董家瀟 宋亞紅 李修政 嚴佳棟

幾十年來，肽一直是生物化學領域一個重要而多樣的研究方向。自然界中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)肽都以三維構象折疊形式存在，特定的三維結構為肽提供了獨特的活性和選擇性。隨著研究的不斷深入，科研人員發(fā)現(xiàn)了越來越多的獨特肽，其中游離的N和C末端與形成環(huán)狀骨架的常規(guī)肽鍵相連，普遍稱為“環(huán)狀”肽。環(huán)肽是自然界中最重要的生物分子之一，與傳統(tǒng)的直線肽相比具有更高的細胞滲透性和更好的生物學活性[1,2]，其具有的有限構象柔韌性極大地增加了它們的代謝穩(wěn)定性，并提高了它們對靶標的結合親和力和特異性。另外，環(huán)肽的表面積較大，在降低吉布斯自由能的熵項中起著重要作用，使這些分子以非常高的親和力與多種不相關的受體結合[2]，并且環(huán)肽比直線肽缺少了氨基和羧基末端官能團，使整體結構更耐降解，延長作用時間。在過去的幾十年中，自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)1 000余種環(huán)狀肽，其中臨床上已經(jīng)批準了超過40種環(huán)肽藥物[3]，并且平均每年大約有一種新的環(huán)肽藥物進入市場，包括最早應用于臨床的短桿菌肽S、萬古霉素、激素類、催產(chǎn)素等。在本文中，筆者結合國內外研究現(xiàn)狀，總結了目前已應用或潛在應用于臨床的環(huán)肽藥物，對環(huán)肽在抗菌，抗癌，抗真菌，抗病毒等藥理活性方面進行討論，因篇幅有限，部分相關環(huán)肽[4-14]本文并未詳細列舉。

1 抗菌環(huán)肽

1944年，英國科學家首次在土壤細菌 Bacillus brevis中發(fā)現(xiàn)短桿菌肽S(gramicidin S，GS)的存在，并在之后的幾年里確定其晶體結構和作用機制[15]。繼GS之后，科研人員又發(fā)現(xiàn)許多天然抗菌環(huán)肽，萬古霉素是一種經(jīng)典而功能強大的環(huán)狀糖肽抗生素，于1958年被FDA批準上市，作為治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌血癥的一線抗生素用藥[16]。萬古霉素的結合靶標不是某些特定的酶，而是含有N-Ac-glucosamine (NAG) 和N-Ac-muramic acid (NAM)的肽。這種結合作用可能抑制NAG和NAM聚合物的生物合成，并進一步阻止形成細菌細胞壁的骨干結構。此外，萬古霉素還可能影響交聯(lián)酶的功能，并進一步影響細菌細胞壁的交聯(lián)。目前萬古霉素已經(jīng)在臨床中廣泛使用了近60年[17]。達托霉素是一種從土壤細菌玫瑰鏈霉菌中分離出來的環(huán)狀脂肽抗生素[18]。自2003年獲得FDA批準以來，達托霉素一直被用于治療革蘭陽性細菌引起的嚴重感染。在臨床上，它被認為是抵抗耐藥病原體的最后手段。達托霉素包含13個氨基酸殘基，其中10個組成環(huán)狀骨架，其他3個殘基(L-Trp，D-Asn和L-Asp)與癸?；|體一起形成環(huán)狀長鏈。見圖1。

Teixobactin于2015年被Ling等[20]首次報道，屬于一類新的環(huán)肽抗生素，在細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)該類環(huán)肽和大多數(shù)抗生素肽不同，teixobactin是通過一種名為“iChip”的新型多通道技術從以前無法培養(yǎng)的細菌中分離出來的。Teixobactin對革蘭陽性病原體具有顯著的抗菌活性，包括耐青霉素的鏈球菌肺炎(PRSP)，耐萬古霉素的腸球菌(VRE)和耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)。Teixobactin包含11個氨基酸，其中4個氨基酸殘基形成十肽環(huán)。在所有殘基中，有5個非天然氨基酸，包括L-Allo-enduridineidine，N-Me-D-Phe，D-Gln，D-Thr，和D-Allo-Ile。許多機制研究證明，teixobactin與萬古霉素相似，為細胞壁合成抑制劑，并證實脂質Ⅱ和脂質Ⅲ是teixobactin的兩個結合靶點，所以該藥可能具有雙重抗菌功能，且很難對其產(chǎn)生耐藥性。見圖1。

