譚金娣 姜建平 何佳英

骨組織工程技術(shù)就是將機(jī)體分離的擴(kuò)干細(xì)胞（種子細(xì)胞）在體外進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)增，然后與細(xì)胞支架材料結(jié)合后再植入機(jī)體骨缺損部位，從而再生出新骨來修復(fù)骨組織缺損，其研究?jī)?nèi)容主要涉及以下三方面：（1）種子細(xì)胞來源；（2）生物載體支架選擇；（3）微環(huán)境構(gòu)建[1]。目前已證實(shí)的成體多能干細(xì)胞由非牙源性干細(xì)胞、牙源性干細(xì)胞兩大類構(gòu)成，其中牙源性干細(xì)胞由于具有很強(qiáng)的自我更新和分化能力，在實(shí)驗(yàn)研究和臨床上被廣泛使用[2]。研究顯示，對(duì)牙源性干細(xì)胞施以體外特定誘導(dǎo)，其可向多種功能細(xì)胞分化[3-4]。而在體外研究中，細(xì)胞的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增、分化和凍存等一般都需使用含胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）或小牛血清制品，外源性物質(zhì)的加入，使得細(xì)胞在骨組織工程及臨床應(yīng)用中存在人畜共患疾病傳播和免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。本研究旨在觀察人臍帶血清（umbilical cord blood serum，CBS）促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞（dental plup stem cell，DPSC）增殖作用，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材 料 實(shí)驗(yàn)所取離體牙為杭州市中醫(yī)院口腔科19～29 歲健康成年人正常拔除的完整且無齲壞的第三磨牙；拔除后的牙放到培養(yǎng)瓶（內(nèi)含5 倍雙抗培養(yǎng)液）里，4 ℃溫度下，密封存儲(chǔ)。實(shí)驗(yàn)所需CBS 為杭州市中醫(yī)院手術(shù)室內(nèi)無菌條件下，抽取健康胎兒離體臍帶中臍帶血（未抗凝），并注入無菌玻璃瓶，放到培養(yǎng)箱（37 ℃）內(nèi)靜置備用。FBS 購(gòu)于上海吉泰生物；本研究符合《赫爾辛基宣言》涉及人類受試者醫(yī)學(xué)研究倫理原則。

1.2 試劑及儀器 胰酶（中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所），DMEM F/12 培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone 公司），培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿（美國(guó)Corning 公司），塑料細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國(guó)Costar 公司），超凈工作臺(tái)（中國(guó)蘇州凈化設(shè)備廠），倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司），培養(yǎng)箱（美國(guó)Sheldon 公司），離心機(jī)（德國(guó)Hettich 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分離培養(yǎng)人DPSC（1）有效清潔超凈工作臺(tái)，同時(shí)借助紫外燈實(shí)施0.5 h 殺菌處理。（2）打開超凈工作臺(tái)，打開上部通風(fēng)開關(guān)用于將實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的污染氣體抽離。將離體牙于臨時(shí)培養(yǎng)基（DMEM F/12 培養(yǎng)基）中取出，用酒精棉球擦拭牙體表明的血漬，去除牙體表面殘存的牙周膜等軟組織，將離體牙置于培養(yǎng)皿A 中。（3）通過無菌PBS 對(duì)培養(yǎng)皿A 內(nèi)牙體組織進(jìn)行沖洗，2 mL/次,共3 次。（4）將適量Ⅰ型膠原酶滴入另一個(gè)無菌的培養(yǎng)皿B 中（一般1 顆磨牙需1 mL Ⅰ型膠原酶）。（5）用滅菌的手排鉆將離體牙縱向劈開（注意鉆頭不要碰到牙髓組織），暴露牙髓組織，用無菌眼科剪將根尖部牙髓組織剪掉并將剩余牙髓組織用無菌鑷子置于培養(yǎng)皿B 中。（6）用眼科剪將牙髓組織剪碎（1 mm3/塊）。（7）用一次性吸管將牙髓與Ⅰ型膠原酶混合液移入無菌離心管中，吹打混勻后密封。（8）將離心管放置于37 ℃水浴搖床中消化1 h。（9）取回消化的離心管，于超凈工作臺(tái)上用一次性吸管吸棄上清液，放入3～5 mL 的DMEM F/12 培養(yǎng)基，先經(jīng)吹打使之充分混合，再管口密封，移至離心機(jī)內(nèi)，設(shè)置為1000 r，作用5 min。（10）取回離心管，于超凈工作臺(tái)上用一次性吸管吸棄上清液，添加3～5 mL 內(nèi)含20% FBS 的DMEM F/12 培養(yǎng)液，待吹打混勻，封管口，移至離心機(jī)內(nèi)，1000 r 下計(jì)時(shí)5 min。（11）取回離心管，于超凈工作臺(tái)上用一次性吸管吸棄上清液，加入含有20% FBS 的DMEM F/12培養(yǎng)液5 mL，吹打混合后將組織懸浮液移入無菌培養(yǎng)瓶中。（12）將存有組織懸浮液的培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37 ℃，5% CO2），觀察細(xì)胞貼壁后每隔3 d換液1 次。（13）借助倒置相差顯微鏡查看細(xì)胞形態(tài)與數(shù)目，待培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞覆蓋率達(dá)80%，用胰酶消化傳代。

