張苗，何德嬌，凌娜，李小麗，梁軼嵐，張麗麗，胡威

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)簡(jiǎn)稱腎癌，是常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。RCC對(duì)化療和放療的敏感性低，僅有少數(shù)患者可通過(guò)免疫治療獲效[2]。RCC患者5年生存率相對(duì)較低，尤其是RCC伴轉(zhuǎn)移患者5年生存率不超過(guò)10%[3]。FK506結(jié)合蛋白(FK506-binding proteins，F(xiàn)KBPs)在多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，參與調(diào)控癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移等[4-6]。FK506結(jié)合蛋白11(FK506-binding protein 11，F(xiàn)KBP11)的基因表達(dá)水平與RCC患者的預(yù)后密切相關(guān)，可作為潛在標(biāo)志物評(píng)估RCC患者的預(yù)后[7]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)/Smad同源物3(mothers against decapentaplegic homolog 3, Smad3)信號(hào)通路參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等過(guò)程[8-9]。本研究通過(guò)觀察下調(diào)FKBP11對(duì)RCC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移及TGF-β1/Smad3通路的影響，探討其在RCC中可能的作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細(xì)胞：人正常腎小管上皮細(xì)胞系HK-2和RCC細(xì)胞系A(chǔ)498、ACHN、CaKi-1、786-O均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。(2)試藥、劑試：DEME培養(yǎng)基、胰蛋白酶及CCK-8試劑盒均購(gòu)自美國(guó)BPB公司；Lipofectamine 2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogeng公司；Trizol試劑、qRT-PCR反應(yīng)試劑盒、LY364947(TGF-β1/Smads通路抑制劑)、ECL發(fā)光試劑及結(jié)晶紫均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；FKBP11 siRNA(si-FKBP11)和其陰性對(duì)照siRNA購(gòu)自廣州Ruibo公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；一抗兔抗人FKBP11、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、凋亡抑制蛋白(Twist)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Snail)、TGF-β1、β-actin、Smad3及磷酸化Smad3(p-Smad3)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。(3)儀器、設(shè)備：MG80型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于上海冠森生物科技有限公司；MultiskanTMFC型酶標(biāo)儀、Applied Biosystems型qRT-PCR儀、NERLTM型流式細(xì)胞儀及E-Gel Imager型凝膠成像儀均購(gòu)自美國(guó)Themo Fisher Scientific公司，TS100型倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2020年3月—2021年3月于武漢大學(xué)人民醫(yī)院生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人正常腎小管上皮細(xì)胞系(HK-2)和RCC細(xì)胞系(A498、ACHN、CaKi-1、786-O)培養(yǎng)于DEME培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中，在含5% CO2、飽和濕度的37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞融合程度超過(guò)80%以上時(shí)，更換培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。用于檢測(cè)FKBP11的mRNA和蛋白表達(dá)水平。

1.2.2 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的786-O細(xì)胞，以2×105個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80%時(shí)，將細(xì)胞分為4組，正常培養(yǎng)細(xì)胞作為空白組，其余3組按照Lipofectamine 2000試劑盒說(shuō)明書分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA、si-FKBP11及si-FKBP11+LY364947 3 μl[9]，依次作為對(duì)照組、si-FKBP11組和si-FKBP11+LY364947組，轉(zhuǎn)染24 h后檢測(cè)各組細(xì)胞中FKBP11 mRNA和蛋白表達(dá)水平。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 不同細(xì)胞系中FKBP11的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)：收集HK-2和RCC細(xì)胞，加入Trizol裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞的總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，通過(guò)熒光定量PCR測(cè)定FKBP11的mRNA表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s，95℃ 5 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。FKBP11引物：上游5’-GGCGTAGGCGATTGGTTCCTA-3’，下游5’-CCATTCCATTCAT-TTCTCTGGATCG-3’。GAPDH(內(nèi)參)引物：上游5’-CCCATGGCAAGTTCAAAGGCA-3’，下游5’-TGGTGAAGACGCCAGTAGATT-3’。以2-△△CT計(jì)算細(xì)胞中FKBP11的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 免疫印記(Western-blot)檢測(cè)細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平：蛋白裂解液從細(xì)胞中提取總蛋白。取蛋白樣品使用SDS-PAGE膠電泳分離100 min，通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，隨后添加5%脫脂牛奶在室溫下封閉2 h，隨后加入一抗：FKBP11、PCNA、E-cadherin、Vimentin、Twist、Snail、TGF-β1、Smad3、p-Smad3和β-actin低溫過(guò)夜孵育，添加二抗孵育2 h，添加ECL化學(xué)發(fā)光混合液反應(yīng)5 min，在凝膠成像儀中觀察拍照。使用Image J軟件分析條帶灰度值。蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白的灰度值。

