王海強(qiáng)，饒 唱，曾 易，胡瑞雪，文興建，勵(lì) 娜，胡 光

(1.重慶理工大學(xué) 藥物化學(xué)與分子藥理學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400054；2.重慶市中藥研究院， 重慶 400065)

1 概述

斑馬魚的免疫系統(tǒng)發(fā)育的比較完備，同時(shí)具備固有免疫與獲得性免疫；而其固有免疫系統(tǒng)可以區(qū)分自我和非自我rRNA[5]，利用斑馬魚可以建立很多人類病原的感染模型及水生動(dòng)物病原感染模型。斑馬魚免疫系統(tǒng)發(fā)育較早，在胚胎形成之后的1 d內(nèi)，就可以檢測到固有免疫反應(yīng)。ELAVL1a是一種儲(chǔ)存在早期胚胎中的膜磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)結(jié)合蛋白，它也是一種母體免疫因子，可以保護(hù)斑馬魚胚胎免受細(xì)菌感染[6]。腎臟作為斑馬魚的主要造血器官，相當(dāng)于哺乳動(dòng)物中的骨髓，其中含有T細(xì)胞、B細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)等[7]。巨噬細(xì)胞專門識別調(diào)理病原體和非健康細(xì)胞(如凋亡和壞死細(xì)胞 )發(fā)出的信號。它們在固有免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，可以直接來源于卵黃囊和胚胎肝臟，也可以來源于循環(huán)單核細(xì)胞。在炎癥條件下，單核細(xì)胞在組織中轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞。此外，巨噬細(xì)胞主要可分為：① 經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(M1)，它們是宿主用來抵御病原體的介質(zhì)，還具有抗腫瘤免疫作用[8]。② 替代活化的巨噬細(xì)胞(M2)，具有抗炎和促進(jìn)傷口愈合功能[9]。為了開發(fā)疫苗、治療一些慢性炎癥性疾病[10-11]和重新培養(yǎng)巨噬細(xì)胞以進(jìn)行新的癌癥治療[12-13]，人們有意追求免疫細(xì)胞的特異性和靶向性。細(xì)胞因子和趨化因子是免疫系統(tǒng)重要的組成部分。斑馬魚的相關(guān)因子已陸續(xù)得到分子鑒定，并顯示出與其他魚類的因子有很高的相似性。白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)是一種高度通用的細(xì)胞因子，不僅在免疫細(xì)胞中具有多效性作用，而且在其他細(xì)胞類型中也具有多效性作用；此外，已經(jīng)證明了IL-6還參與多種生理中樞神經(jīng)系統(tǒng)過程，如神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)，星形膠質(zhì)細(xì)胞生成和神經(jīng)元分化[14]。白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)是在炎癥中最有效的嗜中性粒細(xì)胞化學(xué)誘導(dǎo)物之一，在其他幾種功能中，負(fù)責(zé)引導(dǎo)中性粒細(xì)胞穿過組織基質(zhì)到達(dá)損傷部位；而斑馬魚可能擁有一個(gè)中性粒細(xì)胞亞群，其在炎癥區(qū)域的募集獨(dú)立于IL-8趨化因子[15]。干擾素在哺乳動(dòng)物對病原體的抵抗中起重要作用，對于病原體的抵御與清除、控制腫瘤的滋生等免疫反應(yīng)至關(guān)重要[16]。干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)是一種T輔助細(xì)胞1型(Th1)細(xì)胞因子，在免疫和炎癥反應(yīng)的幾乎所有階段都發(fā)揮重要作用，IFN-γ可能參與炎癥反應(yīng)，并與哺乳動(dòng)物的干擾素一樣促進(jìn)Th1免疫反應(yīng)[17]。白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)由多種細(xì)胞產(chǎn)生，是一種高度多效性的細(xì)胞因子；盡管它有時(shí)也顯示出一些似乎相互矛盾的差異效應(yīng)[18]，但是它仍被證明可能與自身免疫性疾病和癌癥的發(fā)病機(jī)制和發(fā)展相關(guān)。

