路瑀璠,阮寶麗,羅夫來,羅春麗,趙 致

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,貴陽 550025;2.貴州省藥用植物繁育與種植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽 550025)

吉祥草Reineckia carnea(Andr.)Kunth為百合科(Liliaceae)吉祥草屬(Reineckea Kunth)植物[1],是貴州省苗族地區(qū)常用的特色傳統(tǒng)草藥之一。吉祥草中含有甾體類、黃酮類及萜類化合物等成分[2-6],其主要藥效成分為皂苷類化合物[7]?，F(xiàn)代藥理研究表明,吉祥草具有溶血、抗炎、殺滅釘螺、降糖及抗腫瘤等功效[8-11],常用于肺燥咳喘、陰虛咳嗽等病癥[12],是多家制藥企業(yè)加工生產(chǎn)中成藥的主要藥材來源。

目前,關(guān)于吉祥草質(zhì)量控制的研究主要集中在化學(xué)成分含量的測定[13-15],而從指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量法角度進(jìn)行吉祥草質(zhì)量評價研究鮮有報道。因此,本工作以20批吉祥草為研究對象,采用高效液相色譜法(HPLC)建立吉祥草整體特征的指紋圖譜,在此基礎(chǔ)上,利用化學(xué)模式識別對20批吉祥草進(jìn)行質(zhì)量差異性評價,篩選差異性成分,同時測定吉祥草中蘆丁、人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、薯蕷皂苷元等4種化學(xué)成分的含量。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 infinity型高效液相色譜儀;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;PX85ZH型電子天平;SB-5200DT型超聲波清洗機(jī)。

對照品混合溶液:分別稱取蘆丁對照品6.00 mg,人參皂苷Rb1對照品26.55 mg,薯蕷皂苷對照品1.47 mg,薯蕷皂苷元對照品0.52 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成蘆丁、人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、薯蕷皂苷元質(zhì)量濃度依次為0.600,2.655,0.147,0.052 g·L-1的對照品混合溶液。

蘆丁、人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、薯蕷皂苷元等對照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%,批號依次為153-18-4、41753-43-9、19057-60-4、512-04-9;甲醇、乙腈、磷酸均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

供試品來自于貴州大學(xué)藥用植物資源圃,原植物均野生,經(jīng)貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院羅夫來教授鑒定為百合科吉祥草屬吉祥草的干燥全草,種質(zhì)來源及采集時間見表1。

表1 20批吉祥草的種質(zhì)來源及采集時間Tab.1 Germplasm sources and collection time of 20 batches of Reineckia carnea

1.2 儀器工作條件

Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱溫25℃;流動相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))磷酸溶液,B為乙腈;流量1 mL·min-1;檢測波長203 nm;進(jìn)樣量20μL。梯度洗脫程序:0～25 min時,B由5%升至18%;25～45 min時,B由18%升至25%;45～55 min時,B由25%升至45%;55～75 min時,B由45%升至68%;75～80 min時,B由68%升至100%,保持15 min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品分析

將采集到的吉祥草植株曬干、粉碎,過孔徑(355±13)μm的篩網(wǎng)。取樣品粉末5.000 g,加入75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液40 mL,回流提取兩次,每次1.5 h,過濾,合并兩次提取液,冷卻,搖勻。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑至干,殘渣用甲醇溶解并定容至10 mL,搖勻,過0.45μm微孔濾膜,即得供試品溶液,按照儀器工作條件進(jìn)行測定。

1.3.2 數(shù)據(jù)分析

利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012A版)建立20批吉祥草HPLC指紋圖譜,并對其進(jìn)行相似度評價,使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行聚類分析和主成分分析,使用SIMCA-P 11.5軟件進(jìn)行偏最小二乘判別分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 20批吉祥草HPLC指紋圖譜與相似度評價

利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012A版),以S1樣品為參照圖譜,中位數(shù)生成法,選取“時間窗寬度”為0.1 min,采用多點(diǎn)校正后進(jìn)行自動匹配,選擇6個點(diǎn)校正Mark峰,生成對照圖譜(R)及20批吉祥草HPLC指紋圖譜,獲得13個共有峰,結(jié)果見圖1(a)和圖1(b)。通過與對照品混合溶液圖譜[圖1(c)]比較,指認(rèn)峰5為蘆丁,峰11為人參皂苷Rb1,峰12為薯蕷皂苷,峰13為薯蕷皂苷元。

