肖嵋方，陳欣彤，蔡雯雯，李 娜，陳海明，劉 斌,3,*，曾 峰,*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.海南省食品營養(yǎng)與功能食品重點實驗室，海南 ?？?570228；3.福建農(nóng)林大學(xué) 國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002）

目前，肥胖和高脂血癥的高患病率被視為公共衛(wèi)生的主要威脅，全球約有5億5千萬肥胖人口和14億超重人口。越來越多的科學(xué)研究證實，肥胖可導(dǎo)致胰島素抵抗、II型糖尿病、心血管疾病等代謝類疾病，如何科學(xué)有效地預(yù)防、改善肥胖和高脂血癥一直是科學(xué)研究的重大挑戰(zhàn)。

食用菌富含多糖、活性蛋白和多肽、黃酮及多酚類等營養(yǎng)與功能活性物質(zhì)，具有極高的營養(yǎng)和藥用價值，在抗氧化、降血脂、降血糖、調(diào)節(jié)免疫、抑菌和抗腫瘤等方面應(yīng)用廣泛。為探究食用菌水提物在脂質(zhì)代謝及調(diào)控上發(fā)揮的作用，趙圓圓通過建立高脂動物模型研究杏鮑菇多糖（polysaccharides，PEP）的降脂作用，發(fā)現(xiàn)PEP能顯著降低總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇的含量，且降脂功效具有劑量-效應(yīng)關(guān)系，還通過血清代謝組分析發(fā)現(xiàn)PEP參與機體甘油磷脂和脂肪酸代謝，改善能量代謝，其機制可能與腺苷酸活化蛋白激酶-乙酰輔酶A羧化酶等信號通路發(fā)生改變相關(guān)。竹蓀（）作為“菌中皇后”，富含多糖等活性物質(zhì)，在改善脂質(zhì)代謝方面同樣有廣泛的利用價值，Wang Wenshuai等發(fā)現(xiàn)從竹蓀子實體分離的多糖成分能夠減輕肥胖小鼠體質(zhì)量，改善肥胖相關(guān)的肝腎代謝異常，穩(wěn)定血脂，降低胰島素和瘦素的耐受性，還對機體氧化應(yīng)激損傷有恢復(fù)作用。由此可知，竹蓀等食用菌以其自身營養(yǎng)功能優(yōu)勢在改善食源性肥胖、降血脂方面有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。

秀麗隱桿線蟲（簡稱線蟲）是抗氧化、抗衰老相關(guān)功能評價的常用模式生物之一，其同源基因已被證實與人類高度相似，且研究還發(fā)現(xiàn)，線蟲參與脂質(zhì)合成和代謝的機制同樣可與人體聯(lián)系，能夠作為功效成分降脂作用的評價模型。目前，竹蓀中的活性成分與抗氧化和降脂功效有關(guān)的研究多集中在水提多糖，而關(guān)于竹蓀水提物中的其他成分如蛋白、多酚及黃酮類化合物等與多糖作為整體發(fā)揮聯(lián)合效應(yīng)的研究較少，因此，本研究采用熱水浸提法制備竹蓀水提物，并對其抗氧化活性進行測定，再以線蟲為模型，評價其對線蟲抗應(yīng)激和減少脂質(zhì)積累的能力，通過測定其對脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達水平的調(diào)控作用，分析竹蓀水提物的降脂功效，以期為竹蓀等食用菌營養(yǎng)功能性食品的研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長裙竹蓀子實體 福建省古田縣戴氏果蔬專業(yè)合作社；野生N2型秀麗隱桿線蟲 福建上源生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、油紅O 北京索萊寶科技有限公司；2,2’-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）上海源葉生物科技有限公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TG2003甘油三酯試劑盒 南京建成生物工程公司；UNlQ-10柱式總RNA抽提試劑盒、M-MuLV型cDNA合成試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；Novoprotein E047-01A型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 上海近岸蛋白有限公司；巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、鹽酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 揚州市博睿糖生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MK3型酶標(biāo)儀、ICS5000型離子色譜儀、ABI7900熒光定量PCR儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；DHG-9203A型熒光電子顯微鏡 德國蔡司公司；SRA03-11型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SX2-2.5-10G型馬弗爐 山東歐萊博儀器有限公司；MA35M型全自動紅外線水分測定儀 濟南愛來寶儀器有限公司；LC-10A型高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 竹蓀水提物的制備