2.2 傳代培養(yǎng)人DPSC（1）有效清潔超凈工作臺(tái)，同時(shí)借助紫外燈實(shí)施0.5 h 滅菌處理。（2）借助倒置相差顯微鏡查看細(xì)胞形態(tài)與數(shù)目，再移至超凈工作臺(tái)上，將其中培養(yǎng)基清除掉，用PBS 實(shí)施3 遍清洗。（3）向培養(yǎng)瓶里放入1～2 mL 胰酶，接著將此瓶移至培養(yǎng)箱里，停留0.5 min。（4）從培養(yǎng)箱內(nèi)把培養(yǎng)瓶取出，借助倒置相差顯微鏡查看細(xì)胞形態(tài)，待其顯示圓形，馬上結(jié)束消化。（5）于超凈工作臺(tái)上，將胰酶清除掉，再放10 mL 含15% FBS 的DMEM F/12 培養(yǎng)液，接著借助吸管吹打貼壁細(xì)胞，使其脫落。（6）分別取兩個(gè)新的無菌培養(yǎng)瓶，用吸管分別吸取5 mL 細(xì)胞懸液置于新的培養(yǎng)瓶中，再分別加入5mL 培養(yǎng)液。（7）再次置于培養(yǎng)箱里培養(yǎng)（5% CO2、37 ℃）。

2.3 人臍帶血清（hCBS）制備 手術(shù)室內(nèi)無菌條件下，抽取健康胎兒離體臍帶中臍帶血（未抗凝），并注入無菌玻璃瓶?jī)?nèi)，放到培養(yǎng)箱（37 ℃）內(nèi)靜置，計(jì)時(shí)120 min，待血凝塊充分析出后，無菌環(huán)境中于超凈工作臺(tái)將血清移至離心管內(nèi)，1000 g、4 ℃下，離心20 min，棄沉淀，僅留上清，-20 ℃保存。取部分血清做細(xì)菌、真菌、衣原體、支原體、乙型肝炎和丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒及梅毒、EB 病毒、巨細(xì)胞病毒等各項(xiàng)病原微生物測(cè)定，將各項(xiàng)測(cè)定結(jié)果皆顯示陰性的人CBS 用做培養(yǎng)。使用前56 ℃水浴滅活30 min，存放于4 ℃下備用。

