陳柯瑾，徐梓涵，殷瑜華，祁艷艷，吳海燕，王芳，李干鵬

(云南民族大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)院，云南 昆明 650500)

脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1/氧化還原因子1(apurinic/apyrimidinic endonuclease1/redox factor1，APE1/Ref-1，簡稱APE1)具有DNA修復(fù)，氧化還原，參與RNA代謝等活性，同時它是氧化應(yīng)激引起細胞反應(yīng)的主要調(diào)控蛋白，在細胞DNA損傷修復(fù)，細胞增殖，凋亡和放化療效應(yīng)等多個細胞生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的作用[1].在由不同因素造成的DNA損傷中，AP位點的形成是其中最常見的損傷之一，AP位點的形成阻礙了DNA的復(fù)制，導(dǎo)致了基因突變和遺傳的不穩(wěn)定性，具有很強的誘變性和細胞毒性[2].AP位點主要由堿基切除進行修復(fù)(base excise repair，BER)，而這一修復(fù)過程由APE1啟動.APE1作為AP核酸內(nèi)切酶是BER主要限速酶之一，它的堿基切除修復(fù)活性能保護細胞免受外源性和內(nèi)源性不斷積聚的AP位點造成的細胞毒性，維持基因組的穩(wěn)定[3].

越來越多的研究表明APE1在多種惡性腫瘤組織中顯著高表達并具有異位性，臨床研究表明腫瘤組織中的APE1高表達和異位表達與患者預(yù)后不良密切相關(guān)，因此APE1被認為是惡性腫瘤的重要標志物之一[4].而目前大多數(shù)晚期惡性腫瘤的治療仍然是基于傳統(tǒng)放化療的綜合治療模式.然而，最初對于放化療有效的腫瘤細胞最終會因治療抵抗而導(dǎo)致腫瘤進展，這是腫瘤治療的瓶頸和難點.DNA損傷是放化療致傷腫瘤細胞的主要機制，而腫瘤細胞中有完善的DNA修復(fù)機制，可以快速修復(fù)放化療所致的DNA損傷，產(chǎn)生放化療抵抗[5].因此，DNA修復(fù)基因作為抗腫瘤的新靶點是目前研究的熱點.經(jīng)過前期大量的篩選和驗證工作，目前已經(jīng)有針對APE1不同活性的小分子抑制劑，包括針對其DNA修復(fù)活性的CRT0044876、InhibitorⅢ等[6-7]，以及針對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的小分子抑制劑E3330[8-9].

自2009年以來，關(guān)于APE1新型抑制劑的報道逐漸增多，但大部分工作集中于基于RNAi技術(shù)，抑制作用僅位于基因轉(zhuǎn)錄層面，無法對實際生物功能單位——蛋白來進行調(diào)控.部分新的工作基于已知的X線晶體結(jié)構(gòu)(1BIX)來判斷APE1與其DNA底物之間可能的相互作用，并使用基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計工具來進行蛋白質(zhì)-配體分子對接，進而對小分子藥物進行虛擬篩選.然而，高精度的分子對接模擬往往需要大量人工調(diào)試，并且計算復(fù)雜度大，對計算資源要求高.快速的對接模擬則容易出現(xiàn)偏差，降低后期藥理評估的成功率，帶來不必要的實驗成本.得益于深度學(xué)習(xí)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得的最新進展，基于深度學(xué)習(xí)的蛋白質(zhì)-配體結(jié)合親和力預(yù)測技術(shù)來實現(xiàn)快速，高精準度的藥物篩選逐漸成為可能.

為了對APE1進行基于結(jié)構(gòu)的大規(guī)模的虛擬藥物篩選，本論文擬從以下幾方面進行研究：前期針對大規(guī)模小分子數(shù)據(jù)庫(specs)運用基于深度學(xué)習(xí)的蛋白質(zhì)-配體結(jié)合親和力預(yù)測技術(shù)分別針對APE1DNA損傷修復(fù)功能域藥物活性位點，對該庫中的210 070個化合物與APE1結(jié)合能力進行快速虛擬篩選，獲得少數(shù)對APE1由潛在抑制活性的候選小分子抑制物；運用高精度的分子對接模擬軟件對候選的小分子抑制物進行2次篩選；最終獲得1～10種能夠與APE1活性區(qū)域特異性結(jié)合的小分子化合物，為進一步的針對目標化合物的藥理研究和應(yīng)用提供參考和指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 虛擬篩選軟件及材料

本研究使用的軟件有AutodockVina，PyMol，GOLD，DiscoveryStudio 2019.APE1的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)PDB文件來自Protein Data Bank(https://www.rcsb.org/)，小分子化合物及其結(jié)構(gòu)來自Specs數(shù)據(jù)庫(https://www.specs.net/).

