黃玉潔，郝儀銘,2，周夢晴，伍梓健，楊玉紅，劉小芳，王保珍，杜 磊,2,*

（1.山東大學齊魯醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，山東 濟南 250012；2.山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院專科轉(zhuǎn)化研究中心，山東 濟南 250013；3.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）食品科學與工程學院，山東 濟南 250353；4.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開發(fā)重點實驗室，山東 青島 266071）

肝臟作為人體最大的實質(zhì)器官，具有分泌膽汁、代謝、凝血、解毒和免疫等功能，在維持人體健康生理活動中起至關(guān)重要的作用。病毒感染、氧化應激、酒精、藥物等多種因素可導致急性肝損傷，嚴重者甚至發(fā)展為肝衰竭，造成重大健康威脅。因此，尋找新的并且安全有效的肝損傷保護食品功能因子具有重要意義。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細菌細胞壁的組成成分，在急性肝損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。因此，LPS誘導的急性肝損傷動物模型常被用來探尋能有效防治急性肝損傷的干預措施。

海洋食品富含-3系多不飽和脂肪酸，特別是二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA），二者具有抗炎、改善糖脂代謝、促進視覺和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等多種生物活性。不同海洋食品中DHA和EPA存在的分子形式不同，南海鳶烏賊（）屬于鞘亞綱、槍形目、柔魚科，其生命周期短、生長率高、繁殖力強，是一種極具開發(fā)潛力的頭足類海洋漁業(yè)資源。我國南海海域鳶烏賊資源豐富，其高值化加工利用是當前的熱點問題。冰島刺參（）屬于海參綱、枝手目、瓜參科，是我國市場上消費量較大的低值海參品種。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，南海鳶烏賊卵以及冰島刺參體壁中分別富含磷脂型DHA（DHA-enriched phospholipids，DHA-PL）和磷脂型EPA（EPA-enriched phospholipids，EPA-PL），且其對高脂飲食所致代謝綜合征具有良好預防作用。與其他分子形式DHA和EPA相比，DHA-PL和EPA-PL的生物利用率更高，且具有更好的抗氧化穩(wěn)定性。然而，目前鮮見DHA-PL和EPA-PL對LPS誘導的急性肝損傷影響的報道。因此，本研究考察DHA-PL和EPA-PL對LPS所致小鼠急性肝損傷的保護作用并初步分析其分子機制，以期為南海鳶烏賊和冰島刺參的高值化利用以及開發(fā)具有保肝護肝功效的新型海洋食品功能因子提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性6 周齡健康C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006，實驗動物使用許可證號：SYXK（魯）2020-0022。

南海鳶烏賊和冰島刺參 青島市南山水產(chǎn)市場；LPS 美國Sigma-Aldrich公司；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒 南京建成生物工程有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（增強型）和動物組織RNA提取試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 美國R&D Systems公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 日本TaKaRa公司；絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）如細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（phosphorylated-ERK1/2，p-ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、磷酸化JNK（phosphorylated-JNK，p-JNK）、p38、磷酸化p38（phosphorylated-p38，p-p38）、核因子（nuclear factor，NF）-κB p65、磷酸化NF-κB p65（phosphorylated-NF-κB p65，p-NF-κB p65）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）以及山羊抗兔免疫球蛋白G辣根過氧化物酶標記二抗 美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S-CW電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；5430R離心機 德國Eppendorf公司；Bioprep-24R制冷型生物樣品均質(zhì)儀 杭州奧盛儀器有限公司；Excelsior AS全自動組織脫水機、CTM6石蠟封片機和Gemini AS自動玻片染色機 美國Thermo Fisher Scientific公司；EC 350-1包埋機和HM 325切片機德國Microm公司；LightCycler 480實時熒光定量PCR系統(tǒng) 瑞士Roche公司；IX70型倒置熒光顯微鏡日本Olympus公司；Infinite M200 Pro多功能酶標儀瑞士TECAN公司。

