼痛，因此亟須尋找更有效的治療方法和藥物靶點。

慢性疼痛伴隨外周和中樞中多種基因表達的變化，表觀遺傳學（包括DNA 甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑等）是調(diào)節(jié)基因表達和慢性疼痛的重要因素[4]。DNA 異常甲基化及其對基因表達的影響參與多種疾病過程，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病等[5]。10-11 易位蛋白(ten-eleven translocation, TET) 是生物體內(nèi)存在的一種α-酮戊二酸 (α-KG) 和Fe2+依賴的雙加氧酶[6]。其家族成員包括TET1、TET2 和TET3，是DNA 去甲基化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，均可催化5-甲基胞嘧啶 (5mC) 轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶 (5hmC)，進而啟動 DNA 去甲基化過程[7]。其中TET2 具有“管家”作用，是正常造血的重要調(diào)節(jié)因子，與急性髓細胞白血病、骨髓增生異常綜合征和其他髓系疾病有關(guān)[8]。TET2參與的表觀遺傳調(diào)控是調(diào)節(jié)炎癥的關(guān)鍵因素，參與免疫反應(yīng)和炎癥的發(fā)生與消退過程[9]。此外，TET2 還參與動脈粥樣硬化[10]、I 型糖尿病等疾病過程[11]。

近年來研究表明，TET1 和TET3 在脊髓中參與調(diào)控炎性疼痛[12]；脊髓中的TET1 還參與調(diào)節(jié)慢性內(nèi)臟性疼痛[13]；另外，背根神經(jīng)節(jié) (dorsal root ganglion, DRG) 中的TET1參與神經(jīng)病理性疼痛[14]。因此，盡管TET 家族在疼痛中的作用已有報道，但主要集中在TET1 和TET3，且主要在脊髓和DRG水平。TET2 蛋白與炎癥密切相關(guān)，如TET2 缺陷型巨噬細胞表現(xiàn)出 NLRP3 炎性小體介導的IL-1β 分泌增加，因此TET2 促進炎癥消退[15]；艾滋病毒輔助蛋白通過促進TET2 降解，增加促炎細胞因子IL-6的過度表達而阻礙炎癥消退并加速疾病的進展[16]。TET2在外周組織炎癥和炎性疼痛中起怎樣的作用，在外周是否參與炎癥調(diào)節(jié)進而影響疼痛？上述問題尚未見報道。本研究主要圍繞小鼠足底皮膚中的TET2 在炎性疼痛中的作用進行研究，研究結(jié)果將為開發(fā)新的鎮(zhèn)痛藥物提供思路。

方 法

1.實驗動物

雄性C57BL/6 野生型小鼠30 只，Tet2-/-小鼠30 只，6～8 周齡，體重20～28 g，由南通大學動物實驗中心提供；Tet2基因全敲除小鼠B6(Cg)-Tet2tm1.2Rao/J(Tet2-/-)從美國Jackson Laboratory 購買。所有小鼠的飼養(yǎng)條件遵循實驗動物標準。小鼠均在每12 h 明/暗循環(huán)、溫度20～22℃和濕度50%±5%的標準條件下飼養(yǎng)，自由攝取水和食物。

2.主要儀器和試劑

儀器：vonFrey Filament（Stoeling 公司）、Model 390 足熱痛覺測試儀（IITC Life Science 公司）、肢體腫脹測量儀（Ugo Basile 公司）、冰凍切片機（Thermo公司）、石蠟切片機（Leica 公司）、黏附性載玻片（Thermo Scientific 公司）、正置熒光顯微鏡（Leica公司）。

試劑：福爾馬林(Formalin)溶液（Sigma 公司）、完全弗氏佐劑(complete Freund's Adjuvant, CFA)（Sigma 公司）、異氟烷（瑞沃德公司）、多聚甲醛（Sigma-Aldrich 公司）、蘇木素伊紅染色試劑盒（碧云天公司）、兔抗TUJ1（CST 公司）、Cy3-驢抗兔IgG（Jackson 公司）、DAPI 染色試劑（Abcam 公司）。

3.方法

（1）模型制備：將小鼠分為對照組和實驗組，每組6 只。正常小鼠清醒狀態(tài)下，實驗組小鼠足底皮下注射0.5%和5% Formalin 10 μl，對照組小鼠注射生理鹽水，建立急性炎性疼痛模型，檢測小鼠注射前和注射后第一時相(0～10 min)與第二時相(10～45 min)產(chǎn)生的自發(fā)性疼痛行為；足底皮下注射50% CFA 15 μl 建立慢性炎性疼痛模型，檢測注射后6 h、1 天、3 天、7 天、10 天和14 天的熱痛覺過敏及機械性觸誘發(fā)痛；并用鼠足體積測量儀評估小鼠后足的體積。

