鄭藝圓，朱明昭

（中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所，北京 100101）

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，呼吸系統(tǒng)疾?。ò宰枞苑尾　⑾潞粑栏腥荆┦侨蜃钪饕乃劳鲈蛑?。下呼吸道感染仍是世界上最致命的傳染病，居主要死亡原因的第4 位，在2019 年導(dǎo)致260 萬人死亡[1]。由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）的全球大流行也充分證明了呼吸道病原體具有強(qiáng)大的致病性。截至2022 年5 月，全球約有5 億例確診病例，其中包含624 萬例死亡病例[2]。目前已上市的疫苗并未有效覆蓋所有的呼吸道病原體的預(yù)防，例如預(yù)防結(jié)核桿菌、肺炎雙球菌、百日咳桿菌和流感嗜血桿菌感染的疫苗雖已上市，但預(yù)防效果仍不夠理想[3]。黏膜免疫策略有望覆蓋這些病原體的預(yù)防，相較于注射型疫苗，黏膜途徑給藥疫苗（以下簡(jiǎn)稱黏膜疫苗）可以引發(fā)保護(hù)性黏膜免疫反應(yīng)，在感染位點(diǎn)阻斷病原體的感染及其進(jìn)一步的擴(kuò)散和傳播[3]。除局部黏膜免疫外，黏膜疫苗也可誘導(dǎo)系統(tǒng)性免疫應(yīng)答，使機(jī)體獲得全方位保護(hù)。因非侵害型給藥，黏膜疫苗可大大提高病人依從性，且適用于傳染性疾病大流行時(shí)的大規(guī)模接種[4]。鑒于以上優(yōu)點(diǎn)，近10 年來黏膜疫苗研究獲得廣泛關(guān)注，但已批準(zhǔn)上市且適用于人類疾病預(yù)防的黏膜疫苗的數(shù)量遠(yuǎn)少于注射型疫苗，如何優(yōu)化抗原、佐劑和遞送系統(tǒng)以提高黏膜疫苗有效性和普適性，仍然是亟待解決的問題[3]。黏膜疫苗的給藥途徑有呼吸道途徑（鼻內(nèi)給藥、口部吸入）、胃腸道途徑、生殖道途徑等。本文將針對(duì)呼吸道感染疾病，主要介紹呼吸道途徑給藥的疫苗（以下簡(jiǎn)稱呼吸道黏膜疫苗），通過揭示呼吸道黏膜及其相關(guān)淋巴組織的特點(diǎn)和防御病原體入侵的機(jī)制，獲得呼吸道黏膜疫苗開發(fā)的啟示，并總結(jié)有潛力的佐劑與遞送系統(tǒng)的疫苗制劑設(shè)計(jì)，為提高呼吸道黏膜疫苗有效性和特異性提供有價(jià)值的參考。

1 呼吸道黏膜結(jié)構(gòu)及免疫機(jī)制

為了理性設(shè)計(jì)呼吸道黏膜疫苗，需對(duì)呼吸道黏膜的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性屏障作用以及介導(dǎo)固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的分子機(jī)制有深入的了解。這些認(rèn)識(shí)能輔助呼吸道黏膜疫苗設(shè)計(jì)，使得機(jī)體獲得特異、長(zhǎng)效和廣譜的保護(hù)性免疫。

1.1 呼吸道黏膜的基本結(jié)構(gòu)

呼吸系統(tǒng)由上呼吸道和下呼吸道組成。其中，上呼吸道包括鼻、咽、喉3 個(gè)胸外器官，下呼吸道分為氣管、支氣管、細(xì)支氣管、肺泡管和肺泡。從鼻到細(xì)支氣管是負(fù)責(zé)吸入氣體遞送的傳導(dǎo)區(qū)，而從肺泡管到肺泡是負(fù)責(zé)氣體交換的呼吸區(qū)。呼吸道黏膜由上皮層和固有層組成。上皮層及其表面黏液層組成黏膜物理化學(xué)屏障，是抵御呼吸道病原體入侵的首道防線。固有層含豐富的淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等。淋巴細(xì)胞以浸潤(rùn)的形式或以濾泡的形式聚集在固有層中，在病原體感染時(shí)發(fā)揮免疫效應(yīng)。