參照Liu Xiaoyan等的方法制備竹蓀水提物。竹蓀經(jīng)烘干、磨粉、過40 目篩得到竹蓀粗粉。稱取100 g竹蓀粗粉，按料液比1∶35（/）加入去離子水，于92 ℃恒溫水浴鍋熱水浸提2 h，4 000 r/min離心20 min，收集上清液，70 ℃蒸發(fā)濃縮至原體積的1/10，凍干得到竹蓀水提物，貯藏在-20 ℃條件下備用，待后續(xù)指標(biāo)分析。

1.3.2 竹蓀水提物的組成分析

1.3.2.1 總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)

參照溫文娟等的研究，采用苯酚-硫酸法測定竹蓀水提物的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2.2 總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)

參照Yu等的方法，采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定竹蓀水提物的總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2.3 水分、總灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)

采用全自動紅外線水分測定儀測定竹蓀水提物水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，具體操作參考儀器說明書，平行測定3 次。

參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》測定竹蓀水提物中灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2.4 脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)

參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》測定脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2.5 竹蓀水提物中多糖的組成分析

樣品預(yù)處理：參照1.3.1節(jié)方法制備竹蓀水提物提取液，70 ℃蒸發(fā)濃縮至原體積的1/8，然后加入4 倍體積的無水乙醇，混勻后靜置24 h，過濾收集沉淀，凍干得到多糖。精密稱量10 mg多糖樣品置于安瓿瓶中，加入10 mL 3 mol/L三氟乙酸溶液，120 ℃水解3 h，通入氮氣吹干。加入10 mL去離子水渦旋混勻，取100 μL加入900 μL去離子水，然后12 000 r/min離心5 min。取上清液采用離子色譜儀進行分析。

檢測條件：色譜柱：DionexCarbopacTMPA20（3 mm×150 mm）；流動相A：超純水；流動相B：15 mmol/L NaOH溶液；流動相C：含15 mmol/L NaOH的100 mmol/L醋酸鈉溶液；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：30 ℃；檢測器：電化學(xué)檢測器。洗脫程序：0.0～18.0 min，98.8% A、1.2% B、0.0% C；20.0～30.0 min，50.0% A、50.0% B、0.0% C；30.1～46.0 min，0.0% A、0.0% B、100.0% C；46.1～50.0 min，0.0% A、100.0% B、0.0% C；50.1～60.0 min，98.8% A、1.2% B、0.0% C；60.1～80.0 min，98.8% A、1.2% B、0.0% C。

取巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、鹽酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品配制質(zhì)量濃度均為5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品母液作為混標(biāo)。采用外標(biāo)法進行定量，根據(jù)峰面積計算竹蓀水提物多糖中不同單糖的含量，并計算物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)。

1.3.2.6 竹蓀水提物中多糖分子質(zhì)量的測定

利用高效凝膠滲透色譜（high performance gel perme ation chromatography，HPGPC）法采用高效液相色譜儀測定多糖分子質(zhì)量和純度。樣品及標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制：精密稱取樣品和葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（分子質(zhì)量分別為1 152、5 000、11 600、23 800、48 600、80 900、148 000、273 000、409 800、667 800 Da），配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后備用。

色譜條件：色譜柱：BRT105-104-102串聯(lián)凝膠柱（8 mm×300 mm）；流動相：0.05 mol/L NaCl溶液；流速：0.6 mL/min，柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL；檢測器：RI-10A示差檢測器。

以標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對數(shù)（底數(shù)為10）為縱坐標(biāo)，以保留時間為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和竹蓀水提物中多糖組分的保留時間計算竹蓀水提物中主要多糖組分的分子質(zhì)量。

1.3.3 體外抗氧化活性評價

1.3.3.1 DPPH自由基清除率

參照文獻[18-19]的方法并稍作修改。將1.3.1節(jié)竹蓀水提物分別配制成1、2、3、4、5 mg/mL水溶液。實驗組分別以500 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液與500 μL DPPH溶液（0.4 mmol/L）混合。以等體積無水乙醇作為空白對照，以等體積VC溶液（1、2、3、4、5 mg/mL）作為陽性對照。室溫下避光反應(yīng)30 min后，12 000 r/min離心10 min，取上清液測定517 nm波長處吸光度，每個質(zhì)量濃度平行測定3 次。對質(zhì)量濃度與清除率關(guān)系進行線性擬合計算竹蓀水提物對DPPH自由基的半抑制質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC）。