1.3 方法

1.3.1 DHA-PL和EPA-PL的制備

參照課題組前期研究方法分別從南海鳶烏賊卵以及冰島刺參體壁中提取、分離和純化DHA-PL和EPA-PL。制備得到的DHA-PL和EPA-PL經(jīng)高效液相色譜法檢測純度分別為93.7%和92.5%。氣相色譜法分析結(jié)果顯示，DHA-PL中DHA質(zhì)量分數(shù)為38.3%，EPA-PL中EPA質(zhì)量分數(shù)為42.0%。

1.3.2 動物模型的建立和處理

32 只雄性6 周齡C57BL/6J小鼠于SPF級動物實驗室飼養(yǎng)，溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%、12 h/12 h光照循環(huán)。實驗期間小鼠自由飲食飲水。動物實驗嚴格遵照山東大學公共衛(wèi)生倫理委員會相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。小鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，按隨機數(shù)字表法分為4 組，每組8 只：正常對照組（Control）、模型組（LPS）、DHA-PL干預組（LPS+DHA-PL）和EPA-PL干預組（LPS+EPA-PL）?！吨袊用裆攀碃I養(yǎng)素參考攝入量（2013版）》中將成年人DHA+EPA的宏量營養(yǎng)素可接受范圍（acceptable macronutrient distribution ranges，AMDR）定為0.25～2.00 g/d，結(jié)合前期實驗結(jié)果，DHA-PL和EPA-PL分別制備成脂質(zhì)體并以400 mg/kg劑量連續(xù)給予小鼠灌胃28 d，灌胃體積為10 mL/kg。Control組和LPS組小鼠每天按20 mL/kg灌胃生理鹽水。第29天時，Control組小鼠經(jīng)腹腔注射無菌生理鹽水，其余小鼠腹腔注射劑量為10 mg/kg的LPS，注射體積為10 mL/kg，建立急性肝損傷模型。6 h后，小鼠摘眼球取血，室溫靜置30 min后，1 000×、4 ℃離心10 min，分離收集血清備用。隨后，小鼠引頸處死，取肝臟并稱質(zhì)量，計算肝指數(shù)（肝質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%），肝臟保存于-80 ℃進行后續(xù)實驗。

1.3.3 血清ALT和AST活力測定

按對應試劑盒說明書測定小鼠血清ALT和AST活力。

1.3.4 肝組織病理學檢查

取小鼠相同部位的肝組織置于10%中性福爾馬林溶液固定48 h，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋和切片等步驟制成4 μm厚的石蠟切片，蘇木精-伊紅染色后于光學顯微鏡下觀察各組小鼠肝組織病理學變化。

1.3.5 實時熒光定量PCR法測定促炎細胞因子mRNA相對表達水平

利用RNA柱式提取試劑盒提取各組小鼠肝組織中總RNA，檢測RNA濃度和完整性后取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計合成引物并以cDNA作為模板進行實時熒光PCR擴增。以作為內(nèi)參，根據(jù)2計算基因mRNA相對表達水平。本研究所用引物（表1）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 本研究所用基因引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.6 小鼠肝臟中促炎細胞因子含量的測定

稱取0.1 g小鼠肝組織，按1∶9（/）的比例加入預冷生理鹽水，在制冷型生物樣品均質(zhì)儀中勻漿，12 000×、4 ℃條件下離心15 min，收集組織勻漿上清液。利用ELISA檢測試劑盒分別測定小鼠肝組織上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，并使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測肝組織上清液蛋白質(zhì)量濃度進行標準化處理。

1.3.7 蛋白免疫印跡法檢測蛋白相對表達水平

稱取0.1 g小鼠肝組織，加入含蛋白酶/磷酸酶抑制劑和苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的RIPA裂解液，在制冷型生物樣品均質(zhì)儀中進行組織勻漿，測定蛋白濃度。將蛋白樣品高溫變性后，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），濕法轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-NF-κB p65、NF-κB p65和GAPDH一抗（1∶1 000，TBST稀釋），4 ℃孵育12 h，TBST洗滌3 次后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，TBST再次洗滌3 次后，通過增強型化學發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色，采用5200 multi全自動化學發(fā)光圖像處理系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）進行圖像分析，ImageJ軟件進行蛋白條帶灰度分析，以GAPDH作為內(nèi)參，分析目的蛋白的相對表達水平，蛋白的磷酸化水平以磷酸化蛋白與對應蛋白條帶灰度的比值表征。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗結(jié)果以平均值±標準差表示，采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，采用Tukey’s事后檢驗進行顯著性分析。當＜0.05時，表示組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 DHA-PL和EPA-PL對小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝指數(shù)的影響