1.2 呼吸道黏膜發(fā)揮物理化學(xué)屏障作用

吸入氣體中的分子和顆粒異物大部分被困在黏液層，被黏膜表面持續(xù)有序的纖毛運(yùn)動(dòng)清除[5]。如圖1 所示，上皮層由纖毛細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、基底細(xì)胞和Club 細(xì)胞等組成，在持續(xù)緩慢的更新中維持各類細(xì)胞比例和平衡。上皮層之所以能形成堅(jiān)固的屏障，得益于上皮細(xì)胞間的緊密連接、粘附連接和橋粒等細(xì)胞粘附相互作用[5]。纖毛細(xì)胞是呼吸道上皮層主要的細(xì)胞類型，每個(gè)細(xì)胞在頂端膜上伸出200 ～300 條基于微管的絨毛狀突起。纖毛的擺動(dòng)頻率受多種與生理相關(guān)的信號(hào)分子[如三磷酸腺苷、環(huán)腺苷酸、NO 等]調(diào)控，纖毛的生成也受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，但呼吸道病菌或病毒可通過干擾這些調(diào)控來逃逸纖毛的防御[6]。由杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白是黏液中最具代表性的糖蛋白，與分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，sIgA）、凝集素和防御素等成分相互作用，在固有免疫中發(fā)揮重要的作用[7]?；准?xì)胞是干細(xì)胞樣祖細(xì)胞，在Notch 信號(hào)的調(diào)控下分化成纖毛細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和其他特異性上皮細(xì)胞。當(dāng)上皮受損時(shí)，基底細(xì)胞迅速活化并從基底膜遷移到受損區(qū)從而形成一個(gè)臨時(shí)的屏障[8]。Club 細(xì)胞則是一種圓頂狀的無纖毛分泌細(xì)胞，在上皮受損時(shí)也能分化成纖毛細(xì)胞和杯狀細(xì)胞[5]。

圖 1 呼吸道上皮層細(xì)胞組成Figure 1 Cell composition of the airway epithelium

1.3 呼吸道黏膜免疫機(jī)制

病原體如呼吸道合胞體病毒[9]和冠狀病毒[7]等可以通過干擾纖毛擺動(dòng)頻率、降解黏液和破壞上皮層的緊密連接等方式突破物理化學(xué)屏障，因此呼吸道黏膜產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)對(duì)抵御病原體的入侵有重要意義。呼吸道上皮層中的樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）可直接接觸抗原，隨后遷移到引流淋巴結(jié)，將抗原呈遞給初始T 細(xì)胞啟動(dòng)一系列的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。而在鼻相關(guān)淋巴組織（nose-associated lymphoid tissue，NALT）和支氣管相關(guān)淋巴組織（bronchus-associated lymphoid tissue，BALT）中，由M 細(xì)胞將外部抗原轉(zhuǎn)移給上皮層下的DCs 是一種重要的抗原轉(zhuǎn)運(yùn)方式。DCs 既能通過激活NALT和BALT 中的淋巴細(xì)胞而誘導(dǎo)局部免疫反應(yīng)，也能遷移到引流淋巴結(jié)啟動(dòng)系統(tǒng)性免疫反應(yīng)[10]。黏膜免疫系統(tǒng)可分為黏膜誘導(dǎo)位點(diǎn)和黏膜效應(yīng)位點(diǎn)[11]。NALT 和BALT 是典型的誘導(dǎo)位點(diǎn)，通過對(duì)抗原的捕獲、加工處理和呈遞誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。而NALT，BALT 和引流淋巴結(jié)中活化的T 細(xì)胞和B細(xì)胞可通過循環(huán)系統(tǒng)遷移到效應(yīng)位點(diǎn)[7]，發(fā)揮效應(yīng)功能，例如細(xì)胞毒性T 細(xì)胞將殺傷感染細(xì)胞，漿細(xì)胞將分泌大量的IgA。本文將從上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、M 細(xì)胞等方面介紹呼吸道黏膜免疫機(jī)制。