1.3.3.2 羥自由基清除率

參照文獻[20-21]的方法并稍作修改。將1.3.1節(jié)竹蓀水提物分別配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL水溶液。實驗組分別將500 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液與250 μL FeSO溶液（1.5 mmol/L）、115 μL HO溶液（6.7 mmol/L），混勻，以等體積去離子水作為空白對照，以等體積VC溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL）作為陽性對照。37 ℃水浴10 min后，加入75 μL水楊酸溶液（20 mmol/L），置于水浴鍋反應(yīng)30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液測定562 nm波長處吸光度，每個質(zhì)量濃度平行測定3 次，計算水提物對羥自由基的IC。

1.3.3.3 ABTS陽離子自由基清除率

參照文獻[22]的方法并稍作修改。將1.3.1節(jié)竹蓀水提物分別配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL水溶液。將ABTS母液用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4、0.01 mol/L，下同）稀釋至在734 nm波長處吸光度為0.70±0.02，配得ABTS工作液。按照50 μL/孔在96 孔板中加入不同質(zhì)量濃度竹蓀水提物水溶液，30 ℃下靜置3 min，然后每孔加入150 μL ABTS工作液混合，30 ℃反應(yīng)6 min，測定734 nm波長處吸光度，以等體積PBS作為空白對照，以等體積VC溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL）作為陽性對照。每個質(zhì)量濃度平行測定3 次，計算水提物對ABTS陽離子自由基的IC。

1.3.4 線蟲同步化與分組

線蟲同步化和培養(yǎng)參照文獻[23]的方法并稍作修改。挑取成蟲置于新鮮NGM培養(yǎng)基，于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其產(chǎn)卵后將成蟲挑出，在培養(yǎng)基中加入100 μL OP50（尿嘧啶缺陷大腸桿菌）培養(yǎng)液（OD為0.4～0.6，后同），繼續(xù)培養(yǎng)48 h，即完成線蟲的同步化，用于后續(xù)實驗。

將竹蓀水提物溶解在OP50培養(yǎng)液中，配制竹蓀水提物培養(yǎng)液。挑取同步化的成蟲，分為4 組，每日分別給予100 μL OP50培養(yǎng)液（空白組）、0.25 mg/mL竹蓀水提物培養(yǎng)液（低劑量組）、0.5 mg/mL竹蓀水提物培養(yǎng)液（中劑量組）與1.0 mg/mL竹蓀水提物培養(yǎng)液（高劑量組），每日更換NGM培養(yǎng)基，72 h后收集蟲體，用于后續(xù)實驗。

1.3.5 線蟲抗氧化應(yīng)激、熱應(yīng)激實驗

線蟲抗氧化應(yīng)激、熱應(yīng)激實驗參照文獻[9]的方法并稍作修改。取1.3.4節(jié)收集的4 組蟲體（＝30），轉(zhuǎn)移至加有15 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)30% HO溶液的NGM培養(yǎng)基（10 mL）上，每隔1 h觀察線蟲存活情況并記錄存活線蟲數(shù)量，直至線蟲全部死亡，重復(fù)測定3 次，分別按式（1）、（2）計算各組線蟲抗氧化應(yīng)激的存活率和平均壽命，并繪制生存曲線（不同時間下的存活率情況）。

式中：x為第小時存活的線蟲數(shù)量；為初始總線蟲數(shù)量。

取1.3.4節(jié)收集的4 組蟲體（＝30），轉(zhuǎn)移至新鮮NGM培養(yǎng)基上，于38 ℃培養(yǎng)，每隔1 h觀察線蟲存活情況并記錄存活線蟲數(shù)量，直至線蟲全部死亡，重復(fù)測定3 次，分別按式（1）、（2）計算各組抗熱應(yīng)激的存活率和平均壽命，并繪制生存曲線。

1.3.6 油紅O染色

參照文獻[24-25]的方法并稍作修改。取1.3.4節(jié)收集的4 組蟲體（＝30），加1 mL M9緩沖液，3 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入200 μL油紅O染色液，染色2 h后，3 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用M9緩沖液洗去多余染液，置于熒光顯微鏡下觀察拍照。選擇去頭尾的線蟲中段，運用Image-Pro Plus6.0軟件處理圖片計算各竹蓀活性物質(zhì)組與空白組線蟲油紅O染色光密度值的比值，即為各劑量組線蟲體脂的相對光密度值。

