李 君,趙蔚林,曹 強

(湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411102)

隨著工業(yè)化的不斷發(fā)展和人們生活節(jié)奏的加快，以及生活方式的不斷改變，精神心理、免疫因素的不斷變化，惡性腫瘤的發(fā)病率和病死率每年均呈現(xiàn)高速增長態(tài)勢。湖南部分地區(qū)人群有吃檳榔的習(xí)慣，使該地區(qū)成為口腔癌的高發(fā)地區(qū)[1-2]。口腔癌是發(fā)生在口腔黏膜上皮的惡性腫瘤，以鱗狀細胞癌為主。對于口腔癌的治療，早期主要采取以外科手術(shù)治療為主的綜合治療，手術(shù)治療可以切除原發(fā)病灶，并對頸部淋巴結(jié)進行相應(yīng)治療，從而提高患者的生存質(zhì)量，延長患者的生存時間。但對于遠處轉(zhuǎn)移者或需要預(yù)防口腔癌復(fù)發(fā)者，化學(xué)藥物的治療也是一種重要手段[3-4]。百合皂苷是從中藥百合中提取的有效成分，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為百合皂苷具有抗癌、止咳平喘、鎮(zhèn)靜催眠、降血糖、抗氧化等功效[5-6]；紫杉醇是目前發(fā)現(xiàn)的天然抗癌藥物，已經(jīng)廣泛用于乳腺癌、肺癌、卵巢癌、食管癌及頭頸部腫瘤的治療[7]。本研究以人口腔鱗癌細胞作為研究對象，探討百合皂苷聯(lián)合紫杉醇對人口腔鱗癌細胞增殖和遷移的影響，將為臨床治療口腔鱗癌提供堅實的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器 MCO-18型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(濟南卓隆生物科技有限公司)，HD-650型細胞培養(yǎng)超凈工作臺(鄭州安晨科學(xué)儀器有限公司)，MDF-C8V1型-80 ℃超低溫保存箱(浙江和儀器有限公司)，CP-90XA型超速離心機(北京昊諾斯科技有限公司)，DR-200B型酶聯(lián)免疫檢測儀(濟南雙秀生物技術(shù)有限公司)，HBS-1096型高壓滅菌鍋(深圳市鼎鑫宜實驗設(shè)備有限公司)，HH-600型電熱恒溫水箱(上海沉匯儀器有限公司)。

1.1.2實驗材料 人類口腔癌細胞系CAL27購自武漢大學(xué)附屬細胞庫。

1.1.3試劑 DMEM高糖培養(yǎng)液購自上海語純生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購自武漢尚恩生物科技有限公司；胰蛋白酶消化液購自浙江羽翔生物科技有限公司；青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自浙江聯(lián)碩生物科技有限公司；6、96孔板購自上海西唐生物科技有限公司；細胞增殖實驗(MTT)試劑購自北京百奧萊博科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)購自上海研謹生物科技有限公司；Caspase-3抗體購自北京華夏遠洋科技有限公司；細胞裂解液購自廣州左克生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1人類口腔鱗癌細胞CAL27細胞的培養(yǎng) 復(fù)蘇CAL27細胞，將DMEM高糖培養(yǎng)液與青霉素-鏈霉素雙抗溶液通過1∶100的比例進行配置，將細胞從液氮保存灌中取出，將細胞凍存管放入電熱恒溫水箱，以37 ℃的溫度進行解凍。用75%的乙醇噴灑及擦拭細胞培養(yǎng)超凈實驗臺，然后放入細胞培養(yǎng)超凈臺中，將解凍的CAL27細胞移進細胞培養(yǎng)瓶中，并向培養(yǎng)瓶中加入配置好的培養(yǎng)液，混合均勻，放入二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中，經(jīng)過48 h的培養(yǎng)后將培養(yǎng)瓶從二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中取出，放入細胞培養(yǎng)超凈實驗臺中，倒去培養(yǎng)液；使用PBS沖洗，倒去PBS后，向培養(yǎng)瓶中加入適量胰蛋白酶消化液，充分消化后，棄去胰蛋白酶消化液，向培養(yǎng)瓶中加入配置好的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打，將細胞懸液接種于新的培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)液，放入二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2MTT 使用胰蛋白酶消化液消化處理數(shù)期生長的CAL27細胞，離心后收集制成細胞懸液，調(diào)整其濃度至5×104mL-1，接種于96孔板，放入二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，依次加入百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合制劑(10 、20 、40 、80 、160 μg/mL)，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔，同時設(shè)置實驗對照孔和空白孔。分別在培養(yǎng)到24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO溶液，置于搖床上振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀光密度(OD) 490 nm處測量各孔的吸光度(A)值。通過檢測實驗對照組、空白組的A值，計算口腔癌細胞增殖抑制率。

1.2.3細胞劃痕實驗(Wound Healing) 將直尺和Marker筆在細胞培養(yǎng)超凈實驗臺內(nèi)用紫外線照射30 min，然后使用Marker筆在6孔板背后畫橫線，在孔中加入8×105個細胞，加入DMEM高糖培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，使其形成單層細胞，用10 μL移液器槍頭在單層細胞上一字劃痕，用PBS清洗3次，加入百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合制劑作為加藥組(陽性對照)，同時設(shè)置未加藥組(陰性對照)和空白對照組進行比對，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，24 h后換1次培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，放置于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，觀察加藥組、未加藥組及空白對照組劃痕愈合現(xiàn)象。

