李倩，馬文穎，湯凡宇，肖紅，趙連東，石靜萍

Alzheimer’s病(AD)是最常見的癡呆類型，其膽堿能系統(tǒng)的異常是最為突出和嚴(yán)重的，膽堿能神經(jīng)退行性病變的程度與記憶障礙的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[1]。多奈哌齊(DNP)是目前臨床常用的膽堿酯酶抑制劑，該藥具有半衰期長，不良反應(yīng)小，患者耐受性好等特點(diǎn)[2-3]。但文獻(xiàn)[2-3]報(bào)道，不同患者對(duì)DNP治療的反應(yīng)不同，其有效應(yīng)答率相差20%～60%。DNP血藥濃度的變化及其代謝酶的基因多態(tài)性可能是造成個(gè)體療效差異較大的原因之一。肝藥酶CYP3A4是DNP的主要代謝酶[3-4]，國人多態(tài)頻率較高的位點(diǎn)為CYP3A4*18B和CYP3A4*1G。有研究[3-4]表明CYP3A4酶活性可影響患者DNP血藥濃度，但目前關(guān)于CYP3A4*18B和CYP3A4*1G基因多態(tài)性對(duì)患者DNP血藥濃度的影響并不清楚。國外研究[5]認(rèn)為將DNP血藥濃度控制在50～75 ng/ml較為合適。國內(nèi)目前尚無DNP治療AD有效血藥濃度的推薦范圍。考慮到人種及藥物代謝等差異，歐美國家的標(biāo)準(zhǔn)未必適合國人，故本研究將探討DNP治療AD的有效血藥濃度，并分析其代謝酶CYP3A4基因多態(tài)性對(duì)DNP血藥濃度的影響，為AD的DNP個(gè)體化治療提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 篩選2019年10月至2021年4月于南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科首次就診未服藥的輕中度AD患者，并收集其臨床資料。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合美國國立老化研究所與AD協(xié)會(huì)診斷標(biāo)準(zhǔn)(2011)中很可能的AD標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)年齡50～85歲；(3)MMSE評(píng)分為10～26分且無聽力視力等障礙；(4)能夠基本理解并完成本實(shí)驗(yàn)中的各項(xiàng)檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他原因?qū)е碌姆茿D型癡呆；(2)服用其他膽堿酯酶抑制劑或美金剛者；(3)既往有甲狀腺功能減退、抑郁癥、強(qiáng)迫癥、焦慮癥等精神癥狀病史；(4)不能長期耐受服用DNP或長期服用被CYP3A4廣泛代謝的藥物(抗膽堿能藥、抗驚厥藥、抗精神病藥等)者。本研究經(jīng)過南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2020-KY097-01)，所有受試者在入組前均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)認(rèn)知心理量表檢測 所有受試者均在服藥前由南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院心理測評(píng)室專業(yè)測評(píng)醫(yī)師進(jìn)行認(rèn)知量表檢測，包括MMSE、漢密爾頓抑郁量表(HAMD)和漢密爾頓焦慮量表(HAMA)。服藥6個(gè)月后，再次對(duì)患者進(jìn)行MMSE量表復(fù)評(píng)及臨床印象變化量表(CIBIC-plus)評(píng)定。其中，MMSE評(píng)估患者總體認(rèn)知功能；HAMD和HAMA進(jìn)一步排除患者存在抑郁、焦慮等情緒問題；CIBIC-plus評(píng)估患者服藥6個(gè)月后的臨床癥狀變化情況。

1.2.2 給藥方案 所有受試者量表評(píng)估后即開始于晚間21:00～22:00服用DNP[商品名：安理申，衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司]5 mg，服藥1個(gè)月后門診空腹檢查受試者肝腎、凝血功能等排除藥物不良反應(yīng)，并根據(jù)患者和照料者對(duì)患者認(rèn)知、生活能力變化情況及藥物不良反應(yīng)等綜合分析，將可耐受DNP、認(rèn)知、生活能力較服藥前無改善的患者，劑量調(diào)至10 mg，服藥6個(gè)月后進(jìn)行DNP血藥濃度、代謝酶CYP3A4基因多態(tài)性檢測。

