秦 婉，綦雅琳，杲銀芳，范 楠，云 宇，段為鋼

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué) 云南省中醫(yī)藥學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，云南 昆明 650500)

隨著高尿酸血癥成為危害人類健康的“第四高”[1]，通過飲食調(diào)節(jié)控制血尿酸水平成為一個(gè)熱門話題[2-3].血尿酸水平受尿酸來源和排泄的影響.尿酸的來源除了自身內(nèi)源性嘌呤外(約占2/3)，還與食物攝入有關(guān)；尿酸的排泄則涉及到尿液排泄(占2/3以上)和糞便排泄.尿酸為酸性物質(zhì)，有研究發(fā)現(xiàn)攝入堿性物質(zhì)有利于尿酸溶解從而促進(jìn)尿酸排泄[4-6].酸堿性食物和乙醇對(duì)血尿酸的影響目前主要來自民間或臨床經(jīng)驗(yàn)，或普通動(dòng)物造模后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[7]，缺乏系統(tǒng)的研究.基于前期的初步結(jié)果[8]，本研究采用嘌呤代謝與人類高度相似的尿酸酶缺失動(dòng)物昆明-DY大鼠對(duì)以上因素進(jìn)行進(jìn)一步追蹤，為降尿酸提供更可靠的參考.

1 材料和方法

1.1 材料

雄性昆明-DY大鼠(尿酸酶缺失大鼠)，課題組自行繁育.尿酸檢測試劑盒(磷鎢酸法)，南京建成生物工程研究所生產(chǎn).氨丁三醇(Tris堿，>99.9%),BioFroxx(www.biofroxx.com)生產(chǎn).冰醋酸(分析純),生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn).鹽酸(分析純),云南楊林開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司生產(chǎn).碳酸氫鈉(分析純),天津市化學(xué)試劑三廠生產(chǎn).無水乙醇(分析純)和氯化鈉(分析純)天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn).結(jié)晶乙酸鈉(分析純),天津市北辰方正試劑廠生產(chǎn).某品牌弱堿性礦泉水(pH9.3)購于市場，符合標(biāo)準(zhǔn)GB8537.酶標(biāo)儀(K6600-A),北京凱奧科技發(fā)展有限公司制造.

1.2 溶液配制

將碳酸氫鈉加純凈水配置成0.5和 1.5 g/L 溶液，檢測其pH(約為8.4).將氨丁三醇加純凈水?dāng)M配制成5或 15 g/L 溶液，分別加入冰醋酸或濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為8.4，制得醋酸氨丁三醇和鹽酸氨丁三醇，使用時(shí)稀釋10倍.醋酸鈉(pH6.8)、醋酸和氯化鈉直接加純凈水配置成0.5或 1.5g/L 溶液(醋酸溶液約pH3.0，氯化鈉溶液pH6.5).鹽酸加水配制成 0.5 g/L 溶液(pH2.0)，無水乙醇則加水配置成 4 mL/L 溶液(pH6.8).

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將 45 d 日齡的雄性昆明-DY大鼠飼養(yǎng)于20～24 ℃ 環(huán)境，模擬自然光照，選擇血尿酸在 40 μg/mL 以上的大鼠按照繁育批次，依次分成16組，每組6只，即正常組(Normal)、醋酸氨丁三醇(TrisAc)2組(0.5和 1.5 g/L)、鹽酸氨丁三醇(TrisCl)2組(0.5和 1.5 g/L)、碳酸氫鈉(NaHCO3)2組(0.5和 1.5 g/L)、氯化鈉(NaCl)2組(0.5和 1.5 g/L)、醋酸(HAc)2組(0.5和 1.5 g/L)、鹽酸(HCl)組(0.5 g/L)乙醇(EOH)組(4 mL/L)和弱堿性礦泉水(T9.3)組.實(shí)驗(yàn)前后給大鼠稱重，斷尾取血制備血清以檢測血尿酸水平.實(shí)驗(yàn)前后將動(dòng)物單個(gè)置于代謝籠中以收集 24 h 尿液和糞便，記錄 24 h 進(jìn)食量和飲水量.其余時(shí)間將動(dòng)物放回鼠籠，T9.3組大鼠自由飲用弱堿性礦泉水，其他組用配置好的溶液代替自由飲水.所有大鼠不限制飲食.該大鼠 1 d 內(nèi)攝入 0.5 g/L 溶液的量，相當(dāng)于人(70 kg)1 d 攝入 1.68 g.

