劉美玲，上官宵兆，王曉強(qiáng)，王雅昱，汪桂玲, ，李家樂,

1. 上海海洋大學(xué)/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306

2. 水產(chǎn)科學(xué)國家實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心/上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306

三角帆蚌 (Hyriopsis cumingii) 所產(chǎn)珍珠占中國珍珠產(chǎn)量的80%以上[1]，且品質(zhì)良好、經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高。但三角帆蚌培育珍珠的大小、光澤度等均與性別有關(guān)，在產(chǎn)珠性能方面雄性優(yōu)于雌性[2]，而人工雌雄分養(yǎng)情況下能促進(jìn)雌性三角帆蚌的個(gè)體發(fā)育及產(chǎn)珠性能[3]。三角帆蚌屬于雌雄異體，不存在異型染色體，目前性別決定無法從染色體層面進(jìn)行研究，所以性別分化與決定相關(guān)基因的研究成為性別調(diào)控的熱點(diǎn)，對揭示復(fù)雜的性別決定與分化機(jī)制研究及創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效益具有重大意義[4]。

絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 也稱為細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，受各種細(xì)胞外生長因子及受體的相互作用而被激活，會(huì)影響許多組織特異性生物活性，如細(xì)胞增殖、存活和分化[5-6]。然而，MAPK在雌性生殖細(xì)胞中不遵循這種傳統(tǒng)的模式[7]。在卵母細(xì)胞中，MAPK獨(dú)立于生長因子和酪氨酸激酶受體而被激活，獨(dú)立于轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮作用[8]，受特殊上游調(diào)節(jié)劑激酶 MOS的控制，在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中起關(guān)鍵作用[9-10]。Mos/MAPK通路在脊椎動(dòng)物中啟動(dòng)卵母細(xì)胞的成熟發(fā)育[10]，C-MOS基因在Mos/MAPK通路中位于MAP2K1基因的上游。MAP2K1基因作為MAPK家族的一分子，參與細(xì)胞增殖、分化、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)育過程[11-13]。在脊椎動(dòng)物中，MAP2K1基因參與小鼠 (Mus musculus) 的卵巢發(fā)育[14]，促進(jìn)水牛 (Bubalus) 卵母細(xì)胞的表達(dá)與發(fā)育[15]，對鵝 (Anser cygnoides orientalis) 的卵泡發(fā)育起到支持與促進(jìn)作用[5]。在無脊椎動(dòng)物中，MAP2K1基因?qū)Π吖?jié)對蝦 (Penaeus monodon) 卵母細(xì)胞的生長發(fā)育起促進(jìn)作用[14]；能促進(jìn)果蠅 (Drosophilid) 的卵母細(xì)胞成熟[16]。

在貝類中，紫貽貝 (Mytilus galloprovincialis)、蝦夷扇貝 (Mizuhopecten yessoensis) 的MAP2K1基因均有報(bào)道[17-18]。本文對三角帆蚌MAP2K1基因進(jìn)行了克隆，分析了該基因在性腺不同階段和雌雄性腺組織中的表達(dá)模式，探討了該基因在三角帆蚌性腺發(fā)育中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從浙江省金華市武義實(shí)驗(yàn)基地選取健康的1—8月齡和1、2、3齡三角帆蚌，暫養(yǎng)1周后對1—8月齡個(gè)體的性腺組織、1齡和2齡個(gè)體各組織 (性腺、閉殼肌、肝胰腺、鰓、外套膜、斧足)、3齡個(gè)體的性腺組織進(jìn)行取樣，樣本立刻放入液氮，速凍后用鑷子放入樣本盒，-80 ℃保存。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

按TRIzol法提取總RNA，利用NanoDrop 2000分度計(jì)進(jìn)行核酸檢測，通過1%瓊脂糖凝膠電泳[19](電壓180 V，電流200 mA) 檢查RNA完整性情況(3條條帶5.8S、18S、28S）。檢查合格后將RNA保存于-80 ℃。將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 (Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒，TaKaRa,日本) 得到cDNA模板，cDNA保存于-40 ℃。