1.2 藥品試劑及儀器

篩選小分子化合物單體由荷蘭Specs公司購入，化合物編號由Specs公司自主編錄(ID Number)；DMEM高糖培養(yǎng)基，CORNING公司；0.25% 胰酶-EDTA和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，Gibco公司；細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)，北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit細胞凋亡試劑檢測盒，YEASEN公司.MultiskanGO酶標儀(美國Thermo Fisher公司)； SC-04 低速離心機(ZONKIA 中佳公司)；CytoFELX流式細胞儀(Beckman Coulter公司)

1.3 蛋白質(zhì)模型和配體處理及優(yōu)化

APE1是由2個結(jié)構(gòu)域組成的球形α/β蛋白(結(jié)構(gòu)域1：殘基44～136和295～318；結(jié)構(gòu)域2：137～260和282～294)，整體尺寸為 4 nm.本虛擬篩選建立在1BIX的三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，APE1同源二聚體的射線晶體衍射結(jié)構(gòu)(PDB ID：1BIX)是目前已報道的APE1晶體結(jié)構(gòu)中分辨率最高的，該結(jié)構(gòu)的分辨率為 0.22 nm，包含了275個氨基酸殘基[10].從PDB數(shù)據(jù)庫中下載1BIX蛋白質(zhì)晶體的三維結(jié)構(gòu)之后應(yīng)用Discovery studio軟件的Protein Preparation Wizard模塊對蛋白結(jié)構(gòu)進行預(yù)處理.處理過程包括在1BIX晶體結(jié)構(gòu)中加入氫原子，刪除水分子，刪除雜基團，進行氫鍵網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)優(yōu)化.

APE1抑制劑的虛擬篩選是針對小分子數(shù)據(jù)庫(SPECS)進行的,該數(shù)據(jù)庫包含 210 070 個化合物分子.配體處理用Minimize Ligands功能完成，使用 Small Molecules|Prepare or Filter Ligands|Prepare Ligands對小分子進行預(yù)處理，并使用 Minimize Ligands進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化；包括3D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，加氫，中和帶電基團，產(chǎn)生生理條件下的離子化狀態(tài)，產(chǎn)生異構(gòu)體等.

1.4 確定APE1對接位點和活性參數(shù)

根據(jù)現(xiàn)有研究表明，APE1的修復(fù)活性位點位于其晶體結(jié)構(gòu)α/β夾層的頂部，并由環(huán)區(qū)域(loop regions)圍繞，活性位點與APE1修復(fù)抑制劑CRT0044876結(jié)合較為關(guān)鍵的氨基酸有Asn68, Asp70, Glu96, Arg177, Asn212, Asn229, Phe266, Trp280, Leu282, Asp308, His309等[11].

通過Receptor-Ligand Interactions | Define and EditBinding Site | From Current Selection 對蛋白質(zhì)進行模型構(gòu)建，同時根據(jù)APE1修復(fù)活性位點的關(guān)鍵氨基酸殘基信息得到活性位點，以 Asn68, Asp70, Glu96, Arg177, Asn212, Asn229, Phe266, Trp280, Leu282, Asp308, His309 為基礎(chǔ)找到結(jié)合位點，結(jié)合位點坐標(XYZ，26.953，11.238，22.062)，半徑 14.98.