（2）行為學檢測：將小鼠置于溫度20±2℃，相對濕度50%～60%，晝夜各12 h 環(huán)境條件下適應(yīng)48 ～72 h，行為學均采用盲法檢測。

福爾馬林誘導的自發(fā)痛行為：正常小鼠清醒狀態(tài)下，足底皮下注射0.5% 和5% Formalin 10 μl，置于透明鼠籠中，錄像50 min。之后回放，用秒表記錄每5 min 內(nèi)小鼠舔足和抬足的時間。將結(jié)果匯總并分為兩個階段：第一時相(0～10 min)和第二時相(10～45 min)。

熱痛覺過敏測試：小鼠放于專用的透明有機玻璃格并置于熱痛儀恒溫玻璃板上，玻璃板溫度設(shè)置為30℃，調(diào)節(jié)照射強度將基礎(chǔ)縮足潛伏期控制在8～14 s 之間，將20 s 設(shè)置為光照最長時間。在小鼠安靜清醒的狀態(tài)下，將光照點對準小鼠左后足中心位置，按下光照開始按鈕，待小鼠出現(xiàn)縮足、舔足現(xiàn)象時立刻按下按鈕停止光照，記錄所得相應(yīng)時間即為該小鼠本次熱縮足反射潛伏期 (thermal withdrawal latency, TWL)。每只小鼠需重復測量3 次，以3 次的平均值作為該時間點的 TWL?？s足潛伏期越短說明該小鼠熱痛覺過敏越嚴重。

機械性觸誘發(fā)痛測試：將小鼠置于金屬網(wǎng)架上的有機玻璃格內(nèi)適應(yīng)30～60 min，待其安靜后用vonFrey Filament 纖維絲刺激小鼠左后足底后緣皮膚，觀察小鼠縮足、舔足反應(yīng)。纖維絲豎直刺激小鼠足底，以纖維絲稍彎曲作為用力標準，刺激時間為2 s，在不同部位共刺激5 次。在多次刺激中，若小鼠出現(xiàn)縮足、舔足現(xiàn)象則視為疼痛，根據(jù)“Dixon's up-down”檢測法測量和計算機械刺激縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)。

（3）組織免疫熒光染色：異氟烷麻醉小鼠，0.9% 氯化鈉溶液(20 ml)經(jīng)心內(nèi)灌注至小鼠血液完全排出，再換用4% 多聚甲醛 (PFA) 灌流50 ml。取小鼠足底皮膚用4% PFA 進行后固定4～6 h，再依次用20% 和30% 蔗糖溶液過夜脫水至組織沉底。使用Thermo 冰凍切片機進行冰凍切片。修剪組織，用OCT 包埋，連續(xù)切片，皮膚切片厚度為14 μm，使用粘附載玻片貼片，晾干后染色。染色：用0.01 M 磷酸緩沖鹽溶液(PBS) 漂洗切片3 次，每次15 min；1% BSA 封閉液，室溫封閉1 h；加入一抗4℃過夜孵育；次日拿出組織，0.01 M PBS 漂洗切片3 次，每次15 min；用0.01 M PBS 稀釋免疫組化用熒光二抗，室溫避光孵育2 h；棄去二抗，用0.01 M PBS 漂洗3 次，每次15 min；晾干后用防淬滅熒光封片劑避光封片，于顯微鏡下拍片。

（4）蘇木素伊紅 (HE) 染色：灌注方法同（3），取足底皮膚用4% PFA 后固定過夜。依次用梯度濃度乙醇對組織進行脫水處理，分別為30%×30 min；50%×30 min；75%×30 min；80%×30 min；95%×60 min；95%×30 min；100%×5 min；100%×5 min；二甲苯透明5 min×2 次，完全浸蠟1 h，進行石蠟包埋，石蠟切片（厚5 μm），37℃攤片，45℃烤片，以防脫片。HE 染色：二甲苯脫蠟5 min×2 次，用梯度濃度乙醇進行脫二甲苯處理，分別為100%×2 min；95%×2 min；80%×2 min；75%×2 min，再用流水沖洗30 s。蘇木素染色8 min，流水沖洗30 s，1%鹽酸乙醇處理2～3 s，流水沖洗30 s；熱水加速藍化，流水沖洗數(shù)分鐘至顏色不再加深即可。伊紅染色45 s，流水沖洗適當長時間，用梯度濃度乙醇進行脫水處理，分別為75%×2 min；95%×2 min；100%×2 min；二甲苯脫乙醇處理，2 min×2 次。中性樹膠封片劑封片，通風櫥晾干，正置熒光顯微鏡拍片。