1.3 基因序列的獲取

通過轉(zhuǎn)錄組庫[20]中得到的序列設(shè)計(jì)3'RACE的inner和outer引物 (表1)，并參照SMART 3'RACE試劑盒 (Clontech, America) 說明書進(jìn)行MAP2K1基因的3'端PCR擴(kuò)增。電泳 (電壓180 V，電流200 mA) 檢測產(chǎn)物，割膠回收純化。用PMD19-T(TaKaRa，大連) 載體連接純化產(chǎn)物，16 ℃下連接4 h。準(zhǔn)備冰盒，在冰上將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α (TaKaRa，大連) 中 30 min。準(zhǔn)備含氨芐的固體培養(yǎng)基 (4 ℃冰箱保存)，將所得菌液均勻地涂在上面，37 ℃培養(yǎng)10 h。挑選白色菌株送至生工 (上海) 測序。

表1 本實(shí)驗(yàn)所需引物Table 1 Primers for this study

1.4 基因生物信息學(xué)分析

使用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中的ORF finder預(yù)測MAP2K1基因的開放閱讀框(ORF)、Blast得到不同物種MAP2K1基因序列、Premier設(shè)計(jì)引物；蛋白基本理化性質(zhì)利用Prot-Param tool (https://web.expasy.org/aprotparam/) 分析；二級結(jié)構(gòu)利用SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html) 預(yù)測；三級結(jié)構(gòu)利用I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/) 預(yù)測；跨膜結(jié)構(gòu)域利用TMHMM Serverv 2.0程序 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 預(yù)測并用 (http://www.genedenovo.com/news/582.html) 解讀結(jié)果；信號(hào)肽利用SignalP-5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 預(yù)測并用(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/output.php) 解讀結(jié)果，基因表達(dá)量差別利用SPSS 18.0軟件分析；表達(dá)量差別條形圖利用SigmaPlot 12.5繪制；NJ (鄰接法) 系統(tǒng)進(jìn)化樹利用MEGA 7.0構(gòu)建，Bootstrap分析其可靠性，重復(fù)1 000次。

1.5 熒光定量分析

選取EF-1α為內(nèi)參基因，使用CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) 儀器進(jìn)行定量分析。定量體系 (20 μL) 為cDNA (使用前混合均勻) 1.6 μL，2×TB Green Premix ExTaq10 μL，F(xiàn)(上游引物) 0.8 μL，R (下游引物) 0.8 μL，RNase Free Water 6.8 μL。定量程序?yàn)?95 ℃ 3 min；95 ℃5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán) 40次。

1.6 原位雜交

原位雜交的引物具有特異性，上游引物保持不變，將T7啟動(dòng)子序列 (TAATACGACTCACTAT AGGG) 加入到下游引物5'端前。三角帆蚌性腺cDNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的條帶割膠回收，純化后作為模板，使用T7 (T7 High Efficiency Transcription) 試劑盒和DIG RNA Labeling Mix得到標(biāo)記探針，cDNA 1 μL，4 μL 5×T7 Transcription Reaction、8 μL 10 mmol·L-1NTP Mix，2 μL T7 Transcription Enzyme Mix，RNase-free water 5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?7 ℃，2 h。將所得探針純化后保存于-80 ℃。

取2齡健康雌、雄三角帆蚌的性腺組織 (組織上連帶少許表皮)，將其在4%多聚甲醛與DEPC中固定2 h，轉(zhuǎn)移至70%乙醇中，在乙醇中可保存約10 d。進(jìn)而進(jìn)行組織梯度脫水、組織透明、浸蠟、包埋、切片 (厚度控制在6～8 μm)、粘片。利用DIG nucleic acid detection kit進(jìn)行原位雜交，并進(jìn)行封片處理，在顯微鏡下觀察雜交信號(hào)并拍照。