1.2.4Western blotting實驗 使用百合皂苷及紫杉醇的聯(lián)合制劑處理CAL27細胞(聯(lián)合用藥組)，同時設(shè)置未處理CAL27細胞組(未加藥組)，加藥后放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，之后倒掉培養(yǎng)液，PBS緩沖液清洗3次，加入細胞裂解液，輕輕搖動3 min，使用刮子將培養(yǎng)瓶上的細胞刮下，將細胞懸液收集于離心管中，邊搖動邊裂解10 min，然后放入離心機(12 000 r/min)離心10 min，將上清液移入離心管保存?zhèn)溆?。采用Bradford蛋白濃度測定法，使用不同體積的牛血清白蛋白(BSA)、純水及900 μL的考馬斯亮藍G250，配制成濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的BSA溶液，輕微振蕩5 min后加入孔板中，根據(jù)A值計算蛋白濃度。將配制好的分離膠加入玻璃板中，下層膠凝固之后，加入濃縮膠，插入齒梳，濃縮膠凝固后拔出齒梳，固定在電泳槽上，并加入600 mL的電泳緩沖液，上樣并開始電泳，電泳結(jié)束后，取出分離膠進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)順序如下：黑色面-海綿-三層濾紙-凝膠-聚偏二氟乙烯膜-三層濾紙-海綿-白色面，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，封閉液封閉2 h，4 ℃條件下，一抗孵育過夜，TBST溶液清洗2次，室溫下二抗孵育2 h，TBST溶液洗膜，凝膠成像系統(tǒng)顯影，計算對應(yīng)條帶灰度值[8-9]。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行處理分析，組間差異采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合用藥對CAL27細胞增殖能力的影響 CAL27細胞在由低濃度到高濃度的百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合用藥處理24、48、72 h后，口腔鱗癌CAL27細胞增殖能力隨百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合制劑的濃度不斷升高而逐漸減弱，實驗對照組與空白組CAL27細胞增殖能力比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 百合皂苷、紫杉醇不同濃度聯(lián)合用藥對CAL27細胞增殖能力的影響

2.2百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合用藥對CAL27細胞遷移能力的影響 空白對照組單層細胞上劃出一道痕，加藥組由于加入藥物的作用，CAL27細胞遷移受到抑制，未加藥組的細胞仍然保持原有的遷移能力，一段時間后，通過細胞遷移能夠?qū)澓鄹采w。加藥組與空白對照組細胞愈合率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

A.空白對照組；B.加藥組；C.未加藥組。圖2百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合用藥對CAL27細胞遷移能力的影響(200×)

2.3百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合用藥對CAL27細胞中Caspase-3蛋白表達情況的影響 聯(lián)合用藥組CAL27細胞中Caspase-3蛋白的表達明顯高于未加藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

A.兩組CAL27細胞中Caspase-3蛋白表達Western blotting圖；B.兩組CAL27細胞中Caspase-3蛋白表達比較。圖3 百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合用藥對CAL27細胞中Caspase-3蛋白表達情況的影響

3 討 論

本研究中，MTT結(jié)果提示，百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合制劑對口腔鱗癌細胞CAL27細胞增殖具有抑制作用。細胞劃痕實驗結(jié)果提示，百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合制劑對口腔鱗癌CAL27細胞遷移具有抑制作用。通過Western blotting方法，測得百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合處理CAL27細胞組(聯(lián)合用藥組)中促凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達明顯高于未加藥組。結(jié)果提示，百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合用藥可能通過誘導(dǎo)口腔鱗癌CAL27細胞發(fā)生凋亡的方式抑制其增殖遷移的。

口腔鱗癌作為近幾年發(fā)展較快的惡性腫瘤，也同樣存在相關(guān)癌基因的活化，抑癌基因的失活以及信號通路的活化，有研究表明，抑癌基因P53的突變廣泛參與口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展，作為廣泛參與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的JAK-STAT信號通路在口腔鱗癌中也處于過度活化狀態(tài)；還有研究表明，口腔癌細胞可以通過活化Wnt信號通路來抑制細胞凋亡機制的發(fā)生，進而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、增殖及轉(zhuǎn)移[10-15]。當(dāng)細胞面臨的內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變時，細胞通過自我分解自身蛋白質(zhì)或者降解衰老、病變的細胞質(zhì)內(nèi)的成分，能夠更好地去適應(yīng)環(huán)境，更容易生存，對于惡性腫瘤來說，自噬現(xiàn)象顯得尤為重要。有研究表明，通過對惡性腫瘤細胞進行體外耐藥實驗證實，發(fā)生耐藥的腫瘤細胞更容易形成自噬體，適應(yīng)抗腫瘤微環(huán)境[15]。百合皂苷、紫杉醇聯(lián)合用藥是否通過細胞凋亡或者細胞自噬機制來抑制CAL27細胞增殖遷移，還需要進一步做基因分子研究，也將成為下一個研究方向和重點。