（5）蛋白芯片檢測：正常小鼠清醒狀態(tài)下，對WT 及Tet2-/-小鼠均進行足底皮下注射50% CFA 15 μl，7 天后灌注取小鼠足底皮膚，由Bio-Rad 公司進行蛋白芯片檢測。

4. 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用GraphPad Prism (version 8.01)，均采用均數(shù) ± 標準誤(±SEM)表示。主要采用Student'st-test 檢驗，雙因素方差分析 (Two-way ANOVA followed by the Bonferroni test)。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1. Tet2-/- 小鼠的鑒定以及WT 和Tet2 小鼠足底TUJ1 與DAPI 的表達與分布

取小鼠耳部全基因組DNA，經(jīng)普通PCR 擴增區(qū)分Tet2-/-小鼠與WT 小鼠。DNA 凝膠電泳顯示，WT 小鼠對應(yīng)的條帶大小為536 bp，雜合型(Tet2+/-)小鼠對應(yīng)的條帶大小為536/ 200 bp，Tet2-/-小鼠對應(yīng)的條帶大小為200 bp（見圖1A）。Tet2-/-小鼠與WT 小鼠外觀無差異（見圖1B）。免疫熒光檢測Tet2-/-小鼠與WT 小鼠足底皮膚中神經(jīng)纖維標記物TUJ1 及表皮層角質(zhì)細胞標記物DAPI 的表達，結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義（見圖1C-I）。

2. WT 和Tet2-/-小鼠的急、慢性炎性疼痛行為

WT 和Tet2-/-小鼠足底注射5% Formalin，觀察其自發(fā)痛行為。結(jié)果顯示，WT 小鼠和Tet2-/-小鼠在第一時相(0～10 min)與第二時相(10～45 min)均呈現(xiàn)抬足、舔足、甩足等自發(fā)痛行為。在第一時相，Tet2-/-小鼠的自發(fā)痛行為比WT 小鼠強烈(P＜0.05, Student'st-test)，第二時相無顯著性差異（見圖2A）。注射低濃度的Formalin (0.5%) 后，Tet2-/-小鼠在第一時相和第二時相的抬足、舔足、甩足均高于WT 小鼠（P＜ 0.05, Student'st-test，見圖2B）。

小鼠單側(cè)足底注射50% CFA，檢測WT 小鼠與Tet2-/-小鼠的熱痛覺過敏（見圖2C）和機械性觸誘發(fā)痛（見圖2D）。結(jié)果顯示CFA 引起 WT 小鼠和Tet2-/-小鼠均產(chǎn)生明顯的熱痛覺過敏和機械性觸誘發(fā)痛，兩者均在注射后6 h 產(chǎn)生并持續(xù)10 天以上；但Tet2-/-小鼠的TWL 和MWT 均短于WT 小鼠。

3. WT 和Tet2-/- 小鼠在急、慢性炎性疼痛模型中的足底皮膚腫脹程度

足底注射0.5% Formalin 引起的Tet2-/-小鼠足底腫脹程度比WT 小鼠更明顯（見圖3A）。單側(cè)足底注射50% CFA 后WT 小鼠與Tet2-/-小鼠均表現(xiàn)出明顯的足底腫脹，并從注射后6 h 一直持續(xù)到第10天；在整個CFA 時程中，與WT 小鼠相比，Tet2-/-小鼠表現(xiàn)出更為明顯的足底腫脹（見圖3B）。

對WT 和Tet2-/-小鼠Saline 7 天和CFA 7 天的足底皮膚染色（見圖3C-F）。結(jié)果表明，在慢性炎性疼痛模型中，WT 和Tet2-/-小鼠均表現(xiàn)出足底皮膚的真皮層 (dermis) 和皮下組織 (hypodermis) 增厚，并且Tet2-/-小鼠更為明顯。