如表2所示，各組小鼠體質(zhì)量無顯著性差異（＞0.05），但與Control組相比，LPS組小鼠肝臟質(zhì)量和肝指數(shù)極顯著升高（＜0.01），但DHA-PL和EPA-PL預防性干預可明顯抑制LPS所致小鼠肝質(zhì)量以及肝指數(shù)的增加。

表2 DHA-PL和EPA-PL對LPS處理后小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝指數(shù)的影響（n＝8）Table 2 Effects of DHA-PL and EPA-PL on body mass, liver mass and hepatic index in LPS-treated mice (n = 8)

2.2 DHA-PL和EPA-PL對小鼠血清ALT和AST活力的影響

ALT和AST是反映肝損傷最敏感的指標。如圖1所示，與Control組相比，LPS組小鼠血清ALT和AST活力極顯著升高（＜0.01），而DHA-PL和EPA-PL預防性干預可有效抑制ALT（＜0.01）和AST活力（＜0.01、＜0.05）的升高。

圖1 DHA-PL和EPA-PL對LPS處理后小鼠血清ALT（A）和AST（B）活力的影響Fig. 1 Effects of DHA-PL and EPA-PL on serum ALT (A) and AST (B)activities in LPS-treated mice

2.3 DHA-PL和EPA-PL對小鼠肝組織形態(tài)學變化的影響

各組小鼠肝組織蘇木精-伊紅染色結(jié)果如圖2所示，正常小鼠肝組織形態(tài)正常，肝細胞胞質(zhì)豐富，無病變、無壞死、無炎性細胞浸潤，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細胞索呈放射狀排列。LPS作用6 h后可見小鼠肝組織受損明顯，大量炎性細胞浸潤。DHA-PL和EPA-PL預防性干預后小鼠肝組織病變較輕，炎性細胞浸潤不明顯。上述結(jié)果提示，DHA-PL和EPA-PL預防性干預可有效保護LPS誘導的小鼠急性肝損傷。

圖2 DHA-PL和EPA-PL對LPS處理后小鼠肝組織形態(tài)學變化的影響（200×）Fig. 2 Effects of DHA-PL and EPA-PL on hepatic histopathology in LPS-treated mice (200 ×)

2.4 DHA-PL和EPA-PL對小鼠肝臟中促炎細胞因子表達的影響

如圖3所示，與Control組相比，LPS組小鼠肝臟中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達水平和含量極顯著升高（＜0.01）；DHA-PL和EPA-PL預防性干預可極顯著抑制LPS誘導的TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達水平以及含量的增加（＜0.01）。

圖3 DHA-PL和EPA-PL對LPS處理后小鼠肝臟中促炎細胞因子mRNA相對表達水平（A）和含量（B）的影響Fig. 3 Effects of DHA-PL and EPA-PL on mRNA levels (A) and contents (B) of pro-inflammatory cytokines in LPS-treated mice

2.5 DHA-PL和EPA-PL對小鼠肝臟中MAPK和NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白表達水平的影響

MAPK和NF-κB信號通路被認為是介導炎癥反應的關(guān)鍵信號通路。蛋白免疫印跡實驗結(jié)果顯示，與Control組相比，LPS組小鼠肝臟中p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK、p-p38/p38及p-NF-κB p65/NF-κB p65極顯著上調(diào)（＜0.01）；DHA-PL和EPA-PL預防性干預可有效抑制ERK1/2、JNK、p38以及NF-κB p65蛋白的磷酸化（圖4）。上述結(jié)果提示DHA-PL和EPA-PL可能通過抑制MAPK和NF-κB信號通路的激活改善LPS誘導的肝組織炎癥反應。

圖4 DHA-PL和EPA-PL對LPS處理后小鼠肝臟中MAPKs和NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白表達水平的影響Fig. 4 Effects of DHA-PL and EPA-PL on protein expression of key factors involved in MAPKs and NF-κB signaling pathways in LPS-treated mice