1.7 RNA干擾

1.7.1 dsRNA 的合成

使用Primer Premier 5.0軟件在C-MOS基因的ORF區(qū)設(shè)計(jì)3對引物，在上下游引物前加上T7序列，將每組中正常引物與加有T7序列的引物交叉重組，共形成6對引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后回收純化cDNA序列 (質(zhì)量濃度≥167 ng·μL-1)。利用T7 High Efficiency Transcription 試劑盒 (全式金，北京) 將cDNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈RNA，混勻，37 ℃ PCR孵育2 h。將同一片段的兩管單鏈RNA在冰上等量混勻，將混勻物放置在70 ℃ PCR儀中反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束立刻取出后室溫靜置20 min。向每 20 μL 的反應(yīng)液加入 1 μL RNase A (用無酶水稀釋 200倍) 和 1 μL DNase I，放置在 37 ℃PCR儀中反應(yīng)30 min。這一步驟是為了去除DNA，使之退火合成dsRNA。將所得溶液中加入1/10體積的3 mol·L-1醋酸銨和等量異丙醇，冰中靜置5 min；放置離心機(jī)中 12 000 r·min-1、4 ℃、10 min。棄上清，70%乙醇洗滌沉淀；12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min。超凈工作臺(tái)內(nèi)風(fēng)干15 min；加入100 μL RNase-free water溶解。檢測dsRNA的質(zhì)量和濃度，-80 ℃保存。

1.7.2 dsRNA 干擾鏈注射

取1齡三角帆蚌按照每組15只分為4組 (干擾鏈1、干擾鏈2、干擾鏈3和對照組)，實(shí)驗(yàn)組每只注射 50 μL (200 ng·μL-1) 干擾鏈，陰性對照組每只注射 50 μL (200 ng·μL-1) 生理鹽水 (Normal saline,NS)。在第12、第24和第48小時(shí)提取性腺組織并立刻放置于液氮中。利用TRIzol法提取總RNA，試劑盒將其反轉(zhuǎn)為cDNA，將反轉(zhuǎn)后的cDNA作為模板進(jìn)行熒光定量實(shí)驗(yàn)，檢測直接干擾C-MOS基因后在性腺中的表達(dá)量情況及下游基因MAP2K1的表達(dá)量情況。

2 結(jié)果

2.1 MAP2K1基因cDNA的克隆及序列特征

本實(shí)驗(yàn)克隆得到三角帆蚌MAP2K1基因cDNA的序列，其中5' 非編碼區(qū) (UTR) 為145 bp，3'UTR為2 070 bp，開放閱讀框 (ORF) 1 194 bp，編碼397個(gè)氨基酸 (圖1)。預(yù)測相對分子質(zhì)量44.24 kD，等電點(diǎn)為6.81，平均親水系數(shù)為-0.379，推測為親水蛋白。根據(jù)MAP2K1蛋白既不具備跨膜結(jié)構(gòu)、也不具備信號(hào)肽的特點(diǎn)，推測其不屬于膜蛋白，而屬于胞內(nèi)蛋白。通過SOPMA分析得到MAP2K1基因具有S-TKC結(jié)構(gòu)域 (72—372 aa，圖2-a)，通過ITASSER預(yù)測MAP2K1基因的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)(圖 2-b)。

圖1 三角帆蚌MAP2K1基因核苷酸序列及氨基酸序列Fig. 1 MAP2K1 gene nucleotide sequence and amino acid sequence of H. cumingii

圖2 三角帆蚌MAP2K1基因二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 2 Secondary and tertiary structure prediction of MAP2K1 gene in H. cumingii

2.2 MAP2K1基因系統(tǒng)進(jìn)化

利用GeneDoc進(jìn)行不同物種之間的序列比對，結(jié)果顯示來自多種物種的MAP2K1基因結(jié)構(gòu)域重合度很高 (圖3)，說明在多種物種之間，MAP2K1基因進(jìn)化和結(jié)構(gòu)具有保守性，推斷其具有功能相似性。

圖3 三角帆蚌與其他物種MAP2K1基因的蛋白序列比對Fig. 3 Protein sequence comparison of MAP2K1 gene between H. cumingii and others

根據(jù)同源性比對結(jié)果分析，三角帆蚌MAP2K1基因與紫貽貝、蝦夷扇貝、泥蚶 (Tegillarca granosa)的同源性較高，同源性分別為85.52%、82.65%、80.59%。與智人 (Homo sapiens)、北美屬兔 (Ochotona princeps) 等同源性較低，同源性分別為72.27%、72.53%。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示三角帆蚌與紫貽貝、蝦夷扇貝、泥蚶聚為一支，親緣關(guān)系較近 (圖4)。

圖4 不同物種MAP2K1基因的氨基酸序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4 NJ phylogenetic trees constructed from amino acid sequences of MAP2K1 gene in different species