1.5 基于深度學(xué)習(xí)算法的高通量篩選

本研究首先采用基于深度學(xué)習(xí)算法對蛋白質(zhì)-配體結(jié)合親和力進行預(yù)測，并篩選出親和力較強的 10 000 個備選小分子.選定PDBBind v2016 core set數(shù)據(jù)集，以9∶1比例將所有復(fù)合體分為訓(xùn)練集和測試集，對深度學(xué)習(xí)模型進行訓(xùn)練.如圖2為基于深度學(xué)習(xí)的蛋白質(zhì)-配體結(jié)合親和力預(yù)測模型.利用深度學(xué)習(xí)模型預(yù)測蛋白質(zhì)-配體結(jié)合親和力的工作流程如下：首先使用一鍵編碼和原子特征嵌入每個原子，然后使用圖注意力神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)將活性位點和配體的結(jié)構(gòu)信息編碼到它們相應(yīng)的原子嵌入中. 然后通過雙向變換器傳遞配體原子嵌入和活性位點原子嵌入的串聯(lián)序列. 最后沿嵌入的整個序列采用全局平均池化，然后將生成的矢量傳遞給多層感知器回歸變量，以獲得結(jié)合親和力預(yù)測.模型采用2個圖注意力網(wǎng)絡(luò)作為編碼器分別對復(fù)合體中的配體和活性位點進行編碼.編碼器會基于給定結(jié)構(gòu)的空間信息對結(jié)構(gòu)內(nèi)每個原子分配嵌入向量(embedding).編碼后將配體和活性位點的嵌入向量拼接成序列后輸入雙向Transformer模型進行處理，最終將輸出特征用多層感知機處理后輸出對復(fù)合體解離常數(shù)(pKa)的預(yù)測.訓(xùn)練過程中模型端到端地采用梯度下降進行優(yōu)化.訓(xùn)練結(jié)束后模型在測試集上進行pKa值的預(yù)測，達到了1.278的均方根誤差.

圖1 PyMol可視化的活性位點，綠色部分代表APE1蛋白結(jié)構(gòu)，紅色球形代表由氨基酸殘基組成的活性位點

圖2 基于深度學(xué)習(xí)的蛋白質(zhì)-配體結(jié)合親和力預(yù)測模型

1.6 AutoDock Vina標準精度和GOLD高精度篩選

主虛擬篩選是根據(jù)AutoDock Vina對深度學(xué)習(xí)算法篩選后所得的 10 000 個備選小分子根據(jù)半經(jīng)驗自由能函數(shù)，對蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的結(jié)合親和力分子以及多樣性進行評估.Autodock Vina使用迭代局部搜索算法進行構(gòu)型搜索.在這個過程中，使用AutoDockTools來處理PDBQT文件并計算受體網(wǎng)格.對接中使用的網(wǎng)格參數(shù)為center_x= 26.953， center_y= -11.238，center_z= 22.062，size_x= 40，size_y= 56， size_z= 64，exhaustiveness= 8.其余參數(shù)均采用默認值.

將得分最高的 2 000 個小分子使用FAFDrugs軟件的Drug-Like Soft、PAINS、ADMET規(guī)則對小分子進行類藥性篩選，將備選小分子根據(jù)篩選規(guī)則篩選出小分子化合物中分子量小于600，logP在1～5之間，同時化合物滿足氫鍵受體數(shù)量不超過10，氫鍵給體數(shù)量不超過5，對化合物檢測RO5、ADMET以及是否為假陽性等指標后篩選出147個化合物.最終，使用GOLD軟件將保留小分子按照對接精度從低到高進行虛擬篩選，最終綜合CHEMPLP的評分及AutoDock Vina對接能量結(jié)果得到活性最佳的20個化合物.

1.7 CCK-8細胞活性篩選實驗

采用CCK-8檢測方法，在HeLa細胞中進行20個化合物的細胞抑制率檢測.將HeLa細胞吹打成細胞懸液，以每孔不低于 3 000 個/100 μL,在96孔板中接種，對細胞進行24～48 h 的培養(yǎng)后，將20個小分子化合物配置成(10，20，40，80，160 μmol/L)等5個濃度梯度加入到96孔板中，放入到恒溫箱中培養(yǎng) 24 h 后按每孔 10 μL 的量加入CCK-8試劑液，在恒溫箱中孵育1～4 h,待顯色時間到后，在 450 nm 處用酶標儀測定每孔吸光度，檢測時間不超過 24 h.對數(shù)據(jù)結(jié)果繪制量化曲線并計算其IC50值.

1.8 流式細胞術(shù)檢測HeLa細胞在APE1靶向化合物作用下的凋亡

采用Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit雙標記流式細胞數(shù)檢測活性最優(yōu)的3個小分子作用于HeLa細胞的凋亡率.給藥 24 h 后收集HeLa細胞懸液，預(yù)冷PBS洗滌細胞后離心，將Binding Buffer、Annexin V-FITC、PI Staining Solution按照 20∶1∶2 的比例配置后加入收集的細胞中，避光孵育 15 min，在流式細胞儀下進行凋亡檢測.

1.9 PLIP配體相互作用分析

為得到配體和蛋白質(zhì)所具有的結(jié)合親和力，使用蛋白質(zhì)-配體相互作用分析儀(PLIP)進行全自動檢測和可視化3D結(jié)構(gòu)中的非共價蛋白-配體的相互作用結(jié)果，并對可視化結(jié)果進行蛋白質(zhì)-配體的相互作用分析.