1.2.3 療效評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)及有效血藥濃度 根據(jù)國際臨床健康研究所標(biāo)準(zhǔn)[7],有效組患者需同時(shí)滿足以下兩個(gè)條件：復(fù)評(píng)時(shí)MMSE評(píng)分較前無下降；6個(gè)月復(fù)診時(shí)CIBIC-plus評(píng)定為好轉(zhuǎn)或無變化。不滿足上述條件之一者則屬于無效組。取所有有效組患者DNP血藥濃度平均值作為本次研究的最終結(jié)果，即DNP治療AD的有效血藥濃度范圍。

1.2.4 測定DNP血藥濃度 采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測藥物濃度，采血時(shí)間為早晨9:00～10:00餐后。以0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相A，0.1%甲酸甲醇溶液為流動(dòng)相B。取標(biāo)線，質(zhì)控，內(nèi)標(biāo)。取血清樣品100 μl，加入400 μl內(nèi)標(biāo)液，渦旋混合3 min，于4 ℃ 11 000 r/min離心15 min，取上清液300 μl，于4 ℃ 11 000 r/min離心15 min，取100 μl上清液上樣分析[8]。

1.2.5CYP3A4基因多態(tài)性測定 采用數(shù)字熒光分子雜交技術(shù)檢測基因多態(tài)性。在1.5 ml離心管中分別加入1.2 ml 1×NH4CL預(yù)處理液及150 μl靜脈血混勻，上下顛倒10次，室溫靜置5 min。3 000 r/min離心5 min，棄上清。取1.5 μl耀金保處理過的白細(xì)胞混懸液，加到1支短暫離心后的耀金分/耀金染試劑中，充分混勻并短暫離心，上機(jī)檢測SNP位點(diǎn)：CYP3A4*18B(A>G, rs28371759)、CYP3A4*1G(C>T, rs2740574)。

以上檢測過程均嚴(yán)格遵守試劑及儀器的使用規(guī)范及《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》。

2 結(jié) 果

2.1 分組及臨床資料比較 見表1。本研究對(duì)70例服藥的AD患者進(jìn)行定期隨訪，其中有效患者49例，無效患者21例，兩組間性別、年齡、受教育程度及MMSE初始得分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 有效組和無效組臨床資料比較[±s，例(%)]

表1 有效組和無效組臨床資料比較[±s，例(%)]

臨床資料有效組(n=49)無效組(n=21)P值性別(男)17(34.7)11(52.4)0.166a年齡(歲)69.14±8.6964.52±8.400.051b受教育年限(年)10.24±4.009.14±2.920.178b病程(年)2.20±1.083.17±2.110.058b基線MMSE(分)17.98±4.8616.43±5.330.239b糖尿病4(8.2)2(9.5)1.000c高血壓10(20.4)4(19.0)0.896a高血脂8(16.3)3(14.3)1.000c癡呆家族史6(12.2)4(19.0)0.473c 注:aχ2檢驗(yàn);b獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);cFisher確切概率法

2.2 AD患者DNP血藥濃度分析 本組AD患者DNP血藥濃度個(gè)體差異性大。其中，服藥5 mg DNP的平均血藥濃度為(25.68±10.57)ng/ml(最大值56.69 ng/ml，最小值8.41 ng/ml)，服藥10 mg DNP的平均血藥濃度為(51.36±9.47)ng/ml(最大值69.95 ng/ml，最小值25.10 ng/ml)。患者治療前后MMSE平均分值和DNP治療血藥濃度無明顯相關(guān)性(r=0.228，P=0.057)。

2.3 兩組DNP血藥濃度的比較 有效組中，6例患者服藥5 mg，平均血藥濃度為(47.63±8.13)ng/ml；43例患者服藥10 mg，平均血藥濃度為(52.80±6.85)ng/ml；所有有效組患者DNP的平均血藥濃度為(52.17±7.13)ng/ml，DNP治療AD的有效血藥濃度范圍為45～59 ng/ml。無效組中，7例患者服藥5 mg，平均血藥濃度為(23.83±4.13)ng/ml；14例患者服藥10 mg，平均血藥濃度為(46.92±16.39)ng/ml；所有無效組患者DNP平均血藥濃度為(39.23±16.25)ng/ml。無效組患者血藥濃度明顯低于有效組(均P<0.01)。