1.3.7 甘油三酯濃度的測定

取1.3.4節(jié)收集的4 組蟲體（＝150），加1 mL M9緩沖液，3 000 r/min離心10 min，棄去上清液，然后繼續(xù)用M9緩沖液洗滌3 次，收集沉淀。加入200 μL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，冰上孵育1 h后勻漿處理，3 000 r/min離心5 min，取上清液采用甘油三酯試劑盒測定甘油三酯濃度。

1.3.8 脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達水平的測定

取1.3.4節(jié)收集的4 組蟲體（＝150），加20 μL M9緩沖液，依次進行總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR染料法和ABI 7300 PCR系統(tǒng)進行實時熒光定量PCR分析。擴增條件：95 ℃，1 min；95 ℃，20 s；60 ℃，1 min，40 個循環(huán)。相關(guān)引物的設(shè)計如表1所示，以為內(nèi)參基因，基因相對表達水平采用2法計算。

表1 線蟲脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification of lipid metabolismrelated genes in C. elegans

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗設(shè)置3 個平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel和Origin軟件進行數(shù)據(jù)處理及作圖。采用Excel軟件進行顯著性分析，采用檢驗進行單因素方差分析，＜0.05和＜0.01分別表示差異顯著和差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹蓀水提物的總糖、總蛋白、水分和灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)

竹蓀水提物的總糖、總蛋白、粗脂肪、水分和灰分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（38.5±1.5）%、（14.4±1.2）%、（1.6±0.1）%、（17.9±0.3）%、（23.4±1.9）%。由此可知，竹蓀水提物中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，說明糖類組分在竹蓀水提物中的占比最大。

2.2 竹蓀水提物的單糖組成和分子質(zhì)量

2.2.1 單糖組成

由圖1、表2可知，竹蓀水提物主要由巖藻糖、鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖和葡萄糖組成，且葡萄糖的占比最大（物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)達到85.3%），其次是半乳糖和巖藻糖。

表2 竹蓀水提物的單糖組成Table 2 Monosaccharide composition of water extract from D. indusiate

圖1 竹蓀水提物的單糖組成離子色譜圖Fig. 1 Ion chromatogram of monosaccharide composition of water extract from D. indusiate

2.2.2 分子質(zhì)量

由葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品得到的校正曲線方程為＝-0.206 5+12.529，＝0.995 3。由圖2可知，竹蓀水提物中多糖分子質(zhì)量分布較廣泛，4 個主要組分的分子質(zhì)量依次為5.64×10、2.80×10、8.00×10、77.0 Da。

圖2 竹蓀水提物多糖的HPGPC圖Fig. 2 High performance gel permeation chromatogram of polysaccharides from water extract from D. indusiate

2.3 竹蓀水提物的體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除率

如圖3所示，1～5 mg/mL竹蓀水提物質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。5 mg/mL竹蓀水提物的DPPH自由基清除率達84.13%，但低于該質(zhì)量濃度下VC的清除率（97.20%）。竹蓀水提物對DPPH自由基的IC為2.36 mg/mL。

圖3 竹蓀水提物對DPPH自由基的清除能力Fig. 3 DPPH radical scavenging capacity of water extract from D. indusiate

2.3.2 羥自由基清除率

由圖4可知，0.5～2.5 mg/mL竹蓀水提物對羥自由基的清除能力呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，2.5 mg/mL竹蓀水提物的羥自由基清除率達到80.91%，但低于該質(zhì)量濃度下VC的清除率（95.50%）。竹蓀水提物對羥自由基的IC為1.44 mg/mL。

圖4 竹蓀水提物對羥自由基的清除能力Fig. 4 Hydroxyl radical scavenging capacity of water extract from D. indusiate

2.3.3 ABTS陽離子自由基清除率

由圖5可知，0.5～2.5 mg/mL竹蓀水提物對ABTS陽離子自由基的清除能力呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。2.5 mg/mL竹蓀水提物的ABTS陽離子自由基清除率達到最大（79.38%），但低于該質(zhì)量濃度下VC的清除率（96.45%），竹蓀水提物對ABTS陽離子自由基的IC為0.86 mg/mL。