2.4 不同培養(yǎng)條件下的人DPSC 增殖能力（1）種板、接種細(xì)胞：取呈良好狀態(tài)的第3 代DPSC，先在37 ℃溫度下用胰蛋白酶（0.5%）消化，再借助倒置相差顯微鏡查看細(xì)胞形態(tài)，待其顯示圓形，通過DMEM F/12 培養(yǎng)液（內(nèi)含10%FBS）馬上結(jié)束消化，彎頭吹打，即得單細(xì)胞懸液。取細(xì)胞的第3 代以4×103個(gè)/孔接種在96 孔培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)分為四組，其中10%FBS培養(yǎng)DPSC 作為對(duì)照組，設(shè)置其余三組實(shí)驗(yàn)組。首先在四組中分別加入200 μL 的DPSC 單細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，對(duì)照組繼續(xù)加10%FBS 培養(yǎng)，其他三組分別加入5%、10%、20% hCBS 繼續(xù)培養(yǎng)。每板各濃度種6 孔，每孔體積200 μL。FBS 加入細(xì)胞的懸液外一圈，以確保濕度。置于5% CO2中過夜。（2）于37 ℃、飽和濕度、5% CO2時(shí)培養(yǎng)，測(cè)定的時(shí)間節(jié)點(diǎn)為1、3、5、7 與9 d，添加0.02 mL 的MTT 試劑，于37 ℃中進(jìn)行4 h 孵育，將孔里培養(yǎng)基、MTT 試劑吸除干凈，再每孔加入15 μL DMSO，作用10 min 后，將培養(yǎng)板放入脫色搖床振蕩5～10 min，借助自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD490 nm 值。（3）繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.4 人DPSC 多向分化能力（1）取MTT 法得出增殖速度最快的一組第三代的DPSC 細(xì)胞。（2）成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)的培養(yǎng)液為50 μmol/L indomethacin 0.5 μmol/L isobutylmethylxanthine 和0.5 μmol/L dexamethasone，培養(yǎng)2 周。（3）用于誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)液是6 μg/mL Insulin，10 ng/mL TGF-β1，95 μmol/mL dexamethasone，37 mg/mL vitamin-C-phosphate，0.8 μM sodium Pyruvate，6 μg/mL 轉(zhuǎn)鐵蛋白，進(jìn)行3 W 培養(yǎng)。（4）用以誘導(dǎo)OB 的培養(yǎng)液是5 mM β-glycerophosphate，50 mg/mL vitamin-C-phosphate 和2 mM Lglutamine，培養(yǎng)3 周。（5）Oil Red O 染色測(cè)定向脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)狀況；甲苯胺藍(lán)染色測(cè)定向成軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)狀況；Alizarin Red S 測(cè)定向OB 的誘導(dǎo)狀。

2.5 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)志物（1）取呈良好狀態(tài)的第3 代DPSC，用PBS 行3 遍洗滌，通過胰酶消化為單細(xì)胞，再移入離心管（15 mL）內(nèi)，待細(xì)胞顯示圓形，用含10% CBS DMEM-F12 培養(yǎng)液立即終止消化，彎頭吹打，配成單細(xì)胞懸液。（2）于1500 r/min 行15 min 離心，留存沉淀，PBS 洗滌3 次，分別取1×105個(gè)細(xì)胞懸液100 μL 加入6 支離心管中，其中1 支為對(duì)照組，其余分別加入抗體CD90、CD75、CD45、MSCA-1 和CD34，5 μL，輕晃，避光下放入4℃里1 h。（3）待取出，將2 mL 的PBS 直接加入，于1500 r/min 下離心，計(jì)時(shí)5 min，將未結(jié)合抗體清除掉，借助FCM 測(cè)定抗體表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk 法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，得出細(xì)胞計(jì)數(shù)服從正態(tài)分布（P 均＞0.05），故采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），就各時(shí)間節(jié)點(diǎn)兩組組間差異采用LSD 法進(jìn)行比較，以P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 原代培養(yǎng)DPSC，待至第4 天發(fā)現(xiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，到第7 天時(shí)，產(chǎn)生克隆細(xì)胞團(tuán)，同時(shí)顯示出典型性成纖維細(xì)胞（FIB）樣形態(tài)。培養(yǎng)至第14 天，克隆細(xì)胞統(tǒng)一性更明顯，可觀察到平行分布的成纖維形態(tài)與長(zhǎng)細(xì)胞突，待數(shù)目達(dá)到，開始傳代。傳代后，顯示細(xì)胞快速增殖。見圖1。

