由高飛，唐金鑫，孫 航，劉士偉，李秋陽，徐 萍，于 雷，畢云楓

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

據(jù)2019年臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國患糖尿?。╠iabetes，DM）人數(shù)約為1.16億 人，占總?cè)丝诘?2.8%，隨著人們生活水平的改善和不健康飲食習(xí)慣的增加，DM患者已經(jīng)出現(xiàn)早期患病、低齡患病人數(shù)增加的趨勢。DM患者血糖長期處于較高水平，從而可引發(fā)各種并發(fā)癥，如肝臟、腎臟、血管和心臟相關(guān)疾病等，其中肝臟病變率高達(dá)21%～78%。當(dāng)前DM型肝病患者治療以終身用藥為主，不能達(dá)到根治，且長期服藥會(huì)產(chǎn)生多種毒副作用，導(dǎo)致體質(zhì)量下降。因此尋找高效、低毒的具有保護(hù)DM肝臟損傷的天然活性成分已成為當(dāng)前人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

牛蒡子是菊科草本作物牛蒡的干燥果實(shí)，牛蒡子苷元（arctigenin，ATG）是牛蒡子中的木質(zhì)素類成分（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～1.0%），可通過酶解或酸水解牛蒡子苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%～7%）制備，ATG可在動(dòng)物腸道內(nèi)高效發(fā)揮藥理作用，研究發(fā)現(xiàn)ATG具有抗流感病毒、抗結(jié)腸炎、抗DM小鼠腎臟損傷、抗抑郁和抗焦慮、降血壓和改善認(rèn)知障礙等作用，其廣泛的藥理活性受到研究者的重視。目前鮮見ATG對(duì)DM肝損傷的治療效果研究，因此，本實(shí)驗(yàn)研究ATG對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)的DM小鼠肝臟損傷的保護(hù)作用，旨在為DM型肝損傷的預(yù)防、治療和ATG相關(guān)保健產(chǎn)品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)ICR雄性小鼠，80 只、5 周齡，體質(zhì)量25～30 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008）。

嗜熱-葡萄糖苷酶由本團(tuán)隊(duì)構(gòu)建的工程菌表達(dá)并提取制備；牛蒡子苷（純度為70%）購自四川省維克奇生物科技有限公司；ATG（純度為97.2%）由嗜熱-葡萄糖苷酶酶解牛蒡子苷制備。

二甲雙胍（metformin，Met）、四氧嘧啶、羧甲基纖維素鈉、組織Toll樣受體4（toll-like receptors，TLR4）、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、核因子κB p65（nuclear factor κB p65，NF-κB p65）單抗 北京索萊寶科技有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（asparate aminotransferase，AST）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate，BCA）試劑盒 南京建成生物研究所；所用其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-IIDN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；2100型可見分光光度計(jì) 尤尼柯上海儀器有限公司；LC-MSH-2L型恒溫加熱磁力攪拌器、Neofuge 23R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)有限公司；XL30 ESEM-FEG場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡美國FEI公司；Multiskan FC型酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；EA-12型安穩(wěn)血糖測定儀 三諾生物傳感股份有限公司；Flexar型高效液相色譜儀 美國PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 ATG的酶解制備

利用超聲波輔助-葡萄糖苷酶酶解牛蒡子苷制備ATG，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳工藝參數(shù)為酶用量質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%、酶解時(shí)間2.5 h、酶解溫度60 ℃、超聲功率320 W。反應(yīng)結(jié)束后，ATG粗提物經(jīng)萃取、真空抽濾、脫色、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、水洗去糖、體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液重結(jié)晶處理，真空冷凍干燥收集ATG提取物，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測純度為97.2%，0～4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 動(dòng)物飼養(yǎng)

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物中心第四飼養(yǎng)室，早8∶00至晚8∶00給予光照，溫度為23 ℃，相對(duì)濕度55%，每籠5 只小鼠，及時(shí)添加飼料和水，更換墊料，小鼠采購后適應(yīng)新環(huán)境14 d。實(shí)驗(yàn)倫理審查編號(hào)：20201110001。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)相關(guān)溶液的配制