2.3 MAP2K1基因在各組織和各時(shí)期的表達(dá)量差異

在雌雄三角帆蚌的不同組織中，MAP2K1基因均有一定的表達(dá)量，但是MAP2K1基因在雌性性腺中的相對表達(dá)量高于另5個(gè)組織，雌雄差異也比較顯著 (P＜0.05，圖 5)。

圖5 三角帆蚌MAP2K1基因在雌雄各組織中的表達(dá)注：*表示存在顯著性差異 (*. P＜0.05, **. P＜0.01) ；圖7、圖9、圖10和圖11同此。Fig. 5 Expression of MAP2K1 gene in both male and female tissues of H. cumingiiNote: *. Significant difference (*. P＜0.05, **. P＜0.01); the same case in Fig. 7, Fig. 9, Fig. 10 and Fig. 11.

在三角帆蚌幼齡 (1—8月) 性腺發(fā)育階段過程中，MAP2K1基因均有一定程度的表達(dá) (圖6)。說明MAP2K1基因在三角帆蚌幼齡性腺發(fā)育階段起到一定作用。

圖6 三角帆蚌MAP2K1基因在早期性腺組織中的表達(dá)注：柱上不同字母表示存在顯著性差異 (P＜0.05) ；相同字母表示無顯著性差異。Fig. 6 Expression of MAP2K1 in various tissues of female and male adults of H. cumingiiNote: Different letters indicate significant difference (P＜0.05), while the same letters indicate insignificant difference.

三角帆蚌1齡性腺中，雌性相對表達(dá)量顯著高于雄性 (P＜0.01)，但在雄性中也有一定表達(dá) (圖7)；等到2齡左右，性腺相對表達(dá)量雌雄差異極顯著(P＜0.01)，雄性中幾乎不表達(dá)；在3齡性腺中，雌雄表達(dá)量均處于非常低的水平。結(jié)果表明，MAP2K1基因在三角帆蚌2齡卵巢發(fā)育過程中起到非常重要的作用。

圖7 MAP2K1基因在1—3齡三角帆蚌性腺中的相對表達(dá)Fig. 7 Relative expression of MAP2K1 gene in gonads of H. cumingii of 1-3 years old

2.4 性腺組織原位雜交

結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中三角帆蚌雌性性腺的卵母細(xì)胞、卵子上，藍(lán)紫色雜交信號(hào)非常顯著。實(shí)驗(yàn)組中三角帆蚌雄性性腺的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞上，藍(lán)紫色雜交信號(hào)存在極少，雌性及雄性陰性對照組中均未出現(xiàn)雜交信號(hào) (圖8)。根據(jù)結(jié)果推測，MAP2K1基因可能參與三角帆蚌的卵巢發(fā)育過程。

圖8 三角帆蚌MAP2K1基因在2齡三角帆蚌性腺原位雜交注：a. 雌性陰性對照組；b. 雌性實(shí)驗(yàn)組；c. 雄性陰性對照組；d. 雄性實(shí)驗(yàn)組。Fig. 8 MAP2K1 in situ hybridization in gonads of 2-year-old H. cumingiiNote: a. Female of negative control group; b. Female of experimental group; c. Male of negative control group; d. Male of experimental group.

2.5 RNA干擾結(jié)果

三條干擾鏈的干擾結(jié)果為，干擾鏈1在雌性和雄性中的干擾率分別為88.43%和77.90%；干擾鏈2在雌性和雄性中的干擾率分別為93.10%和78.10%；干擾鏈3在雌性和雄性中的干擾率分別為96.39%和86.26% (圖9)。干擾率結(jié)果顯示干擾鏈3對C-MOS基因的干擾效果最佳，為此選擇干擾鏈3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測C-MOS基因在12、24和48 h干擾后在性腺中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示干擾鏈3在第24小時(shí)的干擾效率最佳 (圖10)。

圖9 三角帆蚌C-MOS基因干擾后表達(dá)情況Fig. 9 Expression of C-MOS gene of H. cumingii after interference