1.4 尿酸檢測

收集的血液樣品凝固后于 3 000 g 離心 5 min 制備血清，血清直接用于尿酸檢測.收集到的尿液混勻后吸取 1 mL 作為樣品，用 50 mmol/L 碳酸氫鈉溶液稀釋20倍后檢測尿酸含量.收集到的糞便則加入3倍重量的 100 mmol/L 氨丁三醇溶液，置于搖床上 140 r/min 振搖 4 h， 10 000 g 離心 5 min 取上清 1 mL 用于檢測尿酸含量.尿酸的含量測定方法則按照廠家提供的說明書進(jìn)行.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)

數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示.由于動(dòng)物血清尿酸以及多種指標(biāo)可能存在日齡波動(dòng)，以正常組指標(biāo)的前后變化為對(duì)照，計(jì)算各組多個(gè)指標(biāo)(血尿酸、24 h 尿量、尿液尿酸濃度、24 h 尿液尿酸總量、24 h 糞便、糞便尿酸含量、24 h 糞便尿酸總量、尿酸排泄總量、24 h 進(jìn)食量、飲水量和體重)前后的變化值(即，實(shí)驗(yàn) 14 d 時(shí)的值-實(shí)驗(yàn)前的值).為了考察處理因素對(duì)體重的影響以及因體重變化帶來的差異，則將“相對(duì)體重增加值”(公式1)和其他多個(gè)相對(duì)指標(biāo)(24 h 相對(duì)排尿量、24 h 相對(duì)尿液尿酸總量、24 h 相對(duì)排便量、24 h 相對(duì)糞便尿酸總量、相對(duì)尿酸排泄總量、24 h 相對(duì)進(jìn)食量和 24 h 相對(duì)飲水量)校正為 200 g 大鼠的指標(biāo)(公式2)，在此基礎(chǔ)上再比較各指標(biāo)的前后變化值(即，實(shí)驗(yàn) 14 d 時(shí)的值-實(shí)驗(yàn)前的值).實(shí)驗(yàn)前后血清尿酸、尿液尿酸和糞便尿酸含量的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，其他各組之間的指標(biāo)采用方法分析，若存在組間差異，兩兩比較采用LSD法(方差齊性)或Tamhane′s T2法(方差不齊).以P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

(1)

(2)

2 結(jié)果

如圖1所示，考察了多個(gè)因素處理14 d后對(duì)昆明-DY大鼠尿酸水平的影響(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n=6).其中因素如下所示：Normal，正常組，自由飲用自來水；TrisAc (g/L)，醋酸氨丁三醇；TrisCl (g/L)，鹽酸氨丁三醇；NaHCO3(g/L)，碳酸氫鈉；NaAc (g/L)，醋酸鈉；NaCl (g/L)，氯化鈉；HAc (g/L)，醋酸；HCl (g/L)，鹽酸；EOH (mL/L)，乙醇；T9.3，堿性礦泉水；W0，實(shí)驗(yàn)前；W2，實(shí)驗(yàn) 14 d.*P<0.05，配對(duì)t檢驗(yàn).

2.1 昆明-DY大鼠血清尿酸(SUA)水平的前后變化

總體上，在實(shí)驗(yàn)前后正常組昆明-DY大鼠的血清尿酸水平較為穩(wěn)定.不同組大鼠實(shí)驗(yàn)前的血清尿酸水平雖存在一定差異，但均處于較高水平.在處理因素中，口服醋酸氨丁三醇(1.5 g/L)、鹽酸氨丁三醇(1.5 g/L)、碳酸氫鈉(1.5 g/L)、氯化鈉(0.5和 1.5 g/L)和鹽酸(0.5 g/L)溶液能明顯降低昆明-DY大鼠的血清尿酸水平.而醋酸鈉(0.5 g/L)和乙醇(4 mL/L)則能升高血清尿酸水平.弱堿性礦泉水對(duì)血清尿酸水平無明顯影響(圖1a).

2.2 昆明-DY大鼠尿液尿酸(UUA)水平的前后變化

實(shí)驗(yàn)前后正常組昆明-DY大鼠的尿液尿酸水平相對(duì)穩(wěn)定.不同組大鼠實(shí)驗(yàn)前的尿液尿酸水平存在一定差異，其變異程度較血清尿酸更大.在處理因素中，醋酸氨丁三醇(0.5 g/L)、醋酸鈉(1.5 g/L)和乙醇(4 mL/L)能升高尿液尿酸水平，氯化鈉則能降低尿液尿酸.有趣的是，碳酸氫鈉高低濃度對(duì)大鼠的尿液尿酸水平表出現(xiàn)不同效果.鹽酸氨丁三醇、醋酸、鹽酸和弱堿性礦泉水對(duì)尿液尿酸水平無明顯影響(圖1b).