1.3.1 上皮細(xì)胞 上皮細(xì)胞表達(dá)多種模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs），可快速感知病原體的威脅并啟動(dòng)免疫應(yīng)答；上皮細(xì)胞也能作為效應(yīng)細(xì)胞，表達(dá)細(xì)胞因子受體，如干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）受體和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）受體，識(shí)別免疫細(xì)胞發(fā)出的信號(hào)；上皮細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，與駐留或招募而來的免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、黏膜相關(guān)恒定T 細(xì)胞、組織駐留記憶T 細(xì)胞等）協(xié)同發(fā)揮呼吸道免疫功能[12]。PRRs 是黏膜免疫中重要的受體分子，由固有免疫細(xì)胞表達(dá)，識(shí)別一系列病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），介導(dǎo)非特異性免疫反應(yīng)的產(chǎn)生及參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)和效應(yīng)。PRRs 包括Toll 樣 受 體（Toll-like receptor，TLR）、RIG-Ⅰ樣受體（RIG-Ⅰ-like receptor，RLR）和NOD 樣受體（NOD-like receptor，NLR）等。上皮細(xì)胞通過TLR 識(shí)別抗原并活化，隨后分泌趨化因子招募免疫細(xì)胞，免疫細(xì)胞和活化肺泡巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α反過來作用于上皮細(xì)胞，鞏固和維持TLR 起始的炎癥免疫反應(yīng)[12]。

1.3.2 巨噬細(xì)胞 巨噬細(xì)胞是呼吸道腔內(nèi)最豐富的免疫細(xì)胞，通過與上皮細(xì)胞的相互作用對(duì)無害刺激物耐受及吸入病原體產(chǎn)生合適的免疫應(yīng)答和有效修復(fù)組織損傷。在穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，呼吸道巨噬細(xì)胞因識(shí)別上皮細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和CD200 等抑制性信號(hào)而被抑制活化。在感染時(shí)，上皮細(xì)胞的裂解死亡會(huì)干擾這些抑制信號(hào)。另外上皮細(xì)胞通過PRRs 識(shí)別病毒而分泌IFN-γ，巨噬細(xì)胞通過RLR 識(shí)別分泌IFN-α/β。這些干擾素能誘導(dǎo)上皮細(xì)胞進(jìn)入抗病毒狀態(tài)。IFN-γ、白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）和IL-22 使巨噬細(xì)胞加強(qiáng)對(duì)感染細(xì)胞和病原體的吞噬作用，使上皮細(xì)胞分泌抗菌肽，加強(qiáng)緊密連接，促進(jìn)增殖和修復(fù)等[10]。

1.3.3 M 細(xì)胞 覆蓋黏膜濾泡的“濾泡相關(guān)上皮”中有一種特化的上皮細(xì)胞，稱為M 細(xì)胞，能將呼吸道腔中的大分子物質(zhì)和微生物通過“胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)”作用轉(zhuǎn)送給上皮層下的抗原呈遞細(xì)胞（antigen-presenting cells，APCs）。M 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)抗原是啟動(dòng)黏膜免疫反應(yīng)、產(chǎn)生抗原特異性IgA、維持黏膜組織穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵步驟[13]。與腸系M 細(xì)胞相同，核轉(zhuǎn)錄因子κB 的受體激動(dòng)劑（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK） 及其配體RANKL 相互作用通路是誘導(dǎo)NALT 和BALT 中M 細(xì)胞（GP2+Tnfaip2+）分化的重要通路[14]。Kimura 等[14]發(fā)現(xiàn)呼吸道M 細(xì)胞在自身免疫性疾病模型小鼠的誘導(dǎo)型BALT 中出現(xiàn)。另外，在呼吸道疾病小鼠模型中，呼吸道M 細(xì)胞在淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的氣管上皮中被病理性誘導(dǎo)產(chǎn)生，提示氣道M 細(xì)胞是誘導(dǎo)型BALT 的關(guān)鍵元件且在黏膜免疫中發(fā)揮重要作用[14]。M 細(xì)胞“胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)”的分子機(jī)制尚未完全解析。目前已知M 細(xì)胞表面受體GP2是介導(dǎo)“胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)”的重要受體，M 細(xì)胞表達(dá)的胞漿蛋白異體移植炎癥因子1 和TNF-α 誘導(dǎo)蛋白2 能夠調(diào)節(jié)M 細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)能力[13]。