3 討 論

急性肝損傷是以肝功能迅速惡化為臨床特點的急性綜合征，嚴重者會出現(xiàn)肝臟大面積壞死甚至肝衰竭，病死率較高。研究表明，腸道來源的內(nèi)毒素是造成肝功能損傷的重要因素，在LPS刺激下，肝竇狀隙內(nèi)的枯否細胞發(fā)生M1型極化，可分泌大量促炎細胞因子，導致肝細胞損傷，并可分泌趨化因子招募中性粒細胞和單核細胞進入肝臟，進一步加重炎癥介導的肝損傷。

南海鳶烏賊卵和冰島刺參體壁富含DHA和EPA，且主要結(jié)合在甘油磷脂的-2位上，磷脂在小腸中被磷脂酶A催化釋放游離型DHA和EPA以及溶血磷脂，溶血磷脂在小腸細胞中重新合成磷脂，被機體吸收利用。研究發(fā)現(xiàn)，-3系多不飽和脂肪酸和磷脂具有護肝作用，但鮮見DHA-PL和EPA-PL對急性肝損傷影響的報道。因此，本研究通過腹腔注射LPS模擬急性肝損傷的病理過程，考察DHA-PL和EPA-PL對急性肝損傷是否具有保護作用。當肝組織受損時，肝細胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，通透性增加，導致肝細胞中ALT和AST大量釋放入血，從而使血清中ALT和AST活力升高。通過比較各組小鼠血清中ALT和AST活力發(fā)現(xiàn)，DHA-PL和EPA-PL預防性干預可顯著降低LPS暴露引起小鼠血清ALT和AST活力的升高（＜0.01、＜0.05），提示DHA-PL和EPA-PL能有效緩解LPS誘導的肝細胞損傷。肝組織病理學結(jié)果顯示，DHA-PL和EPA-PL預防性干預可明顯減少LPS誘導的小鼠肝細胞中炎性細胞浸潤，保護肝組織結(jié)構(gòu)正常。促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6等作為反映炎癥水平的指標，在急性肝損傷進程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DHA-PL和EPA-PL預防性干預可明顯下調(diào)LPS誘導的小鼠肝臟中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達水平和含量的升高，且其效果相近。上述結(jié)果提示，DHA-PL和EPA-PL可有效降低LPS誘導的急性肝損傷小鼠肝臟的炎癥水平。

MAPKs是哺乳動物細胞內(nèi)廣泛存在的一類絲、蘇氨酸蛋白激酶，目前研究最廣泛的是ERK1/2、JNK和p38。LPS可激活ERK1/2、JNK和p38，導致核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）活化后進入細胞核，進而促使肝組織中枯否細胞釋放大量炎癥介質(zhì)，誘發(fā)炎癥反應。NF-κB是炎癥反應中另一個重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，LPS可誘導其活性亞基p65進入細胞核，促使細胞內(nèi)TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細胞因子大量釋放，隨后進一步活化NF-κB，形成炎癥“瀑布效應”，加重肝損傷程度。本研究結(jié)果表明，LPS可誘導小鼠肝臟中ERK1/2、JNK、p38以及NF-κB p65磷酸化水平上升，DHA-PL和EPA-PL預防性干預可有效降低小鼠肝臟中上述蛋白的磷酸化水平。該結(jié)果提示DHA-PL和EPA-PL可能通過陰斷MAPK和NF-κB信號通路的激活進而發(fā)揮其對LPS誘導的小鼠急性肝損傷的保護作用。另外，本研究發(fā)現(xiàn)DHA-PL和EPA-PL保護LPS所致小鼠急性肝損傷的效果大致相同，這或許與雖然DHA對促炎細胞因子的抑制作用更加廣泛，但EPA-PL的消化吸收速率慢于DHA-PL，可使動物血液中EPA長時間維持在較高水平有關(guān)。

綜上，DHA-PL和EPA-PL均可有效保護LPS所致急性肝損傷，保護效果接近，且其抗炎保肝作用依賴于其對MAPK和NF-κB信號通路的調(diào)控。本研究結(jié)果為南海鳶烏賊和冰島刺參等水產(chǎn)品的高值化利用以及開發(fā)具有保肝護肝的新型保健食品提供了理論基礎(chǔ)。