3.2 10% FBS 與不同濃度hCBS 促進(jìn)DPSC 增殖能力比較 在橫、縱軸參數(shù)為“時(shí)間”“OD 值”下，完成生長(zhǎng)曲線的繪制。由此曲線可知，在培養(yǎng)時(shí)間增加下，DPSC 數(shù)量提高，同時(shí)于第3 天顯示快速生長(zhǎng)。四組DPSC 在第1～9 天內(nèi)均呈現(xiàn)不同程度的生長(zhǎng)狀態(tài)，且呈線性增長(zhǎng)，10% hCBS 組促進(jìn)DPSC 增殖明顯。見表1，圖2。

表1 10% FBS 與不同濃度hCBS 促進(jìn)DPSC 增殖能力比較（，n=24）

表1 10% FBS 與不同濃度hCBS 促進(jìn)DPSC 增殖能力比較（，n=24）

注：FBS 為胎牛血清；hCBS 為人臍帶血清；與10%FBS 組同期比較，aP＜0.05

3.3 體外鑒定DPSC 多向分化能力 圖3A 所示，DPSC 的成骨誘導(dǎo)3 W 后的礦化結(jié)節(jié)產(chǎn)生情況，可發(fā)現(xiàn)成功礦化。圖3B 所示，經(jīng)過2 W 的細(xì)胞成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)，Oil Red O 染色得到中央為空泡的Fatcell。圖3C 所示，經(jīng)過3 W 細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的結(jié)果，甲苯胺藍(lán)染色顯示藍(lán)色結(jié)節(jié)。

3.4 流式細(xì)胞儀鑒定 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)顯示，其中間充質(zhì)干細(xì)胞CD90 抗體的陽(yáng)性表達(dá)率74%，CD75 抗體的陽(yáng)性表達(dá)率65%，MSCA-1 抗體陽(yáng)性表達(dá)率0.5%。CD34、CD45 造血干細(xì)胞抗體陽(yáng)性表達(dá)率＜5%。見圖4。

4 討論

在細(xì)胞培養(yǎng)方面，F(xiàn)BS 的應(yīng)用率最高，其可滿足細(xì)胞諸多生物學(xué)行為的激素、生長(zhǎng)因子與營(yíng)養(yǎng)等生物活性物質(zhì)所需。但其因可能存在安全、科學(xué)與倫理方面的問題，在臨床應(yīng)用中受限。主要采用動(dòng)物血清的干細(xì)胞培養(yǎng)體系現(xiàn)今已極大阻礙到干細(xì)胞技術(shù)向臨床轉(zhuǎn)化，相關(guān)細(xì)胞療法進(jìn)行的基礎(chǔ)為，一種無異種血清的人間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）培養(yǎng)體系的構(gòu)建[7]。由于hCBS 富含生長(zhǎng)因子被推薦用來取代FBS。國(guó)內(nèi)外均有研究，CBS 或血漿內(nèi)富含細(xì)胞存活與生長(zhǎng)必需的細(xì)胞因子，對(duì)骨髓或其他來源的人MSC 體外生長(zhǎng)與增殖具促進(jìn)作用[8-10]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的CBS促進(jìn)DPSC 增殖的作用不盡相同，前期預(yù)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)CBS 對(duì)DPSC 增殖的促進(jìn)作用具有濃度依賴性，體積分?jǐn)?shù)1%～10%的CBS 明顯提高DPSC 的增殖活性，其中10%CBS 組促進(jìn)增殖能力最強(qiáng)。本研究通過用5、10 與20%濃度CBS 與10%FBS 培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞對(duì)比可以得出，在1、3、5、7、9 d 的細(xì)胞周期中，DPSC 數(shù)量均有增加，并在第3 天呈快速生長(zhǎng)，在整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)周期，體積分?jǐn)?shù)5%、20%CBS 對(duì)DPSC的促增殖作用基本相同（P＞0.05）。至中后期，在促進(jìn)DPSC 增殖方面，高濃度CBS 組則有所下降，可見一定濃度區(qū)間內(nèi)，DPSC 增殖活性和CBS 存在濃度依賴性表現(xiàn)，高濃度CBS 對(duì)DPSC 增殖具有抑制性。這可能和前者所含血清成分相關(guān)，血清所含的一些成分對(duì)血小板生長(zhǎng)因子（PDGF）可能具抵抗效能。其中10%CBS 組與10%FBS 組比較，從培養(yǎng)第5 天起，CBS 比FBS 更能促進(jìn)DPSC 增殖（P＜0.05），而且經(jīng)CBS 培養(yǎng)后的DPSC 在適宜條件的誘導(dǎo)下，DPSC 可較容易地完成向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，體現(xiàn)出多向分化活性。