近年來，很多學(xué)者的研究表明，植物多糖對魚類的生長、抗菌抗病、免疫、抗氧化和降血糖血脂等方面有積極作用[19-21]；也在生物體和細(xì)胞的生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，具有廣泛的生物活性。例如:在飼料中添加膳食殼聚糖硒納米顆粒(CTS-SeNP)可顯著增強(qiáng)斑馬魚的免疫力和抗病性[22]；β-葡聚糖不僅能提高斑馬魚免疫能力，還能改善營養(yǎng)不良斑馬魚的運(yùn)動(dòng)性能和線粒體功能[23]。更有趣的是，現(xiàn)已證明β-葡聚糖具有跨代提高免疫力的作用，β-葡聚糖可以通過誘導(dǎo)溶菌酶分子從母體轉(zhuǎn)移到卵子，并刺激其在卵母細(xì)胞中的內(nèi)源性生產(chǎn)，從而提高后代的溶菌酶水平[24]。此外，多糖很有可能不會(huì)在腸道通過消化吸收的途徑發(fā)揮功能，而是直接激活免疫信號通路，刺激免疫細(xì)胞的活化[25]，或者通過改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高魚類的免疫力[26]。

綜上所述，斑馬魚在藥物活性的研究中有著諸多的優(yōu)點(diǎn)，包括，早期的胚胎為透明狀態(tài)，便于連續(xù)觀察胚胎發(fā)育的全過程等，適用于高通量篩選[27]。同時(shí)，作為脊椎動(dòng)物，斑馬魚免疫系統(tǒng)發(fā)育的比較完備，同時(shí)具備固有免疫與獲得性免疫；加上野生型斑馬魚維護(hù)與實(shí)驗(yàn)成本比轉(zhuǎn)基因型斑馬魚低了很多，使其更適合應(yīng)用于較多數(shù)量藥物的初篩過程。本文以經(jīng)濟(jì)的野生型斑馬魚為主要對象，總結(jié)了該模型在評價(jià)多糖的免疫促進(jìn)作用的研究，并按照多糖的種類、多糖給藥方式及其免疫活性評價(jià)方法、免疫活性評價(jià)用病原菌、研究涉及的信號通路等幾方面，進(jìn)行了分類說明。

2 采用斑馬魚模型評價(jià)多糖的免疫促進(jìn)作用

2.1 多糖的種類

目前已有大量的天然多糖在科研和生活中被應(yīng)用，例如常用于科研的甜菊糖、白芷多糖、榴蓮果皮多糖、川芎多糖、枸杞多糖等。

Snega 等[28]以榴蓮果皮為原料，提取多糖凝膠(PG)，并用PG與枯草芽孢桿菌、豐年蝦幼蟲(artemia nauplii)分別組合后飼養(yǎng)斑馬魚，然后研究斑馬魚在弧菌浸泡激發(fā)(5 d)后誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的效果。總紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、溶菌酶活性測試、體重和長度分析表明，與對照組相比，喂食PG的斑馬魚具有更高的免疫誘導(dǎo)活性、存活率和生長率。當(dāng)檢測免疫相關(guān)基因的表達(dá)時(shí)，研究顯示與其他飼料相比，用含有PG的豐年蝦喂養(yǎng)的魚類的IL-1β、溶菌酶(lysozyme,Lyz)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的基因表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。

甜菊糖是一種具有藥用功能的甜味劑，因其獨(dú)特的生理功能而在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[29]。SRP70-1是甜菊糖的主要有效成分，由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，摩爾比為1.15∶1.00∶3.77∶4.45，絕對分子量為7 698 Da。SRP70-1能顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡、吞噬并增加一氧化氮和細(xì)胞因子(包括IL-1β、IL-6和TNF-α)的釋放，進(jìn)一步的斑馬魚實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SRP70-1的免疫增強(qiáng)作用[29]。

Sacks等[30]從白芷中獲得水溶性多糖ADP80-2。ADP80-2由阿拉伯糖和微量葡萄糖組成，分子量為9950 g/mol。ADP80-2可以顯著提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)一氧化氮(NO)的產(chǎn)生和細(xì)胞因子(IL-6、IL-1β和TNF-α )的分泌。在用ADP80-2處理后的斑馬魚模型中，蛋白質(zhì)含量顯著增加。這些生物學(xué)結(jié)果表明：ADP80-2具有免疫調(diào)節(jié)作用，有望被用于開發(fā)成為新的免疫調(diào)節(jié)劑。