溶液配制參考文獻(xiàn)[17]中的方法，四氧嘧啶的配制：依據(jù)小鼠每千克體質(zhì)量稱取180 mg四氧嘧啶溶于0.3 mL冷生理鹽水（0～4 ℃），現(xiàn)用現(xiàn)配，2 min注射完畢；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制：準(zhǔn)確稱取0.300 0 g羧甲基纖維素鈉溶于60 mL蒸餾水中，磁力攪拌過夜，錫箔紙包裹，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；Met溶液配制：依據(jù)小鼠每千克體質(zhì)量稱取200 mg Met，快速溶于冷生理鹽水（0～4 ℃），配制成0.3 mL溶液，混勻；ATG溶液配制：依據(jù)各組小鼠每千克體質(zhì)量相應(yīng)稱取120、90、60 mg ATG，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%羧甲基纖維素鈉中制成0.3 mL混懸液。

1.3.4 建立四氧嘧啶誘發(fā)DM小鼠模型

將適應(yīng)14 d的小鼠晚10∶00至次日早8∶00斷食不斷水，腹腔注射180 mg/kg四氧嘧啶，給藥3 d后，前一晚斷食不斷水8 h后，尾尖取血，用血糖儀測血糖濃度，血糖濃度高于11.1 mmol/L作為DM建模標(biāo)準(zhǔn)。選取健康小鼠作為對(duì)照組，將DM小鼠隨機(jī)分組，灌胃給藥：對(duì)照組、模型組灌胃生理鹽水10 mL/kg，Met組灌胃Met 200 mg/kg，ATG高、中、低劑量組分別灌胃120、90、60 mg/kgATG，各給藥溶液均為給藥前配制，每日早8∶00給藥，實(shí)驗(yàn)周期為28 d。

1.3.5 常規(guī)指標(biāo)測定

第一次灌胃給藥后，每7 d記錄小鼠體質(zhì)量和空腹血糖濃度，觀察各組小鼠健康狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束稱量各組小鼠肝質(zhì)量，根據(jù)下式計(jì)算肝臟指數(shù)。

1.3.6 血清指標(biāo)測定

灌胃4 周，最后一次灌胃后，將所有小鼠轉(zhuǎn)移至解剖室進(jìn)行樣品的采集，眼球取血1 mL，使血液緩緩自然流下，常溫靜置1 h，冷凍離心機(jī)分離血清（5 000 r/min、10 min），于-20 ℃冰箱備用。按照試劑盒說明書測定ALT、AST活力和IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度。

1.3.7 GSH、CAT、SOD水平測定

將小鼠脫頸椎處死，解剖分離肝臟組織，生理鹽水沖洗肝臟表面血跡，稱質(zhì)量、記錄，各組取0.200 0 g肝組織，剪刀剪碎后，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行冰水浴粉碎，加入適量冷生理鹽水，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的組織勻漿液，冷凍離心（5 000 r/min、10 min）得上清液。依據(jù)說明書中小鼠肝勻漿濃度曲線進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定最佳的組織樣品濃度，按照試劑盒說明書測定GSH、CAT、SOD水平。

1.3.8 肝臟組織病理學(xué)分析

取相同部位肝組織，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%甲醛溶液固定，脫水、透明處理、包埋后，制備3 μm切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）法染色，于電子顯微鏡下（400 倍）觀察小鼠肝組織病理變化。

1.3.9 蛋白免疫印跡分析

將肝組織冰浴迅速剪碎，倒入蛋白裂解液快速研磨10 min，低溫離心（6 000 r/min、20 min）后測定蛋白含量，經(jīng)過配膠、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)膜后，充分將樣品中相關(guān)蛋白條帶分離。洗膜：用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）處理5 min，重復(fù)3 次（下同）；加入包被液，緩慢搖晃，室溫放置2 h，倒掉包被液，再次洗膜；一抗：用0.01 mol/L PBS稀釋，覆蓋聚偏二氟乙烯膜，室溫放置2 h。用1%牛血清白蛋白（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）作對(duì)照；二抗：加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)，緩慢搖晃，室溫放置2 h；倒掉二抗，洗膜；暗光加顯色劑，待出現(xiàn)條帶，加入雙蒸水停止反應(yīng)。用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析，結(jié)果以目的蛋白相對(duì)GADPH的表達(dá)量表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，每組重復(fù)3 次，使用Origin Pro 9.0軟件作圖和SPSS 26軟件分析數(shù)據(jù)，多組間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較分析采用Bonferroni法。以＜0.05、＜0.01分別表示差異顯著和極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 建模情況分析