目前通常采用三類特征鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞：（1）體外培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)，顯示梭狀。（2）條件適宜時(shí)可誘導(dǎo)得到成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。（3）免疫表型 ：CD31、CD105、CD45、CD73、CD34、CD106、CD14與CD29 等[11-12]。同上述3 項(xiàng)相符的細(xì)胞即可認(rèn)為所培養(yǎng)的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中CBS 體外培養(yǎng)體系獲得的DPSC 具有間充質(zhì)干細(xì)胞的一般生物學(xué)特性，細(xì)胞為典型的成纖維細(xì)胞樣，呈漩渦狀貼壁生長(zhǎng)；體外擴(kuò)增至四代，細(xì)胞形態(tài)不發(fā)生明顯改變。將CBS 培養(yǎng)后的第三代DPSC 誘導(dǎo)培養(yǎng)，呈現(xiàn)出了不同分化能力，證明CBS 培養(yǎng)前后的DPSC 生物學(xué)特性并未改變。另外，實(shí)驗(yàn)采用陽(yáng)性標(biāo)記與陰性標(biāo)記組合方式，對(duì)DPSC 展開鑒別，選擇CD73、CD90、CD45 與CD34 和這4 類細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物，前兩者可高表達(dá)，后兩者則不表達(dá)。同時(shí)，有報(bào)道使用MSCA-1 作為選擇分離間充質(zhì)干細(xì)胞的有效標(biāo)志物[12]。Tomlinson J 等[13]認(rèn)為，MSCA-1 也是一種潛在的特異性標(biāo)記牙髓干細(xì)胞的物質(zhì)，并用MSCA-1 檢測(cè)DPSC，得出MSCA-1 表達(dá)率1.2%。本研究中取培養(yǎng)的第三代DPSC，MSCA-1 表達(dá)率為0.5%。仍有待確定MSCA-1 是否為DPSC 特異性標(biāo)志物。

綜上所述，雖然FBS 是最常用于體外細(xì)胞擴(kuò)增的血清，但它的動(dòng)物來源限制了它的使用，尤其用于臨床中時(shí)有較大爭(zhēng)議。本研究結(jié)果表明，（1）CBS 可促進(jìn)DPSC 增殖；（2）CBS 與FBS 培養(yǎng)相比較，10%CBS 在促進(jìn)DPSC 增殖方面優(yōu)于10% FBS；（3）CBS培養(yǎng)所得DPSC 存在多向分化活性；（4）借助FCM 檢測(cè)CBS 培養(yǎng)所得DPSC 與干細(xì)胞表面標(biāo)記特性相符?？傊?，CBS 可替代FBS 用于體外DPSC 擴(kuò)增。因?yàn)槟氀子讷@取，操作簡(jiǎn)便，能夠取代動(dòng)物血清用于人間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)，同時(shí)維持此細(xì)胞的生物學(xué)特性，與構(gòu)建臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增的條件相符，所以，現(xiàn)階段依然是一類比較理想的非動(dòng)物來源的血清補(bǔ)充物。