1.3.3 786-O細(xì)胞增殖檢測(cè)：CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。取各組處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的786-O細(xì)胞，以細(xì)胞密度為5×103個(gè)/ml接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，每孔依次添加CCK-8溶液10 μl，再繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的光密度值(IOD)，以光密度值來(lái)表示細(xì)胞的增殖活力。

集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞集落形成情況，各組處理后的786-O細(xì)胞1×103個(gè)接種在6孔板中孵育2周。4%多聚甲醛固定細(xì)胞后通過(guò)1%結(jié)晶紫染色，通過(guò)顯微鏡拍照集落形成情況。對(duì)超過(guò)50個(gè)細(xì)胞的集落進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.4 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組786-O細(xì)胞的侵襲和遷移數(shù)目：在Transwell小室中預(yù)涂Matrigel基質(zhì)膠50 μl，干燥備用。取各組處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的786-O細(xì)胞，添加無(wú)血清的培養(yǎng)基重懸調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104個(gè)/ml，后吸取細(xì)胞懸浮液200 μl接種Transwell小室上室中，下室添加含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，取出小室，使用PBS沖洗2～3次，添加甲醇固定細(xì)胞，后用棉簽輕輕擦拭掉上室細(xì)胞，將下室細(xì)胞用1%結(jié)晶紫染色30 min，在顯微鏡視野下觀察，分別選取左上、右上、中部、左下及右下5個(gè)視野，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)目。遷移實(shí)驗(yàn)不需要添加基質(zhì)膠，其余操作方法同侵襲實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同細(xì)胞系中FKBP11表達(dá)水平比較 與正常腎小管上皮細(xì)胞系HK-2比較，RCC細(xì)胞系A(chǔ)498、ACHN、CaKi-1、786-O中FKBP11 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表1。其中FKBP11在786-O細(xì)胞中表達(dá)最高，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)以786-O細(xì)胞為研究對(duì)象。

圖1 Western blot檢測(cè)RCC細(xì)胞與正常腎小管上皮細(xì)胞中FKBP11蛋白表達(dá)水平

表1 正常腎小管上皮細(xì)胞與RCC細(xì)胞中FKBP11表達(dá)水平比較

2.2 各組786-O細(xì)胞中FKBP11表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，si-FKBP11組FKBP11 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)；空白組與對(duì)照組，si-FKBP11組與si-FKBP11+LY364947組細(xì)胞中FKBP11的mRNA和蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2、表2。

表2 各組786-O細(xì)胞中FKBP11 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

2.3 各組786-O細(xì)胞增殖活力比較 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，各組786-O細(xì)胞的增殖活力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)48、72 h后，與對(duì)照組比較，si-FKBP11組786-O細(xì)胞增殖活力明顯降低(P<0.05)；與si-FKBP11組比較，si-FKBP11+LY364947組786-O細(xì)胞增殖活力明顯降低(P<0.05)；而空白組與對(duì)照組786-O細(xì)胞增殖活力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，集落形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與對(duì)照組比較，si-FKBP11組集落形成明顯減少(P<0.05)；與si-FKBP11組比較，si-FKBP11+LY364947組786-O細(xì)胞集落形成數(shù)量顯著降低(P<0.05)；而空白組與對(duì)照組786-O細(xì)胞集落形成數(shù)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，見(jiàn)圖3、表3。

表3 各組786-O細(xì)胞增殖情況比較

A.空白組；B.對(duì)照組；C.si-FKBP11組；D.si-FKBP11+LY364947組

圖3 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖比較

2.4 各組786-O細(xì)胞侵襲和遷移能力比較 與對(duì)照組比較，si-FKBP11組786-O細(xì)胞中侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)；與si-FKBP11組比較，si-FKBP11+LY364947組786-O細(xì)胞中侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)；而空白組與對(duì)照組786-O細(xì)胞中侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4、表4。

表4 各組786-O細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目比較個(gè))

圖4 各組786-O細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(×200)

2.5 各組786-O細(xì)胞中PCNA、E-cadherin、Vimentin、Twist和Snail蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，si-FKBP11組786-O細(xì)胞中PCNA、Vimentin、Twist和Snail蛋白水平顯著降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與si-FKBP11組比較，si-FKBP11+LY364947組786-O細(xì)胞中PCNA、Vimentin、Twist和Snail蛋白水平顯著降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平顯著升高(P<0.05)；而空白組與對(duì)照組786-O細(xì)胞中上述蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖5、表5。

表5 各組786-O細(xì)胞中PCNA、E-cadherin、Vimentin、Twist和Snail蛋白水平比較

注：A.空白組；B.對(duì)照組；C.si-FKBP11組；D.si-FKBP11+LY364947組

2.6 各組786-O細(xì)胞中TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表達(dá)水平比較 各組786-O細(xì)胞中Smad3蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，si-FKBP11組786-O細(xì)胞中TGF-β1和p-Smad3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與si-FKBP11組比較，si-FKBP11+LY364947組786-O細(xì)胞中TGF-β1和p-Smad3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；而空白組與對(duì)照組786-O細(xì)胞中TGF-β1和p-Smad3蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖6、表6。