除天然存在的環(huán)肽外，人們還通過化學修飾的方法合成一系列半合成的環(huán)狀脂糖肽[21]，包括特拉萬星，達巴萬星和奧利萬星等(以特拉萬星為代表)，這三種新抗生素與萬古霉素屬于同一種類，均包含5個固定殘基的共同七肽核心，這些核心充當D-Ala-D-Ala靶標的主要結合位點，且均含有親脂性側鏈，這些藥物與其靶標的結合會阻止肽聚糖前體在細菌細胞壁中的轉肽作用。通過微調它們對不同細菌菌株或不同藥代動力學特性的活性，其結構上的細微變化會引起藥理作用的細微差異。Armaganidis等[22]發(fā)現(xiàn)POL7080是作用于銅綠假單胞菌所特有的抗菌環(huán)肽，與其他環(huán)肽不同，它是通過肽庫合成和篩選增強抗菌活性的多次迭代開發(fā)的，通過D-Pro-L-Pro b-turn基序(Polyphor專有PEM技術的基礎)穩(wěn)定其二級結構后，并通過氨基酸取代進行了幾輪優(yōu)化，新的14個氨基酸的肽顯示出減少的細胞裂解，但對銅綠假單胞菌具有高活性和選擇性。對有效抗生素的分析顯示與膜蛋白LptD結合，參與膜生物的發(fā)生，因此證明了前體的新作用方式。一項1期臨床試驗確定了POL7080的臨床安全性和耐受性，目前該抗生素正在2期評估中，以治療銅綠假單胞菌感染[23]。見圖1。

Hover等[24]通過一種與培養(yǎng)無關的土壤微生物組篩選策略，發(fā)現(xiàn)了兩種鈣依賴性抗生素Malacidin A和B(Fig.1E)。它們對革蘭陽性細菌表現(xiàn)出廣泛的活性，包括耐多藥金黃色葡萄球菌USA300，耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌NRS146(VISA)和屎腸球菌(VRE)。Hashizume等[25]從土壤放線菌菌株Amycolatopsis sp.ML1-hF的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)帕加米星A，B，C和D抗菌環(huán)肽。其中帕加米星A和C對革蘭陽性細菌(包括耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素的腸球菌(VRE)顯示出優(yōu)異的抗菌活性，而帕加米星B和D對這些細菌的抗菌活較弱，但這四種環(huán)肽對革蘭陰性菌均沒有活性。Kitani等[26]發(fā)現(xiàn)從海洋放線菌菌株Streptomyces sp.GKU 220中分離出抗菌環(huán)二肽rakicidinF。在后期抗微生物活性測定中發(fā)現(xiàn)rakicidinF在劑量為25 μg的濃度時對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌具有抑制活性作用。見圖1。

圖1 抗菌環(huán)肽化學結構式

2 抗癌環(huán)肽

臨床藥理學證明，抗腫瘤活性肽比傳統(tǒng)的藥物效果更好，更易于吸收且毒副作用小。一般由20～30個氨基酸殘基組成，可特異性的與腫瘤細胞結合，直接或間接抑制腫瘤細胞，誘導凋亡。嗜冷菌素A-H是從不同的青霉菌株中發(fā)現(xiàn)的環(huán)三肽[27]。有數(shù)據(jù)顯示，嗜冷菌素D對P388鼠白血病細胞(ID50=10.1 μmol/L)具有可接受的抗癌活性范；嗜冷菌素G顯示出對HepG2肝癌細胞具有明顯的降脂能力(IC50=10 μmol/L)；而嗜冷菌素E對HCT116(結腸)細胞系(IC50=28.5 μmol/L)表現(xiàn)出選擇性抗增殖活性，比順鉑(IC50=33.4 μmol/L)更有效[28]，其他嗜冷菌素沒有生物學活性。Wewakazole B是一種抗腫瘤環(huán)十肽，來自紅海Moorea Produces菌株的次生代謝產(chǎn)物[29]。在隨后的鐵載體檢測中，證明該環(huán)肽是非活性的，并使用MS和NMR技術驗證其結構。裸藻肽A和B是從蘑菇裸藻(Gymnopus fusipes)中分離出的兩個高度N甲基化的環(huán)肽。Ványolós等[30]發(fā)現(xiàn)裸藻肽A和B在許多人類癌細胞系(例如皮膚表皮細胞系(A431)，宮頸細胞系(Hela)和乳腺癌細胞系(MCF7，T47D和MDAMB-231)中顯示出潛在的抗增殖活性。兩種環(huán)肽都比對照品順鉑至少高出兩個數(shù)量級。Reniochalistatin A-E是一種從中國南海永興島采集的海生海綿Reniochalina stalagmitis中分離的四種環(huán)七肽和一種環(huán)八肽[31]，對五種不同的人類癌細胞系(RPMI-8226，MGC-803，HL-60，HepG2和HeLa)測試了Reniochalistatin A-E。研究結果表明，環(huán)狀八肽Reniochalistatin E對骨髓瘤RPMI-8226和胃MGC-803細胞具有生物活性，IC50值分別為4.9 μmol/L和9.7 μmol/L。但是對白血病HL-60和肝癌HepG2(IC50> 20.0 μmol/L)和宮頸HeLa(IC50> 17.3 μmol/L)細胞無活性，另外四種七肽(A-D)對測試細胞顯示無活性。見圖2。