圖10 干擾鏈3隨時(shí)間變化的干擾情況Fig. 10 Variation of Interference chain 3 with time

干擾C-MOS基因后，熒光定量檢測其下游基因MAP2K1的表達(dá)量情況 (圖11)。結(jié)果顯示，MAP2K1基因在雌性中的表達(dá)量下降了82.31%，在雄性中的表達(dá)量下降了73.60%。說明在三角帆蚌中，C-MOS基因?qū)AP2K1基因有顯著的調(diào)控作用。

圖11 三角帆蚌C-MOS基因干擾后MAP2K1基因表達(dá)情況Fig. 11 Expression of MAP2K1 gene of H. cumingii after C-MOS gene interference

3 討論

本研究克隆了三角帆蚌MAP2K1基因的cDNA序列，編碼一個(gè)長為1 194 bp的ORF。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析顯示，MAP2K1基因中含有STKC催化結(jié)構(gòu)域。蛋白蘇氨酸/絲氨酸激酶是十分常見的一類蛋白激酶[21]，主要作用是蛋白磷酸化、去磷酸化，有利于細(xì)胞內(nèi)活性[22]。S-TKC是這類激酶中一個(gè)位于核心部位重要的催化結(jié)構(gòu)域[23]。在S-TKC中有一個(gè)極其保守的區(qū)域，在催化結(jié)構(gòu)域它已被證明是涉及ATP的結(jié)合，即賴氨酸殘基附近N-末端的一個(gè)富含甘氨酸的殘基。在S-TKC的中間區(qū)域，存在一個(gè)天冬氨酸殘基，在催化結(jié)構(gòu)域它已被證明對酶的催化活性起顯著作用[24-26]。擁有S-TKC催化結(jié)構(gòu)域的基因通常參與許多生理生化過程[27-30]，若其構(gòu)造折疊或變化，會(huì)對絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶產(chǎn)生影響，從而對個(gè)體的生殖發(fā)育過程造成極大損害[31]，這說明MAP2K1基因可能參與了三角帆蚌個(gè)體的生殖發(fā)育過程。

不同物種之間的序列比對結(jié)果顯示，MAP2K1基因在三角帆蚌中的氨基酸序列與其他物種結(jié)構(gòu)域重合度較高，說明與其他物種相似度較高，尤其與蝦夷扇貝等軟體動(dòng)物相似度更高，由此推斷在進(jìn)化過程中，MAP2K1基因呈現(xiàn)高度保守狀態(tài)。各組織、早期發(fā)育階段、不同發(fā)育時(shí)期的定量結(jié)果說明，MAP2K1基因在卵巢中特異性高表達(dá)，在1—8月齡時(shí)期均有不同程度的表達(dá)，在1、2、3齡卵巢中的表達(dá)量均高于睪丸，對小鼠[14]、水牛[15]、鵝[5]、斑節(jié)對蝦[14]及果蠅[16]MAP2K1基因的研究中，均發(fā)現(xiàn)雌性表達(dá)量高于雄性，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近，由此推測MAP2K1基因是三角帆蚌中的偏雌性基因，既參與了三角帆蚌的早期發(fā)育階段，也參與了卵巢發(fā)育過程。根據(jù)原位雜交的探針定位顯示，MAP2K1基因在卵母細(xì)胞及卵子上存在明顯的信號(hào)，推測MAP2K1基因可能參與了三角帆蚌的卵巢發(fā)育過程。

RNA干擾結(jié)果顯示，3條干擾鏈中干擾鏈2和干擾鏈3對C-MOS基因起到抑制作用，但是干擾鏈3的干擾效果最佳，在雌性和雄性中的干擾率分別為84.21%和96.87%。在選取干擾鏈3觀察干擾C-MOS基因后MAP2K1基因的表達(dá)情況中，MAP2K1基因在雌性中的表達(dá)量下降了82.31%，在雄性中的表達(dá)量下降了73.60%。結(jié)果顯示在三角帆蚌中，C-MOS基因?qū)AP2K1基因有顯著的調(diào)控作用。在脊椎動(dòng)物卵母細(xì)胞MAPK信號(hào)通路中，MAPK獨(dú)立于生長因子和酪氨酸激酶受體而被激活，受特殊上游調(diào)節(jié)劑激酶MOS的控制，在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中起關(guān)鍵作用[9]。綜上，推測在三角帆蚌中，MAP2K1基因可能參與了三角帆蚌的卵巢發(fā)育過程，是偏雌性基因。