張紹杰等[31]首次從川芎中分離到一種具有免疫作用的阿拉伯糖LCP70-2A。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，LCP70-2A可以通過增強(qiáng)吞噬功能和增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)因子(包括NO、TNF-α、IL-6和IL-1β)的分泌來激活巨噬細(xì)胞。此外，使用斑馬魚模型發(fā)現(xiàn)LCP70-2A可促進(jìn)ROS和NO的釋放，這表明LCP70-2A可進(jìn)一步開發(fā)為免疫增強(qiáng)的候選補(bǔ)充劑。在該團(tuán)隊(duì)尋找生物活性多糖作為免疫調(diào)節(jié)劑的過程中[32]，從藤黃皮中純化并表征了一種阿拉伯呋喃多糖(GMP90-1)，該多糖(絕對分子量：5 300 g/mol )由阿拉伯糖、半乳糖和鼠李糖組成。構(gòu)象分析顯示GMP90-1在氯化鈉溶液中以剛性棒狀結(jié)構(gòu)存在。為了探索其作為免疫調(diào)節(jié)劑的潛力，進(jìn)行了體外細(xì)胞篩選，發(fā)現(xiàn)GMP90-1可顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，并提高巨噬細(xì)胞的NO、IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌水平。此外，斑馬魚體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GMP90-1的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性，這表明具有免疫調(diào)節(jié)作用的GMP90-1可被認(rèn)為是一種潛在的免疫調(diào)節(jié)劑，用于治療免疫性疾病。

（1）投資估算。本工程總投資估算：2504.78萬元，其中建筑工程投資1684.06萬元，機(jī)電設(shè)備及安裝工程投資2.90萬元，金屬結(jié)構(gòu)設(shè)備及安裝工程投資81.41萬元，施工臨時(shí)工程投資171.63萬元，獨(dú)立費(fèi)用投資257.62萬元，基本預(yù)備費(fèi)219.76萬元，建設(shè)征地移民補(bǔ)償投資39.13萬元，水土保持工程投資38.06萬元，環(huán)境保護(hù)工程投資10.21萬元。

β-葡聚糖(β-glucans)是從酵母細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)的葡萄糖聚合物。在哺乳動(dòng)物中，β-葡聚糖通過Toll樣受體(toll-like receptors,TLR)TLR2/TLR6異二聚體[33]和小膜受體Dectin-1的識別激活固有免疫。體內(nèi)注射β-葡聚糖可增強(qiáng)對寄生蟲、細(xì)菌和病毒病原體的抵抗作用[34-35]。在飼料中添加β-葡聚糖喂養(yǎng)是向魚類補(bǔ)充β-葡聚糖的最常見方式，該方式增加了固有免疫和獲得性免疫應(yīng)答的一些關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平[36]。然而，很少有文獻(xiàn)研究β-葡聚糖喂養(yǎng)后，斑馬魚對病毒挑戰(zhàn)的應(yīng)答情況；但有文獻(xiàn)報(bào)道顯示，用β-葡聚糖的飼養(yǎng)的太平洋鯡魚對病毒性出血熱病毒(VHSV)挑戰(zhàn)表現(xiàn)出更強(qiáng)的抵抗力[37]。另一種葡聚糖應(yīng)用方式，即單劑量注射，也被用于增強(qiáng)對疫苗的免疫反應(yīng)，作為提高對病毒的抗病性的有效手段[38]。

胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)是由紅色微藻合成的一種有價(jià)值的代謝產(chǎn)物。它是一種無毒的天然藥物，可作為免疫刺激劑使用。Risjani等[39]利用斑馬魚胚胎模型在體內(nèi)進(jìn)行了卟啉胞外多糖的毒性試驗(yàn)，隨著EPS濃度的增加，總血細(xì)胞(THC)值、吞噬活性(PA)和呼吸爆發(fā)(RB)都有所增加。結(jié)果表明，卟啉菌胞外多糖是安全的，能夠快速提高斑馬魚的免疫參數(shù)，并具有作為免疫刺激劑或免疫調(diào)節(jié)劑的能力，可作為弧菌病的預(yù)防劑。