圖 2 WT 和Tet2-/- 小鼠的急、慢性炎性疼痛行為(A) WT 與Tet2-/- 小鼠足底注射5% Formalin 后的自發(fā)痛行為；(B) WT 和Tet2-/- 小鼠足底注射0.5% Formalin 后的自發(fā)痛行為；(C) WT 與Tet2-/- 小鼠足底注射50% CFA 后的熱縮足反射潛伏期；(D) WT 與Tet2-/- 小鼠足底注射50% CFA 后的機械刺激縮足反射閾值*P ＜ 0.05，***P ＜ 0.001，與WT 組相比Fig. 2 Acute and chronic inflammatory pain behavior in WT and Tet2-/-mice(A) The spontaneous pain of WT and Tet2-/-mice after intraplantar injection of 5% Formalin; (B) The spontaneous pain of WT and Tet2-/-mice after intraplantar injection of 0.5% Formalin; (C, D) The thermal withdrawal latency (C) and mechanical withdrawal threshold (D) after intraplantar injection of 50% CFA in WT and Tet2-/- mice.*P ＜ 0.05，***P ＜ 0.001, compared with group WT. Two-way ANOVA followed by the Bonferroni test.

4. CFA 模型小鼠足底皮膚中炎癥介質(zhì)表達

采用蛋白芯片檢測WT 和Tet2-/-小鼠CFA 造模后7 天144 種炎癥介質(zhì)在皮膚組織的表達。與WT組相比，Tet2-/-小鼠足底皮膚中的104 種炎癥介質(zhì)表達變化（圖中未顯示），19種炎癥介質(zhì)表達明顯上調(diào)，包括MMP9 (pro)（Matrix metalloproteinase 9，基質(zhì)金屬蛋白酶9 前體）、Resistin（抗素）、MMP3（基質(zhì)金屬蛋白酶3）、OPG（Osteoprotegerin，骨保護素）、IGF-II（Insulin-like growth factor 2，胰島素樣生長因子2）、TCK-1（Thymus chemokine-1，胸腺趨化因子1）、PF4（Platelet factor 4，血小板因子4）、TIMP2（Tissue inhibitor of metalloproteinase 2，金屬蛋白酶組織抑制劑2）、IL-28（Interleukin-28，白介素28）、MIP-3alpha（Macrophages inflammatory protein-3alpha，巨噬細胞炎癥蛋白3α）、GITRLigand（Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand，糖皮質(zhì)激素誘導的腫瘤壞死因子受體的配體）等（見圖4A, B）。

圖 3 WT 和Tet2-/- 小鼠在急、慢性炎癥性疼痛模型中足底皮膚腫脹程度(A) 足底注射0.5% Formalin 后，WT 和Tet2-/- 小鼠足底體積；(B)足底注射50% CFA 后WT 與Tet2-/- 小鼠足底體積；(C-F)組化染色顯示對照組和CFA 組的WT 和Tet2-/- 小鼠足底皮膚結(jié)構(gòu)*P ＜ 0.05，與WT 組相比；#P ＜ 0.05，## P ＜ 0.01，### P ＜ 0.001，與Baseline 相比Fig. 3 The plantar skin swelling in WT and Tet2-/-mice in acute and chronic inflammatory pain models(A) The paw volume of WT and Tet2-/- mice after injection of 0.5% Formalin; (B) The paw volume of WT and Tet2-/-mice after injection of 50% CFA; (C-F) Histochemistry showing the structure of paw skin in WT and Tet2-/- mice after injection of saline or CFA.*P ＜ 0.05, compared with group WT; #P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01, ###P ＜ 0.001, compared with Baseline.

圖 4 CFA 模型小鼠足底皮膚中炎癥介質(zhì)表達(A) WT 與Tet2-/- 小鼠CFA 7 d 模型中足底皮膚中炎癥蛋白表達(n = 2)。紅色越亮代表相應(yīng)蛋白表達水平越高，綠色越亮代表該蛋白表達水平越低；(B)圖A 的數(shù)據(jù)表Fig. 4 The expression of inflammatory mediators in plantar skin after CFA injection(A) Protein assay of plantar skin in WT and Tet2-/- mice 7 d after CFA injection (n = 2). The brighter the red is, the higher the expression level of the corresponding protein, and the brighter the green is, the lower the expression level of the protein; (B) Data sheet of Figure A.