圖5 竹蓀水提物對ABTS陽離子自由基的清除能力Fig. 5 ABTS cation radical scavenging capacity of water extract from D. indusiate

2.4 竹蓀水提物對線蟲抗氧化應(yīng)激的影響

添加HO的NGM培養(yǎng)基能夠引起線蟲產(chǎn)生急性氧化應(yīng)激，使機體細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平增加，從而激活線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由圖6可知，HO對線蟲壽命的刺激作用較強，線蟲的存活率急劇下降，而與空白組相比，不同劑量竹蓀水提物組線蟲的平均壽命均極顯著延長（＜0.01），低、中、高劑量組的平均壽命分別延長了20.4%、32.7%、54.6%，且竹蓀水提物質(zhì)量濃度與線蟲抗氧化應(yīng)激的壽命存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖6 竹蓀水提物對線蟲抗氧化應(yīng)激的影響（n＝30）Fig. 6 Effect of water extract from D. indusiate on antioxidant stress in C. elegans (n = 30)

2.5 竹蓀水提物對線蟲抗熱應(yīng)激的影響

熱應(yīng)激是指動物暴露在熱環(huán)境中產(chǎn)生的一系列高溫性全身急性炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致動物休克甚至死亡。由圖7可知，在38 ℃熱刺激下，線蟲的存活率隨時間延長呈現(xiàn)下降趨勢，與空白組相比，竹蓀水提物各劑量組線蟲的存活率明顯升高；此外，竹蓀水提物各劑量組的抗熱應(yīng)激平均壽命更長，其中，與空白組相比，中、高劑量組平均壽命分別顯著延長了6.6%和19.8%（＜0.05）。

圖7 竹蓀水提物對線蟲抗熱應(yīng)激的影響（n＝30）Fig. 7 Effect of water extract from D. indusiate on heat stress resistance in C. elegans (n = 30)

2.6 竹蓀水提物對線蟲體內(nèi)脂質(zhì)積累的影響

2.6.1 油紅O染色觀察結(jié)果

未經(jīng)染色的線蟲蟲體在顯微鏡下呈透明色，當(dāng)固定后的線蟲被置于油紅O工作液中時，染料能與線蟲體內(nèi)的甘油三酯結(jié)合，溶于組織細(xì)胞脂質(zhì)中，使組織內(nèi)的脂滴呈現(xiàn)紅色。使用熒光顯微鏡拍攝線蟲體脂染色情況，顯微鏡下各劑量組線蟲形態(tài)如圖8所示，空白組線蟲蟲體顏色整體較深，各劑量組蟲體中段的染色面積隨竹蓀水提物質(zhì)量濃度增大而逐漸減小，且在中、高劑量組中表現(xiàn)比較明顯。由圖9可知，1.0 mg/mL竹蓀水提物對線蟲體內(nèi)降脂功效最佳，低、中、高劑量組的相對光密度值分別為空白組的71.6%、53.0%、43.0%。與空白組相比，竹蓀水提物高劑量組線蟲體內(nèi)的脂質(zhì)沉積極顯著減少了57.0%（＜0.01）。整體來看，竹蓀水提物能極顯著減少線蟲體內(nèi)脂肪積累。

圖8 線蟲油紅O染色圖（6×）Fig. 8 Photographs of oil red O staining (6 ×)

圖9 線蟲油紅O染色后相對光密度值Fig. 9 Relative optical density after oil red O staining

2.6.2 甘油三酯濃度

線蟲體內(nèi)的脂質(zhì)主要積累在皮下細(xì)胞及腸道組織內(nèi)，甘油三酯是線蟲脂質(zhì)的主要組成，常作為判定脂質(zhì)代謝紊亂的標(biāo)準(zhǔn)之一。由圖10可知，與空白組相比，竹蓀水提物能夠減少線蟲體內(nèi)脂質(zhì)的積累，且隨著質(zhì)量濃度的升高，線蟲體內(nèi)甘油三酯濃度逐漸降低，最低為0.548 mmol/L，與空白組相比極顯著降低了40.5%（＜0.01）。

圖10 竹蓀水提物對線蟲體內(nèi)甘油三酯濃度的影響Fig. 10 Effect of water extract from D. indusiate on TG content in C. elegans