四氧嘧啶腹腔注射劑量為180 mg/kg，對(duì)于第一次建模未成功小鼠進(jìn)行第二次半數(shù)劑量建模（90 mg/kg），建模成功率為62%。建模后，6 只小鼠死亡，死亡原因有小鼠機(jī)體免疫力低下、DM引起的不適和小鼠相互撕咬等，與灌胃ATG無關(guān)。小鼠DM癥狀明顯，表現(xiàn)為體毛變得粗糙雜亂、伏地行走、不好動(dòng)、反應(yīng)遲緩、墊料潮濕、糞便較多和飲食進(jìn)水量增加等。

2.2 小鼠常規(guī)指標(biāo)分析結(jié)果

空腹血糖濃度能夠準(zhǔn)確反映出DM小鼠患病狀況，由圖1可知，與對(duì)照組相比，模型組小鼠血糖濃度極顯著升高（＜0.01），均超過11.1 mmol/L，結(jié)合2.1節(jié)小鼠生理狀況，證明本實(shí)驗(yàn)DM小鼠模型建立成功。在28 d時(shí)，與模型組相比，Met組、ATG高劑量組小鼠血糖濃度極顯著下降（＜0.01），相比于0 d時(shí)，血糖濃度分別降低30.75%、26.12%。

圖1 ATG對(duì)小鼠血糖濃度的影響（n＝7）Fig. 1 Effect of ATG on the blood glucose level of mice (n = 7)

由表1可知，與0 d相比，28 d時(shí)各組小鼠體質(zhì)量都有不同程度的增長，對(duì)照組、Met組和ATG高劑量組小鼠體質(zhì)量極顯著增長（＜0.01），分別增長20.22%、13.47%和11.03%；模型組小鼠體質(zhì)量增長不顯著（＞0.05）。0～7 d時(shí)，部分小鼠因注射四氧嘧啶后，機(jī)體代謝發(fā)生紊亂，體質(zhì)量會(huì)出現(xiàn)負(fù)增長，而Met、ATG不同劑量組都能對(duì)DM小鼠體質(zhì)量的下降起到改善作用。

表1 ATG對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（n＝7）Table 1 Effect of ATG on body mass of mice (n = 7)g

如表2所示，與模型組相比，ATG高、中劑量組對(duì)肝臟指數(shù)作用效果極顯著（＜0.01），低劑量組作用效果不顯著（＞0.05）。綜上所述，ATG可以改善DM小鼠體質(zhì)量降低、肝臟脂肪堆積的情況，ATG高劑量組與Met組治療效果相當(dāng)。

表2 ATG對(duì)小鼠肝質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響（n＝7）Table 2 Effect of ATG on liver mass and liver index of mice (n = 7)

2.3 血清指標(biāo)分析結(jié)果

AST和ALT是反映肝臟健康程度的指標(biāo)，小鼠肝臟在受到藥物刺激時(shí)，器官內(nèi)的AST和ALT會(huì)通過受損的器官流向組織間隙，進(jìn)入血液。由圖2可知，與對(duì)照組相比，模型組ALT活力和AST活力極顯著升高（＜0.01），表明DM小鼠的肝器官受到了損傷。與模型組比較，Met組、ATG高劑量組的ALT活力和AST活力均極顯著降低（＜0.01）；ATG中劑量組AST活力顯著降低（＜0.05），ALT活力無顯著變化（＞0.05）。以上結(jié)果說明，ATG治療可改善DM小鼠血清中ALT活力和AST活力。

圖2 ATG對(duì)小鼠血清AST（A）、ALT（B）活力的影響（n＝7）Fig. 2 Effect of ATG on the activities of AST (A) and ALT (B) in serum of mice (n = 7)