枸杞(L.barbarum)果實(shí)或提取物是一種常見中藥，用于調(diào)節(jié)身體免疫力和抗衰老，枸杞多糖(LBPs)一直以來被認(rèn)為是其有效成分。Xia等[40]將斑馬魚胚胎連續(xù)暴露于不同濃度的LBPs中3 d，熒光吖啶橙和SA-β-gal染色結(jié)果表明，受精后24 h和72 h，細(xì)胞凋亡和衰老主要發(fā)生在頭部。此外，在低劑量LBPs下，尤其是在3.0 mg/mL濃度下，觀察到對復(fù)制性衰老的抵抗。與衰老相關(guān)的基因，如p53、p21和Bax的表達(dá)在LBPs治療后降低，而Mdm2和TERT基因的表達(dá)在LBPs治療后增加。結(jié)果表明，LBPs對細(xì)胞凋亡和衰老的影響可能是通過p53介導(dǎo)的途徑實(shí)現(xiàn)的。LBPs通過抑制發(fā)育早期的細(xì)胞死亡和凋亡，降低p53、p21和Bax基因的表達(dá)水平，增加Mdm2和TERT基因的表達(dá)，緩解了斑馬魚的衰老[40]。

巖藻依聚糖來源于褐藻的富含巖藻糖的硫酸化多糖。來自不同藻類來源的巖藻依聚糖表現(xiàn)出獨(dú)特的性質(zhì)，例如抗炎、抗過敏、抗腫瘤或抗病毒作用[41]，并因此被認(rèn)為是功能性食品和治療劑的預(yù)期成分[42]。Wakako等[43]分別通過浸泡(100和500 μg/mL，3 d)和喂食(3周)處理斑馬魚幼魚和成年斑馬魚。褐藻糖膠處理僅輕微影響幼魚體內(nèi)微生物群的組成以及中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量，用500 μg/mL褐藻糖膠處理的幼魚中，促炎和抗炎細(xì)胞因子基因表達(dá)水平上調(diào)，喂食褐藻糖膠則明顯改變了成年斑馬魚的腸道微生物組成[43]。揭示了在活生物體內(nèi)巖藻依聚糖對未受攻擊的斑馬魚的微生物群和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，這強(qiáng)調(diào)了巖藻依聚糖在飲食-微生物群-宿主相互作用中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的潛力。采用不同種類的多糖提高斑馬魚免疫活性的研究如表1。

表1 采用不同種類的多糖提高斑馬魚免疫活性的研究列表

2.2 多糖給藥方式及其免疫活性評價(jià)方法

斑馬魚的免疫給藥方式大多數(shù)仍以注射為主，也有用喂食配制的多糖飼料，和用多糖溶液浸泡的方式進(jìn)行的。但通過人工注射法進(jìn)行免疫，不僅人工和時(shí)間成本較大，且容易引起魚體強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)，影響魚體生長。故浸泡免疫是能普遍被接受的免疫接種方式[50]。Regla M等[38]研究了免疫刺激劑β-葡聚糖的抗病毒作用，在腹腔注射β-葡聚糖的斑馬魚中檢測到與固有免疫反應(yīng)有關(guān)的IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)增加。Wang等[24]通過向斑馬魚投喂Miero魚類食品或添加含1.25 g/kg β-1,3葡聚糖的魚類食品，證明了β-葡聚糖可以提高幾種魚類的固有免疫和抗感染或抗致病菌的能力。Oyarbide等[51]為了評估β-葡聚糖對基因表達(dá)的影響，斑馬魚胚胎和幼魚被浸泡在3種不同濃度的β-葡聚糖(50、100和150 μg/mL )中，且浸泡不同的暴露時(shí)間。當(dāng)暴露時(shí)間較長且使用年齡較大的幼魚時(shí)，觀察到更強(qiáng)的基因誘導(dǎo)。β-葡聚糖最明顯的作用是誘導(dǎo)TNF-α、MPO、TRF和LYZ基因的過度表達(dá)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)在β-葡聚糖浸泡后，斑馬魚對鰻弧菌的抗性暫時(shí)增加。這表明不同給藥方式都能提高斑馬魚的免疫水平，但浸泡接種方式被認(rèn)為與病原感染類似，接近自然環(huán)境中魚類免疫反應(yīng)激活的方式，并能有效刺激魚類的黏膜免疫應(yīng)答，產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)力[50]。在浸泡系統(tǒng)中使用黏液黏附納米載體是給藥和免疫調(diào)節(jié)劑的一種替代方法，因?yàn)榧{米系統(tǒng)可以黏附在魚的黏膜表面，對水的殘留影響很小[52]。此外，浸泡在不同的納米藥物中也有很大區(qū)別：Crecente-Campo等[53]將斑馬魚暴露于4種納米系統(tǒng)的5種不同濃度溶液中，證明了納米范圍內(nèi)的微小變化能導(dǎo)致免疫細(xì)胞和生物分布特征的顯著變化。是否能成功應(yīng)用多糖治療魚類疾病，取決于能否確定每個(gè)物種的最有效劑量和給藥時(shí)間[54]。