表6 各組786-O細(xì)胞中TGF-β1和Smad3、p-Smad3蛋白水平比較

注：A.空白組；B.對(duì)照組；C.si-FKBP11組；D.si-FKBP11+LY364947組

3 討 論

RCC發(fā)病率占成人惡性腫瘤的2%～3%，早期具有隱匿性，約30%的患者初診時(shí)就已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移[10-11]。傳統(tǒng)的化學(xué)療法和放射療法對(duì)RCC治療基本無(wú)效[2]，因此發(fā)現(xiàn)新的有效的診斷方法和治療方案尤為重要。

FKBPs是一類包含肽基普脯氨酸順式/反式異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)家族，可參與多種生物學(xué)功能，如心臟調(diào)節(jié)功能、神經(jīng)元的發(fā)育等，且與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP11可參與蛋白質(zhì)的折疊和分泌[12]。過(guò)表達(dá)的FKBP11是狼瘡B細(xì)胞的特征之一，可破壞B細(xì)胞的耐受性并導(dǎo)致漿細(xì)胞分化[13]。另外，F(xiàn)KBP11表達(dá)可隨著肝癌細(xì)胞的發(fā)展而逐漸增高，可成為肝細(xì)胞癌早期診斷的標(biāo)志物之一[14]。此外，也有研究證明，F(xiàn)KBP11在腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)組織中高表達(dá)，且其表達(dá)可隨著ccRCC病理分級(jí)的增高而升高，與ccRCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。但關(guān)于FKBP11在RCC中的作用機(jī)制還未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)KBP11在RCC細(xì)胞系中高表達(dá),與以往研究相似[7]，且在786-O細(xì)胞中FKBP11表達(dá)最高。進(jìn)一步分析顯示，F(xiàn)KBP11下調(diào)可抑制786-O細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。同時(shí)結(jié)果表明，敲低FKBP11可降低PCNA、Vimentin、Twist、Snail蛋白水平，上調(diào)E-cadherin表達(dá)。已知PCNA主要在細(xì)胞核中表達(dá)，其蛋白水平可用來(lái)評(píng)估細(xì)胞的增殖狀態(tài)[15]。E-cadherin水平降低及Vimentin水平升高是上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)生的重要標(biāo)志[16]。以上結(jié)果說(shuō)明，F(xiàn)KBP11可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞行為相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)而參與RCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，但FKBP11在RCC中的作用機(jī)制尚不清楚。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，可由多種信號(hào)通路參與調(diào)控，其中TGF-β1/Smad3信號(hào)通路為癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的重要通路之一[17]。有研究證明，TGF-β1/Smad3促進(jìn)腎臟炎性反應(yīng)和纖維化發(fā)展[18]。此外有研究報(bào)道，雌激素受體β(ERβ)可通過(guò)激活TGF-β1/Smad3/miRNAs信號(hào)通路，進(jìn)而影響EMT過(guò)程，促進(jìn)RCC的侵襲和遷移作用，當(dāng)此通路被抑制時(shí)，可逆轉(zhuǎn)ERβ促進(jìn)RCC發(fā)展過(guò)程，從而為有效抑制轉(zhuǎn)移性RCC的新療法提供基礎(chǔ)[19]。據(jù)報(bào)道，Twist和Snail是TGF-β1/Smad3通路上游轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)其水平升高可促進(jìn)通路激活[20]。TGF-β1和p-Smad3的蛋白水平則可反映TGF-β1/Smad3通路狀況，當(dāng)二者水平增高時(shí)，表示此通路被激活，反之則為抑制[21]。本研究結(jié)果顯示，敲低FKBP11表達(dá)抑制Twist、Snail、TGF-β1和p-Smad3蛋白水平，表明敲低FKBP11表達(dá)可能抑制TGF-β1/Smad3通路活化。進(jìn)一步研究顯示，TGF-β1/Smad3通路抑制劑部分逆轉(zhuǎn)FKBP11下調(diào)對(duì)RCC細(xì)胞惡性行為及TGF-β1/Smad3通路的影響。以上結(jié)果表明，下調(diào)FKBP11抑制RCC細(xì)胞惡性細(xì)胞行為，可能與抑制TGF-β1/Smad3通路激活有關(guān)。

綜上所述，下調(diào)FKBP11可抑制RCC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad3通路活化有關(guān)。然而本研究并未探究下調(diào)FKBP11影響RCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程是否還有其他通路的參與，還有待后續(xù)更深入的探究。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

張苗、張麗麗：構(gòu)思、設(shè)計(jì)研究方案；何德嬌、凌娜、李小麗：進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作；梁軼嵐、胡威：撰寫論文，分析或解釋數(shù)據(jù)；張苗：論文終審