1.3.4 樹突狀細(xì)胞 呼吸道DCs 廣泛分布在上皮內(nèi)、固有層中以及肺組織中，形成一個(gè)相互連接的網(wǎng)絡(luò)，通過PRRs 識(shí)別病原體并被激活，區(qū)分外來的有害或無害物質(zhì)從而誘導(dǎo)合適的免疫應(yīng)答或免疫耐受以維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)[11]。DCs 通過吞噬作用、巨胞飲作用和受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用來攝取病原體，其中受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用大部分是通過PRRs 識(shí)別PAMPs，具有高效、選擇性和飽和性等特點(diǎn)[11]。因此這些受體是疫苗設(shè)計(jì)的重要靶點(diǎn)。未成熟的DCs 需通過直接或間接方式活化：未成熟DCs 通過PRRs 識(shí)別吸入的病原體顆?；蚩扇苄钥乖梢灾苯踊罨?；上皮細(xì)胞通過分泌趨化因子招募單核細(xì)胞，通過分泌IL-1、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素等細(xì)胞因子促單核細(xì)胞分化為DCs 并促進(jìn)DCs 成熟為完全APCs；氣道上皮細(xì)胞分泌的Ⅰ型干擾素可調(diào)控DCs 的成熟[15]。

呼吸道DCs 具有多種作用：抗原呈遞作用，成為連接固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的橋梁；誘導(dǎo)B 細(xì)胞進(jìn)行IgA 類別轉(zhuǎn)換；介導(dǎo)免疫耐受[11]。DCs 遷移到淋巴結(jié)，將抗原呈遞給初始CD4+T 細(xì)胞和初始CD8+T 細(xì)胞并促其活化、增殖和分化。CD4+T 細(xì)胞分化為Th1，Th2，Th17 和濾泡輔助性T 細(xì)胞（T follicular helper cells，Tfh）等。Tfh 可誘導(dǎo)B 細(xì)胞發(fā)生體細(xì)胞高頻突變和抗體類別轉(zhuǎn)換，在生發(fā)中心中抗原高親和力的B 細(xì)胞被篩選出并發(fā)展成長(zhǎng)效漿細(xì)胞和記憶B 細(xì)胞。漿細(xì)胞分泌抗原特異性抗體介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。DCs 通過分泌細(xì)胞因子IL-10，TGF-β 和IL-6，誘導(dǎo)CD4+T 細(xì)胞分泌IL-4和IL-10，以及直接將完整蛋白抗原呈遞給B 細(xì)胞等方式誘導(dǎo)B 細(xì)胞IgA 類別轉(zhuǎn)換。

1.3.5 鼻相關(guān)淋巴組織 鼻咽扁桃體和咽鼓管扁桃體是Waldeyer 氏環(huán)的一部分，是人體中典型的NALT。NALT 位于上呼吸道，是最早接觸病原體的黏膜相關(guān)淋巴組織，與小腸的派爾小結(jié)一樣具有典型的濾泡相關(guān)上皮（包含M 細(xì)胞）、濾泡區(qū)（B 細(xì)胞區(qū)）、濾泡間區(qū)（T 細(xì)胞區(qū)）、輸出淋巴管和高內(nèi)皮靜脈等結(jié)構(gòu)[9]。與派爾小結(jié)不同的是，NALT的生發(fā)中心是在出生后由抗原誘導(dǎo)形成的[16]。

1.3.6 支氣管相關(guān)淋巴組織 BALT 是位于下呼吸道的黏膜相關(guān)淋巴組織，結(jié)構(gòu)與NALT 相似。如圖2 所示，BALT 是具有B 細(xì)胞濾泡和組織學(xué)上可辨認(rèn)的濾泡樹突狀細(xì)胞（follicular dendritic cells，F(xiàn)DCs）的淋巴細(xì)胞集群[17]，但這些淋巴細(xì)胞集群可能并不含有明顯的T 細(xì)胞區(qū)和特異的基質(zhì)細(xì)胞。在人體中，BALT 并不是組成型存在的，而是出生后因微生物暴露或其他的炎癥反應(yīng)等誘導(dǎo)產(chǎn)生。