總之，與沒有給藥的斑馬魚相比，多糖給藥后能顯著提高斑馬魚的抗菌、抗病毒能力。此外，從文獻(xiàn)的報(bào)道數(shù)量來看，通過細(xì)菌感染來評價(jià)多糖對斑馬魚免疫系統(tǒng)增強(qiáng)的文章數(shù)量少于未采用細(xì)菌未感染來評價(jià)的文章數(shù)量，大部分研究直接通過檢測多糖給藥后斑馬魚體內(nèi)的免疫水平來給出結(jié)論。

目前，評價(jià)多糖促進(jìn)免疫活性的指標(biāo)的相應(yīng)檢測手段最主要為實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time-PCR,qRT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡 (western blot,WB)、酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)等。同時(shí)，檢測部位是以斑馬魚腸道組織為主，其次是肝臟、腎臟或斑馬魚全身。Snega等[44]使用RNA iso plus溶液均質(zhì)組織(5條/缸)，從中腸提取總RNA，并通過紫外可見分光光度計(jì)定量。使用PrimeScript TM II逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將總RNA(1 μg)轉(zhuǎn)化為cDNA。在Applied Biosystems Step One儀器中，使用SYBR GreenTM qPCR master mix測量基因表達(dá)。 Oyarbide等[51]通過RT-qPCR檢測與免疫系統(tǒng)相關(guān)的某些選定基因的差異表達(dá)，表明受精后72 h的幼魚處于評估所選基因表達(dá)的最佳發(fā)育階段。Blanca 等[55]使用WB分析檢測治療后斑馬魚血漿中的重鏈蛋白A-瓊脂糖珠和抗Ig M斑馬魚抗體。

2.3 免疫活性評價(jià)用病原菌

微生物的致病機(jī)理與宿主、病原和環(huán)境這3個(gè)要素息息相關(guān)。斑馬魚模型作為研究宿主與病原之間關(guān)系的模式動(dòng)物在免疫學(xué)中得到了廣泛應(yīng)用，許多重要病原菌的致病機(jī)理通過斑馬魚模型也得到了深入的研究[56]。通過斑馬魚篩選有抗菌作用的飼料添加劑，可以預(yù)防這些細(xì)菌所引發(fā)的魚類疾病[57]。所以使用斑馬魚建立細(xì)菌侵染模型，能很好地用于研究硬骨魚類的抗病毒免疫應(yīng)答[56-58]。嗜水氣單胞菌是一種人畜共患病原體，對經(jīng)典類抗生素具有高水平的耐藥性。噬菌體或原噬菌體編碼的裂解酶已顯示出對抗病原菌的潛力。 Wang 等[59]從嗜水氣單胞菌D4中鑒定出一種完整的原噬菌體(命名為phAhD4)。phAhD4在所有10個(gè)已發(fā)表的嗜水氣單胞菌序列型(ST)251菌株中高度保守，并且是ST251菌株所特有的。通過原核表達(dá)獲得由phAhD4編碼的獨(dú)特內(nèi)溶素PlyD4。在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用斑馬魚模型證明了PlyD4在體外對多種細(xì)菌具有殺菌活性，包括嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、副溶血性弧菌、銅綠假單胞菌等。斑馬魚在分枝桿菌引起的感染動(dòng)物模型中贏得了一席之地。這種模型宿主特別有助于研究肉芽腫的作用，肉芽腫是分枝桿菌疾病的炎癥病變特征。在固有免疫的背景下，這種光學(xué)透明的斑馬魚幼魚為肉芽腫發(fā)展的初始階段提供了一個(gè)窗口。 Varela 等[60]使用熒光染料和轉(zhuǎn)基因標(biāo)記物使固有免疫機(jī)制(如自噬和炎癥體)如何在感染的巨噬細(xì)胞中被激活實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)可視化。影像學(xué)、遺傳學(xué)和化學(xué)方法的結(jié)合表明，巨噬細(xì)胞和分枝桿菌之間的相互作用是組織播散和肉芽腫發(fā)展的主要驅(qū)動(dòng)因素，而中性粒細(xì)胞在早期肉芽腫中具有保護(hù)作用。人類和斑馬魚之間保存的不同趨化因子信號軸已被證明可招募允許分枝桿菌生長的巨噬細(xì)胞，控制其殺微生物能力，推動(dòng)其擴(kuò)散和聚集，并介導(dǎo)肉芽腫血管生成。最后，用斑馬魚幼魚來探索細(xì)胞的死亡過程，這也是肉芽腫擴(kuò)張的關(guān)鍵因素。