2.3 昆明-DY大鼠糞便尿酸(StUA)水平的前后變化

實(shí)驗(yàn)后正常組昆明-DY大鼠的糞便尿酸含量明顯升高.不同組大鼠實(shí)驗(yàn)前的糞便尿酸含量存在較大差異，其變異程度較尿液尿酸更大.在處理因素中，醋酸鈉(0.5 g/L)和乙醇(4 mL/L)也能升高糞便尿酸含量，所有因素均不能降低糞便尿酸含量.醋酸氨丁三醇、鹽酸氨丁三醇、碳酸氫鈉、氯化鈉、醋酸、鹽酸和弱堿性礦泉水對(duì)糞便尿酸含量均無明顯影響(圖1c).

圖1 多個(gè)因素處理14 d后對(duì)昆明-DY大鼠尿酸含量的影響

2.4 多種處理因素對(duì)昆明-DY大鼠多種指標(biāo)前后變化的影響

為了進(jìn)一步研究尿酸來源和排泄對(duì)血尿酸影響的可能機(jī)理，特以正常大鼠的指標(biāo)變化為參照，考察昆明-DY相關(guān)因素的前后變化.由表1可見，正常昆明-DY大鼠血尿酸水平、24 h 尿量、24 h 尿液尿酸和 24 h 排尿酸總量有負(fù)向波動(dòng)，其他多個(gè)指標(biāo)則有正向波動(dòng).與正常組大鼠前后變化指標(biāo)值相比，醋酸氨丁三醇(0.5 g/L)、碳酸氫鈉(0.5 g/L)、醋酸鈉(1.5 g/L)和乙醇(4 mL/L)可增加 24 h 尿液尿酸排泄，氯化鈉(0.5 g/L)卻減少 24 h 尿液尿酸排泄；醋酸氨丁三醇(1.5 g/L)、鹽酸氨丁三醇(1.5 g/L)和氯化鈉(1.5 g/L)減少了 24 h 糞便尿酸排泄，乙醇(4 mL/L)增加了 24 h 糞便尿酸排泄.從尿酸排泄總量看，醋酸氨丁三醇在不同劑量出現(xiàn)矛盾效應(yīng)，鹽酸氨丁三醇(1.5 g/L)、氯化鈉(0.5 g/L)減少了尿酸總排泄量，而碳酸氫鈉(0.5 g/L)、醋酸鈉(1.5 g/L)、醋酸(1.5 g/L)、鹽酸(0.5 g/L)和堿性礦泉水增加了尿酸排泄總量.

表1 因素對(duì)多種指標(biāo)前后變化(后-前)的影響(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n=6)

2.5 將指標(biāo)用體重校正后，多種因素對(duì)昆明-DY大鼠多種指標(biāo)前后變化的影響

為了排除體重因素的干擾，將總量性指標(biāo)進(jìn)行體重校正，結(jié)果如表2所示.與正常組相比，醋酸氨丁三醇(1.5 g/L)、鹽酸氨丁三醇(1.5 g/L)、碳酸氫鈉(0.5 g/L)、醋酸、鹽酸和乙醇能抑制大鼠體重增長.碳酸氫鈉(1.5 g/L)能減少尿液尿酸排泄總量.醋酸氨丁三醇(0.5 g/L)、碳酸氫鈉(0.5 g/L)、醋酸鈉(1.5 g/L)、醋酸(1.5 g/L)和乙醇能增加相對(duì)尿酸排泄總量，而氯化鈉(0.5 g/L)能減少相對(duì)尿酸排泄總量.此外，以上因素對(duì)大鼠其他多個(gè)校正指標(biāo)的前后值也有不同程度的影響.為了便于觀察，基于圖1和表2的結(jié)果進(jìn)一步定性歸納于表3中.

表2 飲食因素對(duì)多種指標(biāo)用體重校正后的影響(后-前)(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n=6)

表3 幾種因素的降尿酸效果歸納

3 討論

昆明-DY大鼠為課題組基于SD大鼠自主研發(fā)的尿酸酶缺失大鼠，與尿酸酶缺失小鼠不同[9]，其血尿酸水平相對(duì)穩(wěn)定且與人相似[8, 10-11].由于避開了造模劑的干擾[7]，可以更好地模擬人的血尿酸水平并評(píng)價(jià)食物和藥物對(duì)血尿酸的影響.