圖2 抗癌環(huán)肽的化學結構式

ALRN-6924是一種基于訂書肽的MDM2和MDMX的雙重抑制劑，其作用之一是可中斷p53的抑制并恢復腫瘤細胞中正常p53介導的細胞活性[32]。該種環(huán)肽通過在同一面上橋接兩個氨基酸側鏈，以增加穩(wěn)定性，除此之外，該過程還可以促進肽細胞的滲透性。目前，ALRN-6924正在對p53蛋白干預的晚期實體瘤或淋巴瘤患者進行2期試驗，以及針對急性髓細胞性白血病或晚期骨髓增生異常綜合癥患者的1期試驗。

3 抗真菌肽

Nakamura等[33]從真菌菌株MF-347833.83的培養(yǎng)液中分離出一種抗真菌環(huán)狀六肽：ASP2397，該化合物的結構類似于異羥肟酸酯鐵氧體，具有螯合鋁離子的能力，并對曲霉菌種表現(xiàn)出有效的抗真菌活性，在高濃度(50 μg/ml)下對哺乳動物細胞無細胞毒性作用，且ASP2397比其他衍生物更易溶，并顯示出更大的藥物開發(fā)潛力。Colisporifungin是一種在尚未報道過的Colispora cavincola液體培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的新型環(huán)狀去脂肽[34]，結果發(fā)現(xiàn)，劑量為2 μg/ml的Colisporifungin可誘導卡泊芬凈對病原性真菌產(chǎn)生很強的抗真菌活性，從而使卡泊芬凈的IC50從約33 nmol/L降至6.2 nmol/L，效能提高5.3倍。此外，當針對白色念珠菌進行測試時，劑量為1 μg/ml的Colisporifungin會降低卡泊芬凈的IC50。Theonellamide G是從埃及洪加達紅海沿岸的海綿Theonella swinhoei中分離出來的一種雙環(huán)糖肽[35]，它對白色念珠菌和兩性霉素B的耐藥菌株表現(xiàn)出有效的抗真菌活性(IC50=4.49 μmol/L；2.0 μmol/L)。此外，它還對人結腸癌細胞系(HCT-116)具有優(yōu)異的細胞毒活性，IC50為6.0 μmol/L[36]。Ma等[37]在tamarii培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)二硫環(huán)-(Leu-Val-Ile-Cys-Cys)的環(huán)狀五肽，以及名為malformin E的五肽，該種環(huán)肽除了表現(xiàn)出有效的抗癌作用外，還顯示了對枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌和大腸桿菌的潛在抗菌活性，對白色念珠菌和茄形鐮刀菌的抗真菌MIC值分別為0.91、0.45、1.82、0.91、3.62、7.24和7.24 μmol/L。見圖3。

圖3 抗真菌肽的化學結構式

4 抗病毒環(huán)肽

Aspergillipeptide D是一種環(huán)狀五肽，是由真菌曲霉屬(Aspergillus sp.)的培養(yǎng)液中分離出來的[38]。Aspergillipeptide D在對Vero細胞系(IC50=9.5 μmol/L)的非細胞毒性濃度下，對1型單純皰疹病毒(HSV-1)表現(xiàn)出良好的抗病毒活性。它還顯示出對HSV-1-106和HSV-1-153(對阿昔洛韋有抗藥性的臨床分離株)具有近50%的抗病毒活性。Liang等[39]在深海衍生的真菌菌株Simplicillium中分離了一個新的線性肽Simplicilliumt I和4個新的環(huán)狀肽Simplicilliumtides J-M，發(fā)現(xiàn)環(huán)肽Simplicilliumtides J對Aspergillus versicolor和Curvularia australiensis表現(xiàn)出顯著的抗真菌活性和抗HSV-1作用，IC50值分別為14.0、16.7和15.6 μmol/L，并討論內酯鍵和脂肪酸鏈片段的取代基對這些類型環(huán)肽的生物活性影響。Simplicilliumtides K是從深海來源的菌株Simplicillium obclavatum EIODSF 020.87中發(fā)現(xiàn)的[39]。它對HSV-1表現(xiàn)出有效的抗病毒活性，IC50值為14.0 μmol/L，并且還對黑云藻表現(xiàn)出明顯的抗真菌活性。有相關研究利用計算機篩選與人免疫缺陷病毒1型轉錄反轉錄激活因子(HIV-1 Tat)綴合的商業(yè)環(huán)肽配體，通過分子對接和分子動力學技術模擬與埃博拉病毒抑制劑的偶聯(lián)作用，該研究團隊從313個商業(yè)環(huán)肽和一個HIV-1 Tat肽中修飾了614個配體，最終得到配體023是與HIV-1 Tat結合來抑制埃博拉病毒的最佳環(huán)肽[40]。見圖4。