圖 2 支氣管相關(guān)淋巴組織的結(jié)構(gòu)Figure 2 Structure of bronchus-associated lymphoid tissue

在圓頂狀上皮層中，特異的無纖毛上皮細(xì)胞M細(xì)胞負(fù)責(zé)將呼吸道腔的抗原轉(zhuǎn)移給DCs。B 細(xì)胞濾泡區(qū)是BALT 最突出的結(jié)構(gòu)特征，其主要的細(xì)胞成分是IgDhighIgMlow成熟靜息B 細(xì)胞[18]，通常含有生發(fā)中心。BALT 中存在生發(fā)中心，意味著B 細(xì)胞應(yīng)答可在局部持續(xù)發(fā)生。FDCs 位于B 細(xì)胞濾泡區(qū)的中心，對(duì)B 細(xì)胞的活化和增殖有重要作用。高內(nèi)皮靜脈常見于T 細(xì)胞區(qū)或在B 細(xì)胞區(qū)與T 細(xì)胞區(qū)的分界，通過表達(dá)重要的歸巢信號(hào)分子來招募外周的T細(xì)胞和B 細(xì)胞到達(dá)BALT[17]。

NALT 和BALT 是誘導(dǎo)局部黏膜免疫反應(yīng)的重要位點(diǎn)，在平衡免疫應(yīng)答和避免組織損傷與過度炎癥中起重要作用，而且相比系統(tǒng)性免疫應(yīng)答更迅速，有利于在上、下呼吸道均建立免疫屏障。NALT 和BALT 的作用機(jī)制包括：1）B 細(xì)胞在生發(fā)中心中發(fā)生體細(xì)胞高頻突變和親和力選擇，最終增殖分化為長(zhǎng)效漿細(xì)胞和記憶B 細(xì)胞；2）B 細(xì)胞免疫反應(yīng)產(chǎn)生IgA，分泌型IgA 在黏膜免疫中起重要作用；3）T 細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和發(fā)生，BALT 輔助記憶性T 細(xì)胞活性的維持；4）記憶性細(xì)胞在交叉免疫保護(hù)中起重要作用[17]。

1.3.7 B 細(xì)胞和免疫球蛋白A B 細(xì)胞在NALT 和BALT 等淋巴組織中應(yīng)答、分化和成熟，介導(dǎo)一系列重要的免疫應(yīng)答。例如，在小鼠研究中，生發(fā)中心產(chǎn)生具有交叉反應(yīng)特性的B 細(xì)胞庫，生成能夠廣譜應(yīng)答的組織駐留記憶B 細(xì)胞。這些記憶B 細(xì)胞在接觸病原體后能快速產(chǎn)生高親和力抗體防御多種亞型流感病毒[19]。B 細(xì)胞在不同微環(huán)境和不同類型免疫反應(yīng)中發(fā)生不同的類別轉(zhuǎn)換，其中IgA 型B 細(xì)胞在黏膜免疫中發(fā)揮重要作用[17]，IgA 在呼吸道黏膜中大量表達(dá)[11]。

IgA 分為血清型IgA 和分泌型IgA（sIgA），血清型IgA 主要以單體形式存在血液中，而sIgA是以多聚體形式（且大多為二聚體）廣泛存在于黏膜，是黏膜免疫的首道防線。在上皮下的漿細(xì)胞分泌IgA 單體和J 鏈，二者形成IgA 二聚體，與上皮細(xì)胞基底膜側(cè)的分泌片（secretory component，SC）結(jié)合形成IgA-J 鏈-SC 復(fù)合體（即sIgA）。sIgA 由上皮細(xì)胞表達(dá)的多聚免疫球蛋白受體（polymeric immunoglobulin receptor，pIgR）介導(dǎo)從固有層轉(zhuǎn)移到呼吸道腔[11,20]。

sIgA 功能多樣[20]，其一是“免疫排除”：在黏液層結(jié)合吸入的病原體，輔助病原體在纖毛運(yùn)動(dòng)下清除；在上皮細(xì)胞中攔截正在侵入的病毒，攜帶病毒轉(zhuǎn)送至呼吸道腔；在固有層中結(jié)合侵入的病原體然后通過pIgR 作用轉(zhuǎn)運(yùn)至呼吸道腔。其二是輔助抗原呈遞，結(jié)合病原體的sIgA 被M 細(xì)胞攝取并轉(zhuǎn)運(yùn)給上皮下的DCs。