2.7 竹蓀水提物對脂質(zhì)代謝相關(guān)基因相對表達量的影響

線蟲的脂質(zhì)代謝是極其復(fù)雜的過程，涉及的脂質(zhì)代謝相關(guān)通路與人類高度同源，包括脂肪酸的合成、氧化分解，此外還與糖代謝和能量代謝有關(guān)。線蟲脂質(zhì)代謝通路主要有5 條，測定各代謝通路上關(guān)鍵基因的mRNA相對表達水平，分析竹蓀水提物對正常狀態(tài)下線蟲體內(nèi)（5-羥色胺信號通路）、（核激素受體信號通路）、、（胰島素信號通路）、、（mdt-15/sbp-1信號通路）、、（轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β信號通路）以及-9脂肪酸去飽和酶基因//、脂肪酸β-氧化基因等12 個脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達量的影響。由圖11可看出，竹蓀水提物對5 條脂質(zhì)代謝通路均有顯著調(diào)控作用，竹蓀水提物低、中、高劑量組能夠誘導(dǎo)、基因的表達水平顯著下調(diào)（＜0.05、＜0.01），對、、和基因有顯著上調(diào)作用（＜0.05、＜0.01）；對、、、的下調(diào)和對的上調(diào)作用只在中、高劑量組中表現(xiàn)明顯，低劑量組無顯著干預(yù)效果（＞0.05）。

圖11 竹蓀水提物對線蟲脂質(zhì)代謝通路關(guān)鍵基因相對表達量的影響Fig. 11 Effect of water extract from D. indusiate on the relative expression levels of key genes involved in the lipid metabolism pathway of C. elegans

3 討 論

本研究采用熱水浸提法制備竹蓀水提物，對其主要成分、多糖中單糖組成及分子質(zhì)量進行分析，然后以DPPH自由基、羥自由基和ABTS陽離子自由基清除能力為指標(biāo)，評價了竹蓀水提物的抗氧化活性，隨后以線蟲為模型，測定了不同劑量竹蓀水提物對線蟲氧化應(yīng)激和熱應(yīng)激耐受能力的影響，采用油紅O染色法測定線蟲體內(nèi)脂肪沉積情況并分析了甘油三酯濃度，評價其對線蟲體內(nèi)脂質(zhì)水平的影響，最后通過測定脂質(zhì)代謝相關(guān)通路關(guān)鍵基因的相對表達水平，初步探討了竹蓀水提物在改善線蟲機體脂質(zhì)代謝過程中的分子機制。

ROS作為機體基礎(chǔ)代謝的常見產(chǎn)物，當(dāng)其長期出現(xiàn)不正常積累時，過多的ROS會氧化蛋白質(zhì)、脂類和核酸等細(xì)胞成分，使機體出現(xiàn)活動能力下降等多種病理狀況。大量研究發(fā)現(xiàn)，線蟲壽命與機體的抗氧化能力具有較大的關(guān)聯(lián)性，活性物質(zhì)可能通過發(fā)揮抗氧化功效達到延長線蟲壽命的作用。因此結(jié)合體外抗氧化結(jié)果分析，竹蓀水提物對修復(fù)線蟲氧化應(yīng)激損傷有明顯的效果，究其原因可能與竹蓀水提物的抗氧化活性有關(guān)。