IL-6、TNF-α是引起肝臟炎癥的重要促炎因子，通過檢測血清中IL-6、TNF-α的水平可以判斷肝臟的炎癥程度。ATG對(duì)DM小鼠肝臟炎癥因子IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度的影響如表3所示，相比于對(duì)照組，模型組中IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度極顯著升高（＜0.01），表明本實(shí)驗(yàn)DM小鼠已經(jīng)出現(xiàn)炎癥變化。與模型組比較，Met、ATG所有劑量組IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度均顯著降低（＜0.01、＜0.05）。以上結(jié)果說明ATG灌胃干預(yù)后，可減輕DM小鼠肝臟內(nèi)炎癥反應(yīng)。

表3 ATG對(duì)小鼠肝組織IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度的影響（n＝7）Table 3 Effect of ATG on the contents of IL-6 and TNF-α in liver tissue of mice (n = 7)

2.4 肝臟勻漿相關(guān)指標(biāo)分析結(jié)果

GSH、CAT和SOD水平是評(píng)價(jià)機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要指標(biāo)，能在一定程度反映機(jī)體受到外界刺激后體內(nèi)氧化還原平衡的改善能力。如圖3所示，與對(duì)照組相比，模型組中GSH含量、CAT活力和SOD活力均出現(xiàn)極顯著下降（＜0.01）。與模型組比較，ATG高劑量組中GSH含量、CAT活力和SOD活力不同程度的升高（＜0.01、＜0.05），且對(duì)于CAT活力的改善效果與陽性Met組相當(dāng)，ATG中劑量組CAT活力和SOD活力顯著升高（＜0.05）。以上結(jié)果表明，ATG對(duì)DM小鼠肝臟化應(yīng)激起到改善作用，能夠使GSH含量、CAT活力和SOD活力趨近于正常值，從而改善DM小鼠肝臟氧化應(yīng)激水平。

圖3 ATG對(duì)小鼠肝組織GSH含量（A）和CAT（B）、SOD（C）活力的影響（n＝7）Fig. 3 Effect of ATG on the levels of GSH (A), CAT (B) and SOD (C)in liver tissue of mice (n = 7)

2.5 肝臟組織病理切片觀察結(jié)果

如圖4所示，對(duì)照組肝組織形態(tài)完整清晰，不存在脂肪變性現(xiàn)象，組織細(xì)胞被正常紅染，細(xì)胞均勻，內(nèi)部漿液清晰可見，中間藍(lán)色為細(xì)胞核；模型組小鼠肝臟則表現(xiàn)異常，排列明顯疏松不規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)顯示出空泡形態(tài)，且有出血現(xiàn)象，說明脂肪已經(jīng)變性；ATG高、中劑量和Met對(duì)肝臟組織損傷有一定的改善作用，細(xì)胞內(nèi)染紅面積增大，細(xì)胞空泡和出血區(qū)域減少；ATG低劑量組肝臟切片區(qū)域形態(tài)基本與模型組無差異，無明顯改善效果。

圖4 ATG對(duì)小鼠肝組織病理變化的影響Fig. 4 Effect of ATG on histopathological changes of liver tissue in mice

2.6 蛋白免疫分析結(jié)果

DM小鼠肝臟中TLR4、MyD88和NF-κB p65電泳表達(dá)量和蛋白相對(duì)表達(dá)量分別如圖5、6所示，與對(duì)照組相比，模型組中TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量極顯著升高（＜0.01），ATG高劑量組和Met組有相似的治療效果，均可顯著降低TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量（＜0.01、＜0.05）；ATG中劑量組干預(yù)效果不顯著（＞0.05）；ATG低劑量組中MyD88、NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（＜0.01、＜0.05），但對(duì)TLR4蛋白表達(dá)無顯著降低作用（＞0.05）。以上結(jié)果表明，ATG對(duì)于DM小鼠肝損傷有一定的治療作用，且與TLR4、MyD88和NF-κB p65信號(hào)通路有密切聯(lián)系。

圖5 TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白電泳圖Fig. 5 Electrophoresis profiles of TLR4, MyD88 and NF-κB p65 proteins

圖6 ATG對(duì)TLR4（A）、MyD88（B）、NF-κB p65（C）蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 6 Effect of ATG on the relative expression levels of TLR4 (A),MyD88 (B) and NF-κB p65 (C) proteins