圖1 色譜圖Fig.1 Chromatograms

20批吉祥草圖譜與R的相似度為0.546～0.942,表明吉祥草藥材化學(xué)成分整體上差異較大;其中S6、S7、S12、S13、S16、S19等6批吉祥草圖譜與R的相似度為0.908～0.942,表明這6批吉祥草藥材之間的差異較小。

2.2 化學(xué)模式識別分析

2.2.1 聚類分析

以20批吉祥草HPLC指紋圖譜中13個共有峰的峰面積為變量,運(yùn)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行聚類分析,結(jié)果見圖2。

由圖2可知:當(dāng)歐氏平方距離為11時,20批吉祥草被分成3類,其中S7、S10、S12、S16、S18、S17、S15、S3、S4、S1、S13、S2、S14、S19、S6、S8、S20、S9聚為第1類,S11為第2類,S5為第3類。

圖2 20批吉祥草聚類分析樹狀圖Fig.2 Clustering treemap for 20 batches of Reineckia carnea

2.2.2 主成分分析

Kaiser-Meyer-Olkin(KMO)檢驗(yàn)的統(tǒng)計量為0.639,符合統(tǒng)計要求;Bartlett′s球形檢驗(yàn)統(tǒng)計量為0,適合主成分分析。主成分分析結(jié)果見表2。

表2 特征值和方差貢獻(xiàn)率Tab.2 Characteristic values and variance contribution rates

由表2可知:前4個主成分的初始特征值均大于1.000,累積方差貢獻(xiàn)率為85.374%,表明這4個主成分代表了吉祥草藥材中85.374%的信息量,具有極高的代表性,可用于評價吉祥草藥材的質(zhì)量。

13個共有峰的相關(guān)性系數(shù)矩陣見表3,其中“*”表示P＜0.05,顯著相關(guān);“**”表示P＜0.01,極顯著相關(guān)。

由表3可知:峰1與峰3、峰5,峰2與峰10、峰12,峰3與峰4,峰4與峰8、峰11,峰5與峰13,峰7與峰13,峰8與峰9、峰11,峰9與峰11之間呈極顯著正相關(guān)性;峰1與峰4、峰7、峰8、峰13,峰2與峰13,峰3與峰8,峰4與峰9,峰5與峰6、峰7,峰6與峰7之間呈顯著正相關(guān)性;峰2與峰3、峰4,峰3與峰6、峰7、峰13,峰4與峰6、峰10,峰5與峰12,峰6與峰8、峰9、峰12,峰7與峰11,峰8與峰10,峰9與峰10,峰10與峰11之間呈負(fù)相關(guān)性,但差異不顯著;峰6與峰11之間呈負(fù)相關(guān)性,差異達(dá)顯著水平。

表3 相關(guān)性系數(shù)矩陣Tab.3 Matrix of correlation coefficients

13個共有峰的初始因子載荷矩陣見表4。

表4 初始因子載荷矩陣Tab.4 Initial factor load matrix

由表4可知:峰1、峰4、峰6、峰7、峰11在主成分1上具有較高載荷值,峰8、峰9在主成分2上具有較高載荷值,峰2、峰12在主成分3上具有較高載荷值,峰3、峰8在主成分4上具有較高載荷值,說明這幾個成分對吉祥草藥材分類影響較大。

根據(jù)初始因子載荷矩陣,推測影響吉祥草藥材質(zhì)量差異的并不是單一成分,而是多成分協(xié)同作用的結(jié)果。利用主成分1～4對20批吉祥草進(jìn)行綜合評價,以Y m(m＝1,2,3,4)表示4個主成分的得分,以F n(n＝1,2…,13)表示共有峰峰面積標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù),以K p(p＝1,2…,13)表示因子載荷值與特征值開平方后的比值,建立吉祥草藥材質(zhì)量評價模型,根據(jù)線性關(guān)系通式Y(jié) m＝F1×K1＋F2×K2＋…＋F n×K p＋…＋F13×K13,計算20批吉祥草的Y1,Y2,Y3,Y4,結(jié)果見表5。

結(jié)合主成分1～4的方差貢獻(xiàn)率,根據(jù)吉祥草藥材質(zhì)量綜合評價表達(dá)式綜合得分＝(Y1×35.090＋Y2×26.656＋Y3×13.195＋Y4×10.433)/85.374,計算20批吉祥草的綜合得分,并對其進(jìn)行排名,結(jié)果見表5。