從本研究結(jié)果看，有機(jī)堿氨丁三醇和無機(jī)堿碳酸氫鈉都有一定的降血尿酸作用，且有機(jī)堿(醋酸氨丁三醇)更具有降尿酸的優(yōu)勢(shì).醋酸鈉雖可以視為堿性物質(zhì)(醋酸部分可以完全分解)，但并沒有降血尿酸作用，令人意外的是還能升高血尿酸.此外，氯化鈉和稀鹽酸竟然也具有一定的降血尿酸作用，而醋酸對(duì)血尿酸無影響.這說明有機(jī)堿和無機(jī)陰離子(氯離子和碳酸氫根離子)對(duì)降尿酸有利.同時(shí)，本研究用昆明-DY大鼠再次證明乙醇可以升高血尿酸，同時(shí)還全面增加了尿酸的排泄，由于乙醇并沒有增加進(jìn)食，這說明乙醇能大幅度增加體內(nèi)尿酸的生成[12].值得一提的是，與文獻(xiàn)報(bào)道不同[13]，pH為9.3的弱堿性礦泉水并未觀察到降尿酸效果，可能與里面的堿性物質(zhì)含量較少(偏硅酸鹽約為 25 mg/L)有關(guān)，這也說明，堿性強(qiáng)弱只是降血尿酸的一方面，同時(shí)還必須有一定的堿性物質(zhì)濃度.

由于血尿酸升高首先受害的器官是腎臟，傳統(tǒng)降尿酸一方面要通過腎臟加快尿酸排泄，另一方面腎臟的尿酸負(fù)荷過大又對(duì)腎臟不利，這是一對(duì)矛盾[14-15].從尿液尿酸含量來看，只有氯化鈉在降尿酸的同時(shí)會(huì)降低尿液尿酸含量，這似乎對(duì)腎臟有利.然而，一般認(rèn)為鈉離子的過多攝入也會(huì)增加腎臟的負(fù)荷，對(duì)心血管也是不利的[16].而其他具有降尿酸作用的氨丁三醇鹽、碳酸氫鈉和稀鹽酸在劑量較低時(shí)(0.5 g/L)會(huì)增加尿液尿酸濃度排泄，而碳酸鈉在劑量較大時(shí)(1.5 g/L)會(huì)減少尿液尿酸濃度.由于氨丁三醇不吸收，有機(jī)酸醋酸又可以被機(jī)體完全分解，其影響尿液尿酸的排泄屬于繼發(fā)作用，因此醋酸氨丁三醇本身不會(huì)帶入無機(jī)離子而增加腎臟負(fù)擔(dān)或心血管風(fēng)險(xiǎn).

雖然氨丁三醇鹽、碳酸氫鈉、氯化鈉和稀鹽酸具有一定的降尿酸作用，其機(jī)理可能各不相同.根據(jù)表3的總結(jié)，可以確定是氯化鈉的降尿酸作用不涉及增加尿酸排泄，繼而推測可能與調(diào)節(jié)嘌呤代謝有關(guān)，而乙醇增加血尿酸的主要原因是增加了尿酸的生成，其增加尿酸排泄屬于一種代償行為[12].而醋酸氨丁三醇、鹽酸氨丁三醇和稀鹽酸的降尿酸機(jī)理較為復(fù)雜，可能既涉及尿酸排泄又涉及尿酸的生成，需要進(jìn)一步研究.

昆明-DY大鼠 45 d 日齡的飲水量約為 60 mL/200 g，高于同齡野生型SD大鼠(40 mL/200 g)[17].因此，大鼠飲用0.5和 1.5 g/L 溶液相當(dāng)日給藥劑量分別為150和 450 mg/kg，約等于成人(70 kg)每天服用1.68和 5.04 g.由于氨丁三醇鹽尚無口服制劑，碳酸氫鈉口服降尿酸的療效是肯定的，但要考慮鈉離子對(duì)心血管的不利影響.因尿酸在高濃度碳酸氫鈉中的溶解度會(huì)快速下降，因此服用碳酸氫鈉時(shí)要防止尿液中尿酸結(jié)晶.日常已經(jīng)有食鹽攝入，人類血尿酸的維持可能已經(jīng)有氯化鈉的貢獻(xiàn)，過多食鹽攝入雖然對(duì)降尿酸可能有利，但會(huì)增加心血管風(fēng)險(xiǎn). 值得一提的是，飲酒的確對(duì)控制血尿酸不利，本研究大鼠攝入的乙醇約為 1.2 mL/kg，相當(dāng)于成人攝入 13.44 mL/d 乙醇(約等于飲用 34 mL 40o白酒，而此劑量很容易在餐桌上突破)，建議尿酸較高者還是戒酒為好.

在以上因素中，氨丁三醇醋酸鹽有望在降尿酸治療中發(fā)揮更大的作用.遺憾的是，雖然氨丁三醇有醫(yī)用注射劑，但其醋酸鹽口服制劑有待研制.