2.4 無效組DNP血藥濃度分析 無效組21例患者中，12例患者DNP血藥濃度明顯低于45 ng/ml,5例患者DNP血藥濃度明顯高于59 ng/ml。4例DNP血藥濃度在有效范圍中的患者，其中1例患者存在血管緊張轉(zhuǎn)化酶ACE基因突變(有研究[9]表明，ACE為AD的易感基因)；1例患者顱腦MRI提示額葉低灌注，早期存在精神行為癥狀，額顳葉癡呆不能排除；另外2例患者原因不明，但臨床癥狀發(fā)展較快，半年隨訪量表評(píng)分下降≥4分。

2.5CYP3A4基因多態(tài)性 見表2?；颊逤YP3A4*18B和CYP3A4*1G基因多態(tài)性分布符合Hardy-Weinberg群體遺傳學(xué)平衡定律[10](均P>0.05)，樣本具有代表性。

表2 CYP3A4基因多態(tài)性檢測分布表

2.6CYP3A4基因多態(tài)性對(duì)DNP血藥濃度的影響 由于GG和TT型攜帶者較少，故主要對(duì)AA、AG、CC和CT基因亞型進(jìn)行分析。服用DNP 5 mg時(shí)，AG型攜帶者血藥濃度[(29.41±11.72)ng/ml]明顯高于AA型攜帶者[(23.63±9.37)ng/ml](P<0.01)；CT型攜帶者血藥濃度[(28.81±10.24)ng/ml]與CC型攜帶者[(24.43±10.84)ng/ml]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。服用DNP 10 mg時(shí)，AG型攜帶者血藥濃度[(59.62±5.41)ng/ml]明顯高于AA型攜帶者[(46.54±7.88)ng/ml]，CT型攜帶者血藥濃度[(58.09±5.47)ng/ml]明顯高于CC型攜帶者[(47.79±8.40)ng/ml](均P<0.01)。

此外，將CYP3A4*18B和CYP3A4*1G聯(lián)合比較分析。服藥5 mg時(shí)，同時(shí)攜帶AA、CC型患者DNP血藥濃度[(23.14±9.65)ng/ml]與同時(shí)攜帶AG、CC型患者[(26.21±9.32)ng/ml]、同時(shí)攜帶AA、CT型患者[(27.50±6.18)ng/ml]和同時(shí)攜帶AG、CT型患者[(29.12±11.11)ng/ml]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；服藥10 mg時(shí)，同時(shí)攜帶AA、CC型患者DNP血藥濃度[(44.83±7.66)ng/ml]明顯低于同時(shí)攜帶AA、CT型患者[(54.14±3.97ng/ml)]、同時(shí)攜帶AG、CC型患者[(56.24±4.7)ng/ml]和同時(shí)攜帶AG、CT型患者[(60.32±4.75)ng/ml](均P<0.01)。

2.7CYP3A4基因多態(tài)性與MMSE治療前后平均分值的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CYP3A4*18B基因AA、AG基因亞型和CYP3A4*1G基因CC、CT基因亞型與MMSE治療前后平均分值均不存在相關(guān)性(P=0.479；P=0.744)，排除入組患者的認(rèn)知水平對(duì)本研究基因結(jié)果的可能偏倚。

3 討 論

DNP是治療AD的一線用藥，有效的藥物濃度是提高大腦皮質(zhì)乙酰膽堿含量、改善認(rèn)知的關(guān)鍵。然而，相同劑量下DNP的血藥濃度個(gè)體差異性較大，考慮可能與其主要代謝酶的基因多態(tài)性有關(guān)。介于以往對(duì)DNP血藥濃度和肝藥酶CYP2D6基因多態(tài)性的相關(guān)性已有較為一致的結(jié)論[4,10]，故本文僅探討CYP3A4基因多態(tài)性對(duì)DNP血藥濃度的影響。