表5 主成分得分和綜合得分Tab.5 Principal component scores and comprehensive scores

由表5可知:20批吉祥草中,綜合得分較高的是S5和S11,其次是S20、S9和S14。表明S5(貴州安龍)、S11(重慶南岸)這兩批吉祥草藥材受環(huán)境條件的影響較小,相比其余18批吉祥草藥材質(zhì)量較佳。

2.2.3 偏最小二乘判別分析

將20批吉祥草的13個共有峰的峰面積導(dǎo)入SIMCA-P 11.5軟件,偏最小二乘判別分析得分圖見圖3。

由圖3可知:20批吉祥草被分為3類,S5、S11各分為一類,S1～S4、S6～S10和S12～S20為一類,與聚類分析結(jié)果一致。表明20批吉祥草因種質(zhì)來源不同,所含有的化學(xué)成分種類不同,即使含有相同的化學(xué)成分,但其含量有一定的差異性。

圖3 20批吉祥草偏最小二乘判別分析得分圖Fig.3 Score plot of partial least squares-discriminant analysis for 20 batches of Reineckia carnea

為確定導(dǎo)致20批吉祥草分類差異較大的成分,試驗(yàn)采用變量重要性投影(VIP)法,得到13個共有峰的VIP值,結(jié)果見圖4。

圖4 13個共有峰的VIP值Fig.4 VIP values of 13 common peaks

以VIP值大于1為標(biāo)準(zhǔn),篩選出7個差異性成分,分別為峰13(薯蕷皂苷元)、峰2、峰7、峰5(蘆丁)、峰12(薯蕷皂苷)、峰1和峰6。

2.3 化學(xué)成分含量的測定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

精密移取對照品混合溶液4.0,8.0,12.0,16.0,20.0μL,按照儀器工作條件直接進(jìn)樣分析。以蘆丁、人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、薯蕷皂苷元的質(zhì)量為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性參數(shù)見表6。

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),結(jié)果見表6。

表6 線性參數(shù)和檢出限Tab.6 Linearity parameters and detection limits

2.3.2 儀器精密度試驗(yàn)

按照1.3.1節(jié)試驗(yàn)方法對S2供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次,計算得蘆丁、人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、薯蕷皂苷元峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.3%,1.1%,1.4%,1.1%,說明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

按照1.3.1節(jié)試驗(yàn)方法對6份S2供試品溶液進(jìn)行分析,計算得蘆丁、人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、薯蕷皂苷元峰面積的RSD分別為1.8%,1.4%,1.1%,2.1%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照1.3.1節(jié)試驗(yàn)方法制備S2供試品溶液,分別于0,4,8,12,16,20,24 h進(jìn)樣分析,計算得蘆丁、人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、薯蕷皂苷元峰面積的RSD分別1.6%,0.79%,2.2%,1.1%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 回收試驗(yàn)

精密稱取S2樣品6份,每份5.000 g,各加入蘆丁2.00 mg、人參皂苷Rb1 3.52 mg、薯蕷皂苷0.09 mg、薯蕷皂苷元0.05 mg,按照1.3.1節(jié)試驗(yàn)方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),計算回收率和測定值的RSD。結(jié)果顯示,蘆丁、人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、薯蕷皂苷元的回收率分別為100%,98.5%,102%,97.4%,測定值的RSD分別為2.6%,1.4%,2.1%,1.1%。

2.3.6 樣品分析

按照試驗(yàn)方法分析20批吉祥草,每個樣品重復(fù)分析3次,結(jié)果見表7。

由表7可知,20批吉祥草中蘆丁、人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元的測定值分別為0.249～0.984 mg·g-1,0.431～5.851 mg·g-1,0.007～0.261 mg·g-1和0.003～0.095 mg·g-1,人參皂苷Rb1含量較高,薯蕷皂苷元含量較低,20批吉祥草中各成分含量具有差異。推測造成此差異的原因可能是藥材種質(zhì)來源的不同或藥材受當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件和環(huán)境因素影響,但具體影響因素還需進(jìn)一步調(diào)查研究。

表7 樣品分析結(jié)果Tab.7 Analytical results of the samples

本工作以20批吉祥草為研究對象,建立了HPLC指紋圖譜,選取其中的13個共有峰進(jìn)行了相似度評價、聚類分析、主成分分析及偏最小二乘判別分析,通過綜合評價,建立了吉祥草藥材的質(zhì)量評價方法,在一定程度上可為吉祥草藥材的質(zhì)量控制、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂及民間、臨床安全用藥提供參考。