1.3.8 組織駐留記憶T 細(xì)胞 除了B 細(xì)胞免疫反應(yīng)，黏膜免疫也需要有效的T 細(xì)胞免疫反應(yīng)，其中組織駐留記憶T 細(xì)胞（tissue-resident memory T cells，TRM）在再次應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。在BALT 中，記憶T 細(xì)胞能穩(wěn)定增殖，不但可以快速阻斷相同病原體的再次入侵，還可以促進(jìn)不同病原體的清除[17]。例如，鼻內(nèi)免疫一款融合SARS-CoV2 的S 抗原的黑猩猩腺病毒載體疫苗（ChAd-SARS-CoV-2-S）后，小鼠的肺部檢測(cè)到SARS-CoV2 特異性CD8+T 細(xì)胞，特別是CD103+CD69+T 細(xì)胞（TRM細(xì)胞表型）[21]。這意味著呼吸道黏膜疫苗能通過BALT 等結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)效應(yīng)T 細(xì)胞和病毒特異性TRM細(xì)胞，使小鼠在遇到相同抗原時(shí)能更快啟動(dòng)免疫應(yīng)答[21]。在流感病毒研究中也發(fā)現(xiàn)，CD8+TRM細(xì)胞具有交叉保護(hù)作用，對(duì)小鼠抵御異亞型病毒的肺部感染至關(guān)重要。CD8+TRM細(xì)胞在感染后出現(xiàn)在上呼吸道，能清除異亞型流感病毒并阻斷病毒從上呼吸道脫落至下呼吸道，避免引發(fā)更嚴(yán)重的肺部疾病[22]。

2 呼吸道黏膜疫苗現(xiàn)存的問題和挑戰(zhàn)

呼吸道黏膜疫苗雖然具有廣闊的研發(fā)前景，但仍面臨許多問題和挑戰(zhàn)。首先，黏膜物理化學(xué)屏障不僅阻擋病原體的入侵，也干擾了疫苗的攝取。呼吸道黏膜上皮層的緊密連接結(jié)構(gòu)和纖毛的擺動(dòng)使得疫苗不易被攝入、停留時(shí)間過短、易于被清除至體外。黏液中的天然抗體、蛋白酶、核酸酶等物質(zhì)容易破壞和降解疫苗。這些都使得疫苗無法通過上皮層，無法接觸NALT/BALT 的淋巴細(xì)胞以啟動(dòng)保護(hù)性免疫應(yīng)答[4,19]。其次，呼吸道黏膜也具有一定的免疫耐受性以避免非病原體引發(fā)損傷性炎癥反應(yīng)。單純使用抗原而不加佐劑的疫苗很可能誘發(fā)黏膜產(chǎn)生T細(xì)胞和B 細(xì)胞耐受[4,19]。再次，一直以來流感減毒活疫苗的安全性問題阻撓其獲批[16]，許多非減毒滅活類型的疫苗正等待研發(fā)和臨床試驗(yàn)。因此，通過疫苗制劑設(shè)計(jì)（包括佐劑和遞送系統(tǒng)）來增強(qiáng)疫苗的穩(wěn)定性、完整性和有效攝入是非常必要的，但如何平衡制劑的安全性和有效性也是一大難題[19]。另外，常用的注射型疫苗佐劑未必適合于呼吸道給藥，很多已批準(zhǔn)的肌肉注射疫苗佐劑還待臨床試驗(yàn)證明其在呼吸道給藥中的安全性和有效性[16]，同時(shí)還需要開發(fā)新型佐劑和遞送系統(tǒng)以實(shí)現(xiàn)呼吸道黏膜疫苗設(shè)計(jì)愿景。接下來，本文將梳理并介紹當(dāng)前發(fā)展成熟的佐劑與遞送系統(tǒng)。