研究[11]發(fā)現(xiàn)，DNP血藥濃度波動(dòng)大，且血藥濃度影響療效。服用5 mg DNP 3周后，血藥濃度為7.8～65.4 ng/ml，而服用10 mg DNP 3周后，血藥濃度則為17.2～53.7 ng/ml[11]。本研究觀察結(jié)果也得出相似結(jié)果，服用DNP 5 mg,患者血藥濃度最大值56.69 ng/ml，最小值8.41 ng/ml，而服藥10 mg時(shí)，血藥濃度最大值69.95 ng/ml，最小值25.10 ng/ml，個(gè)體差異性極大，表明在治療過程中定期對(duì)患者血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測很有必要，尤其對(duì)于這種存在記憶障礙且已知服藥依從性差的AD患者，適當(dāng)增加血藥濃度監(jiān)測次數(shù)，進(jìn)行個(gè)體化藥物濃度的調(diào)節(jié)，有利于提高患者臨床療效和服藥依從性。在無效組中，部分患者血藥濃度明顯較低，服藥效果不明顯，部分患者血藥濃度在正常值范圍內(nèi)，但存在AD的易感基因，部分患者血藥濃度較高，但并未如期產(chǎn)生增強(qiáng)效應(yīng)，反而易產(chǎn)生不良反應(yīng)。此外，在監(jiān)測的過程中，本研究發(fā)現(xiàn)4例血藥濃度超過87 ng/ml的患者出現(xiàn)惡心、嘔吐等較嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)。本研究根據(jù)定期隨訪進(jìn)行藥物濃度監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，使用DNP治療AD的有效血藥濃度范圍為45～59 ng/ml。通過有效組和無效組血藥濃度比較可以看出，DNP治療AD，血藥濃度過高或過低都將弱化臨床療效，無效組患者DNP血藥濃度大部分偏低，離散程度大，而有效組DNP血藥濃度明顯趨勢集中，表明AD治療期間，DNP血藥濃度需要達(dá)到一定范圍方能起效。

CYP3A4是廣泛分布于成人肝臟和腸道的代謝酶，具有多種遺傳表型，可導(dǎo)致高達(dá)十倍以上的藥物個(gè)體差異性[12]。目前關(guān)于CYP3A4基因多態(tài)性對(duì)AD患者DNP血藥濃度及體內(nèi)代謝影響的研究并不多。有研究[13]表明，CYP3A4基因多態(tài)性和AD患者DNP血藥濃度及臨床療效間無顯著相關(guān)性。但Lu等[13]通過高效液相色譜法對(duì)77例AD患者進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，CYP3A4多態(tài)性對(duì)左旋-DNP的代謝產(chǎn)物6-ODD濃度無影響，但可提高右旋-DNP的代謝產(chǎn)物6-ODD濃度。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CYP3A4基因多態(tài)性影響DNP血藥濃度。CYP3A4*18B-G等位基因和CYP3A4*1G-T等位基因攜帶者的血藥濃度均高于未攜帶者，在服藥10 mg患者中，差異更顯著。濃度差異可能是因?yàn)镃YP3A4*18B-G和CYP3A4*1G-T等位基因可降低CYP3A4代謝酶活性，從而增加DNP血藥濃度。故臨床用藥需要根據(jù)CYP3A4基因多態(tài)性，適當(dāng)調(diào)整服藥劑量。

本研究存在以下不足：(1)未對(duì)DNP代謝產(chǎn)物濃度進(jìn)一步檢測；(2)總體樣本量較小，分析CYP3A4基因多態(tài)性存在一定局限性。

綜上所述,服用DNP治療AD時(shí)，有效血藥濃度范圍為45～59 ng/ml。CYP3A4*18B和CYP3A4*1G的不同基因亞型，對(duì)DNP的藥物濃度產(chǎn)生不同的影響。血藥濃度監(jiān)測和CYP3A4基因多態(tài)性檢測可為指導(dǎo)AD患者DNP個(gè)體化治療提供參考。