討 論

TETs 最初在急性骨髓和淋巴細胞白血病中被發(fā)現(xiàn)，是Fe2+和α-酮戊二酸依賴的10-11 易位蛋白(ten-eleven translocation)，它的三個家族成員TET1、TET2、TET3 均可催化 5-甲基胞嘧啶 (5mC)依次氧化成5-羥甲基胞嘧啶 (5hmC)，5-甲酰胞嘧啶 (5FC)、和5-羧基胞嘧啶 (5cac)。TET2 功能障礙與急性髓細胞白血病、骨髓增生異常綜合征和其他髓系疾病有關(guān)[17]。TET2 通過催化5mC 調(diào)節(jié)DNA 甲基化/去甲基化過程參與免疫和炎癥相關(guān)的多種疾病，如抑制TET2 可加速動脈粥樣硬化性心血管疾病病程[9]；TET2 可通過TGF-β1 啟動子中CpG島的去甲基化激活TGF-β1 的表達，在糖尿病腎病(DN) 的發(fā)病機制中發(fā)揮作用[18]；TET2 在類風濕關(guān)節(jié)炎病人的單核細胞和T 細胞中的表達增加[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，敲除Tet2基因使小鼠產(chǎn)生更明顯的急性炎性疼痛和慢性炎性痛覺過敏行為；并且在福爾馬林引起的雙時相反應(yīng)中，兩個時相均有變化。既往的研究表明，福爾馬林引起的第一時相主要反映外周機制，由外周傷害性感受器的直接激活引起，第二時相主要反映中樞機制，由脊髓和脊髓以上的結(jié)構(gòu)發(fā)生的中樞敏化引起。因此，本研究結(jié)果提示Tet2基因可能在外周和中樞均發(fā)揮作用。既往的研究顯示，在脊髓神經(jīng)元中，敲低或下調(diào)METTL3 與YTHDF2 協(xié)調(diào)機制，通過穩(wěn)定上調(diào)TET1 調(diào)節(jié)炎性疼痛[20]。在脊髓背角星形膠質(zhì)細胞，TET3 和GATA1協(xié)同調(diào)節(jié)DNA 去甲基化參與慢性內(nèi)臟疼痛[13]。脊髓和脊髓上中樞中的TET2 在慢性疼痛中的作用還需要以后進一步研究。

本實驗中觀察到足底注射Formalin 和CFA 后Tet2-/-小鼠足底皮膚腫脹明顯增加、真皮層和皮下組織增厚，說明外周皮膚中的TET2 發(fā)揮抑制炎癥的作用。炎癥的特征是免疫細胞浸潤以及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，典型的炎癥相關(guān)的變化通常導致神經(jīng)纖維對周圍的化學環(huán)境敏化，在慢性疼痛的誘導和維持中有重要作用。相應(yīng)地，炎癥的消退是指一個復雜的過程，包括炎癥因子的清除，炎癥介質(zhì)的分解或抑制等。研究發(fā)現(xiàn)，TET2 參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，通過與Iκbζ 相互作用抑制巨噬細胞和樹突狀細胞中促炎細胞因子IL-6，并通過介導組蛋白去乙?；?/2 (HDAC1/2) 的募集以抑制IL-6和IL-1β表達[21,22]。缺乏TET2 表達的腫瘤相關(guān)巨噬細胞表現(xiàn)出免疫活性表型，包括炎性細胞因子表達增加和ARG1 表達減少[23]。與此相一致，本研究的蛋白芯片結(jié)果顯示，在CFA 誘導的慢性炎性疼痛模型中，敲除Tet2基因可導致小鼠足底皮膚中pro-MMP9、Resistin、MMP-3、OPG、PF4、IL-28 等19 種細胞因子表達上調(diào)。MMP-9 由非活性的pro-MMP-9 活化生成；而且MMP-3 是MMP-9 最有效的激活劑[24]。MMP-9 在神經(jīng)退行性疾病的病理生理機制中發(fā)揮重要作用[25]，并且參與多種急性和慢性炎性疾病[26]。Resistin 通過誘導炎性細胞因子、促進細胞黏附分子表達調(diào)節(jié)炎癥、免疫和自身免疫反應(yīng)[27]，因此我們推測Tet2可能通過MMP-9 和Resistin 在炎性疼痛中發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

根據(jù)上述結(jié)果，Tet2-/-小鼠炎性疼痛和組織炎癥程度增加很有可能與我們檢測到的這些因子（如MMP-9、Resistin、OPG、IL-28、MIP-2）的表達上調(diào)有關(guān)，已有較多報道表明了它們與炎癥的相關(guān)性。因此我們推測可能是敲除Tet2基因后導致小鼠足底皮膚細胞釋放神經(jīng)炎癥物質(zhì)增加，進而增強疼痛。通過外源性給予TET2 過表達病毒上調(diào)TET2 的水平可能為抗炎、鎮(zhèn)痛提供有效的治療途徑。但是，TET2 在外周調(diào)節(jié)炎癥和炎性疼痛的機制以及其是否參與脊髓水平疼痛調(diào)節(jié)還需要以后進一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。