除上述的幾種病原菌外，斑馬魚也被應(yīng)用于其他的病原菌研究中(表2)。采用綠色熒光蛋白GFP標(biāo)記的鰻弧菌感染斑馬魚的模型闡明了腸道及皮膚在鰻弧菌感染魚類中的作用[61],而該菌感染斑馬魚后體內(nèi)免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化也已經(jīng)被研究[50,62]。銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa)的三型分泌系統(tǒng)在致病性中的作用以及斑馬魚體內(nèi)的囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)對該菌的抵抗作用也得到了很好的闡述[63-64]。

表2 斑馬魚免疫活性評價(jià)用病原菌及感染方式列表

2.4 研究涉及的信號通路

宿主固有免疫反應(yīng)是抵御入侵微生物的第一道防線。它的功能是在感染的第一階段識別入侵的病原體并啟動(dòng)適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)。病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)被模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)識別，其中Toll樣受體(toll-like receptors,TLR)家族的研究最為廣泛。髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)是TLRs信號通路中的重要適配器蛋白，因?yàn)樗怀齌LR3以外的所有TLRs[73]所使用。其C端TIR結(jié)構(gòu)域能夠與TLRs相互作用，N端死亡結(jié)構(gòu)域能夠與白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶4(interleukin-1 receptorassociated kinase 4,IRAK4)相互作用，后者又招募白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶(interleukin-1 receptorassociated kinase 1,IRAK1)或白細(xì)胞介素-1 受體關(guān)聯(lián)激酶2 (interleukin-1 receptorassociated kinase 2,IRAK2)形成“Myddosome”信號傳導(dǎo)復(fù)合物，激活核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號傳導(dǎo)[74]。Myddosome還在白細(xì)胞介素-1(interleukin-1,IL-1)，IL-18和IL-33受體的下游起作用，并且它與IFN-γ受體信號傳導(dǎo)有關(guān)，增加了其在炎癥和宿主防御中的核心作用。TLRs是一類重要的PRRs，可識別微生物和危險(xiǎn)信號。它們在配體結(jié)合時(shí)的下游信號對于固有免疫反應(yīng)的啟動(dòng)至關(guān)重要。在人類和哺乳動(dòng)物模型中，MYD 88以其在IL-1受體(IL-1R)和TLRs信號傳導(dǎo)中作為適配器分子的核心作用而聞名。Van der Vaart M[75]描述了一個(gè)帶有截短的MyD 88的斑馬魚系，作為TLRs信號組件的第一個(gè)斑馬魚突變體，證明免疫受損的突變體在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下的存活率較低，并且更容易受到急性細(xì)菌病原體遲緩愛德華氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的挑戰(zhàn)，基因微陣列分析和定量PCR分析顯示，固有免疫(包括NF-κB和AP-1)和促炎細(xì)胞因子IL-1β的轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)在這些細(xì)菌感染期間依賴于MyD 88信號傳導(dǎo)。