油紅O染色結(jié)果及甘油三酯濃度變化均表明竹蓀水提物具有明顯的降脂效果，以此為出發(fā)點，采用熒光定量PCR法初步分析其中的分子機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)竹蓀水提物對線蟲體內(nèi)5 條降脂通路的關(guān)鍵基因均有調(diào)控作用（圖12），從而進一步驗證了竹蓀水提物的降脂功效。5-羥色胺（又名血清素）是調(diào)節(jié)機體能量消耗和外周組織中脂質(zhì)代謝基因mRNA表達的神經(jīng)遞質(zhì)，主要通過腸-腦軸影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，控制機體的食欲，達到減肥降脂的目的。該通路下的mod-1受體能夠通過影響脂肪酸β-氧化關(guān)鍵酶的限速基因調(diào)節(jié)機體的脂質(zhì)代謝平衡。線蟲的基因是單不飽和脂肪酸合成通路mdt-15/sbp-1的重要組成，主要通過協(xié)調(diào)其他脂肪酸代謝基因的表達維持脂肪酸穩(wěn)態(tài)；其下游基因是哺乳動物調(diào)控脂質(zhì)合成基因的同源基因，二者與維持機體的營養(yǎng)平衡密切相關(guān)，基因受基因的直接調(diào)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)，二者中任一基因表達量降低，機體的脂質(zhì)沉積都會顯著減少。哺乳動物的過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferatorsactivated receptors，PPARs）系列基因是脂肪代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠通過調(diào)控脂肪消耗、能量獲取及儲存，從而維持脂質(zhì)代謝平衡，而作為的高度同源基因，在調(diào)控脂肪酸平衡上具有重要作用。/6/7是編碼-9脂肪酸去飽和酶的特異性基因，是促使棕櫚酸向棕櫚油酸轉(zhuǎn)化的基因，而/則促使硬脂酸向油酸轉(zhuǎn)化，三者共同維持機體飽和脂肪酸/單不飽和脂肪酸的比例平衡，也直接影響甘油三酯的合成。

圖12 竹蓀水提物調(diào)節(jié)線蟲脂質(zhì)代謝的作用機制Fig. 12 Mechanism of regulating lipid metabolism of C. elegans by water extract from D. indusiate

綜合來看，竹蓀水提物對FAT家族3 個基因的調(diào)控包括多條途徑，和基因的上調(diào)可能與和的作用有關(guān)，其中，與其上游基因之間存在負(fù)反饋調(diào)控；而基因的下調(diào)則與和胰島素信號通路基因有關(guān)，其中基因又與基因存在負(fù)反饋調(diào)控，這一結(jié)果與Du Xiaocui和Chumphoochai等的研究類似，其潛在原因可能是，3 個基因在功能上有所重疊且受到、、等多通路多基因的共同影響，即當(dāng)其中的一個基因顯著下調(diào)時，其他基因發(fā)生上調(diào)導(dǎo)致基因功能的代償現(xiàn)象，從而維持機體脂肪酸比例的平衡；Xu Xiaoying等研究發(fā)現(xiàn)除基因作用的復(fù)雜關(guān)系外，還有另外一種可能，即基因在調(diào)控脂質(zhì)積累的過程中可能更多的是扮演一種介導(dǎo)的角色，即介導(dǎo)活性物質(zhì)發(fā)揮脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)的作用。此外，基因的表達被抑制，這與Peng Huimin和吉鑫等的研究結(jié)果一致，可能是其他通路（如核激素受體通路）調(diào)節(jié)脂質(zhì)積累發(fā)生的負(fù)反饋機制，目的是防止能量的進一步消耗；另一方面有研究發(fā)現(xiàn)敲除基因可降低表達水平，因此也可能是基因下調(diào)的結(jié)果。胰島素信號通路和TGF信號通路是兩條平行的通路，可以平行調(diào)控線蟲的脂代謝，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)竹蓀水提物能夠提高的表達，影響胰島素基因的表達，抑制下游的核轉(zhuǎn)位，從而減少脂肪積累；而在TGF信號通路中，和雖然都出現(xiàn)了下調(diào)，但只在高劑量組具有差異顯著性（＜0.05），說明可能是竹蓀水提物在該通路上發(fā)揮作用的主要因子。結(jié)合之前的結(jié)果來看，盡管竹蓀水提物減少線蟲體內(nèi)的脂質(zhì)積累作用具有劑量-效應(yīng)關(guān)系，但對某些基因（如和）表達的影響并不明顯，這可能與竹蓀水提物調(diào)控脂質(zhì)代謝的復(fù)雜分子機制有關(guān)，其具體的作用方式和精準(zhǔn)的作用靶點后續(xù)還需要利用RNA干擾技術(shù)，對幾條通路上的個別或者部分基因進行敲除，使該基因沉默，檢測這些基因在脂質(zhì)累積的具體作用，從而更全面地研究和分析竹蓀水提物改善脂質(zhì)代謝的功效機制。

綜上，竹蓀水提物對提高線蟲抗氧化和熱應(yīng)激能力有較好的效果，還能通過脂肪酸β氧化、脂肪酸合成與分解、胰島素信號等通路調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達水平，有效減少線蟲體內(nèi)的脂質(zhì)沉積和甘油三酯濃度，發(fā)揮降脂功效。