3 討 論

ATG是牛蒡子中主要的活性成分之一，其在改善DM及其并發(fā)癥方面具有廣泛作用，研究發(fā)現(xiàn)ATG可抑制-葡萄糖苷酶活力，延緩血糖濃度增高，從而達(dá)到調(diào)節(jié)血糖水平的作用，ATG給藥后，DM小鼠的尿蛋白量、TNF-α表達(dá)量下降，蛋白質(zhì)的非酶糖化能力受到限制，證實(shí)ATG可減輕DM腎病損傷。馮芹等發(fā)現(xiàn)ATG可降低DM大鼠血壓，增加血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，改善血小板參數(shù)特征，減少血小板的破壞，并可降低白細(xì)胞總數(shù)，改善DM慢性炎癥?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，本實(shí)驗(yàn)表明，ATG能降低DM小鼠血糖濃度、提高其體質(zhì)量，且能降低炎癥因子TNF-α、IL-6的質(zhì)量濃度。

肝臟損傷是DM最常發(fā)生的器官損害之一，肝臟損傷病理過程比較復(fù)雜，且可能與體內(nèi)炎癥因子表達(dá)、水平改變有關(guān)，目前研究的主要發(fā)病機(jī)理是通過脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物指標(biāo)表示氧化應(yīng)激，如丙二醛、SOD和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）含量。氧化應(yīng)激在1型和2型DM的高血糖癥中已有報(bào)道，因此被認(rèn)為是DM并發(fā)癥發(fā)展的中心因素；經(jīng)四氧嘧啶、CCl、脂多糖等誘導(dǎo)的小鼠機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平會(huì)發(fā)生改變，而過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)促進(jìn)相關(guān)炎癥因子的釋放，如TNF-α和IL-1β，而TNF-α與NF-κB通路的表達(dá)有緊密聯(lián)系，前者可活化肝臟內(nèi)中性粒細(xì)胞使氧自由基外流，進(jìn)而正反饋激活NF-κB，從而使氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)形成循環(huán)通路，對(duì)肝臟細(xì)胞造成損傷；TLR4是NF-κB信號(hào)通路中主要表達(dá)因子，TRL4信號(hào)通路被激活后，從而影響NF-κB通路，激活多種炎性因子表達(dá)，發(fā)生炎性反應(yīng)，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致機(jī)體組織、器官的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)過氧化可改變氧化應(yīng)激水平，從而引起細(xì)胞損傷。陳羨人等發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1可明顯降低大鼠肝組織TLR4蛋白陽性細(xì)胞占比，提高SOD、CAT、GSH-Px活力以及總抗氧化能力，并改善大鼠肝組織結(jié)構(gòu)形態(tài)。張韞等發(fā)現(xiàn)黃連素可改善2型DM大鼠肝臟氧化損傷，大鼠肝組織的Nrf2、SOD、CAT、GSH-Px等表達(dá)量明顯升高，該過程可能是通過Nrf2介導(dǎo)的抗氧化實(shí)現(xiàn)的。因此，DM肝損傷可能由于TLR4、MyD88、NF-κB p65誘導(dǎo)的炎性通路被激活，引起下游TNF-α、IL-6等炎癥因子表達(dá)，進(jìn)而對(duì)氧化應(yīng)激水平產(chǎn)生影響，加劇炎癥發(fā)展，引起更嚴(yán)重的組織損傷。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)ATG給藥處理后，與模型組相比，ATG高劑量極顯著降低了DM小鼠血清中ALT活力和AST活力（＜0.01）；ATG高、中劑量極顯著降低了炎癥因子IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度（＜0.01）；ATG高劑量極顯著提高了糖尿病小鼠肝臟內(nèi)CAT、SOD活力（＜0.01），顯著提高GSH含量（＜0.05）；ATG高劑量顯著降低肝臟內(nèi)TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量（＜0.05、＜0.01），以上結(jié)果表明ATG干預(yù)后DM小鼠氧化應(yīng)激和炎癥因子水平均得到改善，肝臟損傷癥狀減輕，但其作用機(jī)理仍需進(jìn)一步闡明。由于對(duì)DM肝臟損傷仍缺乏有效的治療手段，因此探討ATG對(duì)DM肝臟損傷的保護(hù)作用對(duì)開展臨床DM肝損傷研究具有重要意義。