NOD樣受體(NOD-like receptor,NLR)是一大類細(xì)胞內(nèi)PRRs，具有核苷酸結(jié)合域(nucleotide binding domain,NBD)和富含亮氨酸的重復(fù)(leucine rich repeat,LRR)區(qū)域的特征性排列。NLR最突出的功能是識別細(xì)胞內(nèi)病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)[76]。系統(tǒng)發(fā)育分析揭示了NLR家族中的3個(gè)不同的亞家族：NOD(NOD1-2，NOD3/NLRC3，NOD4/NLRC5，NOD5/NLRX1，CIITA)，NLRP(NLRP1-14，也稱為NALPs)和由IPAF(NLRC4)和NAIP組成的IPAF亞家族[77]。其中，NOD1是第一個(gè)被表征的NLR成員[78]。在哺乳動(dòng)物中，NOD1可感知D-谷氨酰-內(nèi)消旋二氨基庚酸(DAP)，這是在所有革蘭氏陰性細(xì)菌和少數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌肽聚糖(peptidoglycan,PGN)片段[79]。配體結(jié)合后，NOD1通過CARD-CARD結(jié)構(gòu)域相互作用與受體相互作用蛋白2(RICK/RIP2)相互作用，從而觸發(fā)NF-κB和MAPK途徑的激活[80]。這些信號級聯(lián)反應(yīng)有效地上調(diào)促炎細(xì)胞因子和抗菌分子的產(chǎn)生，構(gòu)成固有免疫反應(yīng)。

CD44是一種跨膜黏附分子，是透明質(zhì)酸的主要受體。除了介導(dǎo)T細(xì)胞外滲的關(guān)鍵作用[81]，調(diào)節(jié)效應(yīng)器T細(xì)胞反應(yīng)[82]和T細(xì)胞發(fā)育，CD44還激活PI3K-Akt途徑，該途徑與包括白血病細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞類型的細(xì)胞存活有關(guān)[83]。有研究已經(jīng)確定了CD44，TLRs和PI3K-Akt通路在病理?xiàng)l件下的相互作用[84-85]。然而，NOD1、CD44和PI3K-Akt途徑之間的功能相關(guān)性是否存在于免疫系統(tǒng)中，特別是在早期本體發(fā)生期間，目前尚不清楚。

PRRs對于宿主防御和組織穩(wěn)態(tài)對抗感染病原體至關(guān)重要。PRRs在不同物種間具有高度保守性，表明它們在基本生物過程中的關(guān)鍵作用。盡管對NOD1受體在固有免疫和獲得性免疫反應(yīng)的研究已經(jīng)比較充分，但對NOD1在胚胎和幼魚階段的作用仍然知之甚少。Hu等[86]報(bào)道了NOD1對于PI3K-Akt途徑的調(diào)節(jié)和斑馬魚幼魚存活是必要的。轉(zhuǎn)錄組分析表明，NOD1-/-斑馬魚中主要在參與新陳代謝和免疫系統(tǒng)過程的通路中發(fā)生顯著富集。生化分析表明，CD44a的表達(dá)需要NOD1，而CD44a又在幼魚發(fā)育過程中激活PI3K-Akt途徑。相反，在NOD1缺陷斑馬魚中CD44a的過度表達(dá)恢復(fù)了PI3K-Akt途徑的調(diào)節(jié)并改善了幼魚的存活率?？偟膩碚f，Hu等的研究表明，NOD1通過CD44a介導(dǎo)的PI3K-Akt信號傳導(dǎo)的激活，在幼魚存活中起著以前未被發(fā)現(xiàn)的保護(hù)作用。

3 結(jié)論

概述了斑馬魚模型在多糖免疫中的應(yīng)用和獨(dú)特優(yōu)勢，介紹了采用斑馬魚模型進(jìn)行多糖免疫相關(guān)研究的進(jìn)展。免疫治療是近年來的研究熱點(diǎn)話題，尤其是在PD-1、PDL-1調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)抗癌方面更是不斷取得重大突破[87-88]。多糖的種類繁多，研究前景廣闊，在免疫方面具有明顯的促進(jìn)免疫活性和抗菌作用；然而許多相關(guān)的機(jī)制尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究與開發(fā)。與傳統(tǒng)的經(jīng)典體內(nèi)、外模型相比，斑馬魚免疫活性篩選模型兼具體內(nèi)和體外的優(yōu)勢：既有體外的操作相對簡單、經(jīng)濟(jì)、快速，適合高通量篩選的特點(diǎn)；又同時(shí)屬于整體動(dòng)物模型，具備相對完整的代謝系統(tǒng)，幼魚整體透明便于觀察，所得到的數(shù)據(jù)比單純的體外篩選結(jié)果更加可信，在今后的藥物篩選研究中依舊有良好的前景。