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

各項實驗至少進行3次平行獨立實驗，結(jié)果均以平均值±標準差表示，數(shù)據(jù)分析和作圖采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進行.多組間比較采用單因素方差分析進行，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 小分子對接能量

表1中的數(shù)據(jù)，AutoDock Vina分數(shù)表示由AutoDock Vina提供的結(jié)合親和力預(yù)測.氫鍵的數(shù)目表示存由GOLD產(chǎn)生的蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物中的氫鍵的數(shù)目. GOLD Score表示由GOLD分配給蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的ChemPLP適應(yīng)性得分.IC50表示通過細胞活性篩選測得的每種化合物的半數(shù)最大抑制濃度.結(jié)果可以看出，20個小分子化合物與APE1結(jié)合能(-10.6～-15.7 kcal/mol)較CRT0044876抑制劑與APE1的結(jié)合能更好且GOLD評分更高(115.328～49.635)，故篩選結(jié)果具有一定的可靠性以及提供藥理實驗的依據(jù).

表1 CRT0044876抑制劑(陽性對照)和小分子化合物的AutoDock Vina氫鍵和對接能結(jié)果

2.2 CCK-8細胞活性篩選結(jié)果

經(jīng)過3次平行實驗得到20種化合物的IC50值，如表1所示.綜合小分子對接能量結(jié)果，最終得到AQ-390/42425574，AQ-390/42425872，AK-778/43413615 3個結(jié)合能較低，IC50值較低，活性最好的小分子化合物結(jié)構(gòu)見圖 3，經(jīng)過3次平行實驗證明3個化合物對HeLa細胞的抑制活性最佳且成一定的濃度依賴性，與順鉑作為陽性對照組相比，在 160 μmol/L 的濃度時其抑制活性與陽性藥接近，并繪制3種化合物的量化曲線圖(圖4).

圖3 篩選后在Specs數(shù)據(jù)庫中具有最佳對接活性的3個化合物

圖4 濃度為10、40、160 μmol/L的小分子化合物和陽性藥物作用于HeLa細胞(A～D)小分子化合物在10～160 μmol/L的濃度梯度下作用于HeLa細胞12～36 h(E～G)

為了進一步探究這3個小分子化合物對HeLa細胞的抑制是否與時間有關(guān)，測定HeLa細胞在160，80，40，20和 10 μ mol/L 濃度梯度的小分子化合物的作用下經(jīng)過12、24、36和 48 h 后的抑制活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小分子對HeLa細胞的抑制作用隨著時間的增強不斷提高，3個化合物在 36 h 時對HeLa細胞的抑制活性最強，抑制率達到40%～80%.其中化合物AQ390-42425574對HeLa細胞的抑制率具有顯著性差異(P<0.01).推測AQ390-42425574 對HeLa細胞增殖的抑制具有良好的作用.

2.3 HeLa細胞在APE1靶向化合物作用下的凋亡

根據(jù)AQ-390/42425574，AQ-390/42425872，AK-778/43413615的結(jié)果可知，以空白組(凋亡率：0.29%±0.23%)和順鉑組(凋亡率：2.63%±8.43%)為對照，化合物在 160 μmol/L 濃度作用下，具有促進細胞早期凋亡(Q1-LR)的趨勢，早期凋亡細胞明顯增加，晚期凋亡細胞(Q1-UR)對比空白組有增加，且較于陽性藥更優(yōu).

使用GraphPad prism8軟件對結(jié)果進行分析，根據(jù)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)其中AK-778/43413615化合物有明顯促進HeLa細胞凋亡的作用(AK-778/43413615凋亡率：9.93%±17.4%；AQ-390/42425574凋亡率：4.00%±4.82%；AQ-390/42425872凋亡率：5.49%±4.32%).

圖5 流式細胞術(shù)分析HeLa細胞凋亡； AK-778 / 43413615，AQ-390 / 42425574，AQ-390 / 42425872與控制組比較*P<0.05，**P<0.01

2.4 APE1蛋白-小分子復(fù)合體篩選結(jié)果

通過Discovery studio軟件中的Structure | Surface 模塊對APE1蛋白模型進行表面可視化后，得到3個小分子化合物與活性位點對接示意圖，使用Discovery Studio對活性位點進行可視化如圖6所示.