圖4 抗病毒環(huán)肽的化學結構式

5 其他環(huán)肽

在過去的幾年中，還報道了許多具有其他生物活性的環(huán)肽。從鏈霉菌屬菌種的培養(yǎng)物中獲得了兩個環(huán)狀肽[41]，稱為Pentaminomycin A和B， Pentaminomycin A通過減緩酪氨酸酶，酪氨酸酶相關蛋白-1(TRP-1)和酪氨酸酶相關蛋白2(TRP-2)等黑色素生成酶的表達來抑制α-MSH刺激的黑色素的合成。從波羅的海藍藻提取物中提取的具有生物活性的環(huán)狀六肽Anabaenopeptins 1,該物質包含Dolichospermun spp.(10%),Aphanizomenon flos-aquae (40%)和Nodularia spumigena (50%)。它們均對蛋白質磷酸酶1和羧肽酶A表現(xiàn)出抑制作用，但對胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶和凝血酶沒有抑制作用[42]。最后，F(xiàn)DA近年來批準上市的第一個從頭開發(fā)的藥物是peginesatide，該藥用于治療無法使用促紅細胞生成素[23]所導致的嚴重貧血。另有研究中通過針對紅細胞生成素的噬菌體逐級篩選而發(fā)現(xiàn)的受體[43]。

然后將其與聚乙二醇(PEG)發(fā)生二聚，從而增加血液中的親和力，效力和循環(huán)時間，但是遇到臨床試驗中的許多問題，在批準一年后自愿退出市場。除這些化合物外，最近還報道了許多其他生物活性環(huán)肽。例如，內環(huán)化合物A和B是兩個環(huán)狀四肽[44]，分別對血管加壓素受體1A和5-羥色胺受體5HT2b表現(xiàn)出良好的親和力90，具有顯著的降脂作用。Kaneda等[45]發(fā)現(xiàn)環(huán)亞麻肽(CL)除了具有抗瘧和免疫抑制作用之外，還具有破骨細胞分化抑制活性，該小組利用TRAP活性作為破骨細胞分化的指標，篩選了在先前的植物化學研究中分離出的化合物，結果發(fā)現(xiàn)，環(huán)亞麻肽所顯示出的破骨細胞分化抑制活性能力明顯強于陽性對照(姜黃素：IC50 7.50 lM，伊普黃酮：IC50 17.2 lM)。Dishon等[46]篩選出一種新型環(huán)肽蛋白模擬物c(MyD 4-4)來抑制TLR配體的炎性反應以及對NF-kB進行激活，該種環(huán)肽可以特異性地阻斷髓樣分化因子(MyD88)，防止MyD88二聚化，以及降低小鼠多發(fā)性硬化癥。因此，使用c(MyD 4-4)調節(jié)MyD88依賴性信號傳導是降低自身免疫性CNS疾病先天性免疫不良反應的潛在治療策略。見圖5。

綜上所述，長期以來，由于其治療潛力，人們一直對天然來源的環(huán)肽給予了極大的關注。天然環(huán)肽具有抵抗細菌和病毒感染的作用，從而克服了日益增加的抗生素耐藥性現(xiàn)象。但是在環(huán)肽治療劑的開發(fā)中仍然存在一些重要的挑戰(zhàn)，其中兩個最重要的挑戰(zhàn)是口服有效性和細胞通透性。近年來應用的創(chuàng)新方法解決了這些挑戰(zhàn)中的部分問題，包括使用細胞穿透性肽、具有烴接頭的α-螺旋構象穩(wěn)定化的肽、N-甲基化的體外進化肽等。根據(jù)目前國內外研究現(xiàn)狀，開發(fā)具有良好口服利用率并通過被動擴散有效進入細胞的環(huán)狀肽，可能有必要考慮分子量較小且肽鍵較少的肽。

圖5 其他環(huán)肽的化學結構式