(a)AK-778/43413615 (b)AQ-390/42425574 (c)AQ-390/42425872

2.5 虛擬篩選小分子與APE1蛋白質(zhì)的相互作用模型分析

為了進一步了解實驗中虛擬篩選的小分子與APE1結(jié)合的相互作用模式，使用Discovery Studio軟件對其蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合方式進行二維可視化，結(jié)合PLIP配體相互作用分析結(jié)果，對小分子和蛋白質(zhì)結(jié)合方式進行分析.小分子AQ-390/42425872和APE1的結(jié)合圖(圖7 和圖8)中可以發(fā)現(xiàn)該小分子和APE1的A亞基的ARG-177形成氫鍵作用，并與VAL-180形成π-烷基的疏水作用，大大穩(wěn)定了蛋白質(zhì)復(fù)合體的構(gòu)象；并且該小分子的芳香體系與ARG-177產(chǎn)生了π-陽離子相互作用，對穩(wěn)定復(fù)合體，藥物靶點的結(jié)合起到了重要用，圖中深綠色虛線為氫鍵，粉色虛線為π-烷基作用力，橘色線為π-陽離子作用力.對比小分子AQ-390/42425574的結(jié)合圖(圖9 和圖10)可以看出小分子與APE1的A亞基的ARG-177形成3個氫鍵，并且與VAL-180，GLY-176，ARG-181等多個殘基產(chǎn)生了強烈的疏水作用，使得疏水基團進入疏水性的蛋白口袋，使整體的疏水性基團盡可能少的暴露在水溶液中，使蛋白質(zhì)復(fù)合體更加穩(wěn)定從而大大提高了活性.故結(jié)合小分子的結(jié)合能可以得出小分子AQ-390/42425872的結(jié)合能量不如AQ-390/42425574，應(yīng)該是與同母核的不同基團所產(chǎn)生的疏水作用以及形成的氫鍵數(shù)量不同有關(guān).從AK-778/43413615的結(jié)合圖(圖11 和圖12)可以看出該小分子與A亞基的ARG-177，VAL-180產(chǎn)生了疏水作用，并只形成1個氫鍵，故其結(jié)合能量遠不如其他2個化合物.將3個篩選化合物與 CRT0044876抑制劑做對比，由結(jié)合圖(圖13和圖14)可以看出該抑制劑與APE1的A亞基的ARG-177形成3個氫鍵，同時產(chǎn)生了疏水作用，但其結(jié)合能不如篩選小分子應(yīng)該是由于疏水作用較弱所產(chǎn)生的結(jié)果.

圖7 AQ-390/42425872分子與APE1對接作用力示意圖

圖8 AQ-390/42425872分子與APE1(PLIP)相互作用圖

圖9 AQ-390/42425574分子與APE1對接作用力示意圖

圖10 AQ-390/42425574分子與APE1(PLIP)相互作用圖

圖11 AK-778/43413615分子與APE1對接作用力示意圖

圖13 CRT0044876抑制劑與APE1對接作用力示意圖

圖14 CRT0044876抑制劑與APE1(PLIP)相互作用圖

3 結(jié)語

近年來以APE1為靶點開發(fā)的藥物已經(jīng)有了很多成功的例子，主要以修復(fù)抑制劑的研究較深入，目前獲得的修復(fù)活性抑制劑包括甲氧胺(MX)，CRT0044876，楊梅素(Myricetin)，6-羥基-左旋多巴和活性藍2(Reactive Blue2)等[6].其中其受體抑制劑的主要尋找方向是各個數(shù)據(jù)庫中的小分子化合物.通過計算機虛擬篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)其中3個化合物可以與APE1形成較好的蛋白質(zhì)復(fù)合體，并通過細胞藥理實驗驗證篩選小分子對HeLa細胞增殖具有較好的抑制作用，之后可再通過更深入的藥理實驗進一步驗證虛擬篩選的結(jié)果是否具有較好的藥物效果以及化合物是否對APE1有較強的體內(nèi)抑制作用.本研究從Specs數(shù)據(jù)庫的 210 070個化合物中發(fā)現(xiàn)了可以與APE1結(jié)合較好的化合物.說明實驗使用的虛擬篩選技術(shù)能夠深入挖掘小分子化合物與相應(yīng)受體的結(jié)合可能性，且實驗結(jié)果還可為繼續(xù)研究這些化合物的潛在藥性，活性中心，開發(fā)新的化合物等研究熱點提供基礎(chǔ)資料.