3 佐劑

佐劑通常指添加到疫苗中幫助提高其免疫原性的物質(zhì)。黏膜佐劑按作用不同可大致分為3 類：黏膜附著劑、滲透增強(qiáng)劑和免疫刺激劑等[16]。黏膜附著劑通常是無毒的有機(jī)聚合物，在黏液中會(huì)吸水膨脹并與上皮細(xì)胞非共價(jià)結(jié)合，抑制纖毛擺動(dòng)，從而增加抗原在黏膜中的保留時(shí)間，促進(jìn)抗原與上皮細(xì)胞結(jié)合。滲透增強(qiáng)劑可促進(jìn)抗原在上皮細(xì)胞外穿過上皮層，主要機(jī)制是干擾或破壞上皮細(xì)胞間的“緊密連接”。免疫刺激劑主要通過靶向各種免疫細(xì)胞及其信號(hào)通路激活固有免疫細(xì)胞、活化DCs 啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。接下來將對(duì)代表性佐劑展開闡述。

3.1 滲透增強(qiáng)劑

霍亂毒素（cholera toxin，CT）和大腸埃希菌熱不穩(wěn)定毒素（Escherichiacoliheat-labile toxin，LT）是研究最成熟的黏膜佐劑[4]，通過與GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂受體（在大多數(shù)有核細(xì)胞表面存在）結(jié)合，增強(qiáng)黏膜屏障通透性并促進(jìn)局部APCs的招募與激活。但是CT 和LT 均為全毒素，自身的毒性限制其臨床應(yīng)用，例如LT 會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的副作用——“貝爾面癱（Bell’s palsy）”。因此，僅使用CT 的非毒性A1 亞基（CTA1）作為佐劑是有潛力的替代方案。另外，CTA1 融合了人工合成的結(jié)構(gòu)域DD 后（稱為CTA1-DD）能很好地靶向B 細(xì)胞和FDCs，促進(jìn)生發(fā)中心的形成，其良好的安全性和免疫刺激性得到臨床前試驗(yàn)證明[23]。

3.2 黏膜附著劑

黏膜附著劑包括殼聚糖、聚γ-谷氨酸、淀粉、海藻酸鈉、聚羧乙烯等聚合物。殼聚糖是由甲殼質(zhì)去乙?；玫降囊环N帶正電的多糖聚合物，可生物降解且具有很好的安全性。殼聚糖的去乙?；胶头绞健⑾鄬?duì)分子質(zhì)量等會(huì)影響其溶解性、生物相容性與生物降解性能。殼聚糖有多種佐劑效應(yīng)：通過與帶負(fù)電的黏液結(jié)合，顯示出很強(qiáng)的黏膜附著特性；通過誘導(dǎo)緊密連接的可逆打開來增強(qiáng)黏膜通透性；通過激活NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎癥小體促進(jìn)Th1 細(xì)胞的極化；促進(jìn)DCs 活化誘導(dǎo)細(xì)胞免疫；參與“干擾素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）-環(huán)磷酸鳥苷-腺苷一磷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）”通路啟動(dòng)固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[24]。Shim 等[25]研究了運(yùn)載布魯菌3 種重組蛋白的殼聚糖納米顆粒的鼻內(nèi)給藥效果。結(jié)果表明，在小鼠模型中，殼聚糖納米顆粒能有效促進(jìn)Th2 型免疫應(yīng)答和抗原特異性IgA 及各種類型的IgG 生成。許多研究通過不同修飾來提高殼聚糖的黏附作用和免疫刺激性，例如Mosafer 等[26]在小鼠中鼻內(nèi)給予被佐劑包裹滅活的PR8 流感病毒，比較了殼聚糖與三甲基修飾的殼聚糖這2 種佐劑的差異。結(jié)果顯示，兩者均誘導(dǎo)出高水平抗原特異性IgG 抗體，與三甲基修飾的殼聚糖疫苗相比，殼聚糖疫苗能誘導(dǎo)更高水平的IgG1 和IgG2a。

3.3 免疫刺激劑

靶向性佐劑具有很好的免疫刺激活性，例如靶向M 細(xì)胞受體促進(jìn)抗原通過上皮層；靶向TLR 和STING 通路等激活DCs 和一些固有免疫細(xì)胞，促進(jìn)DCs 啟動(dòng)一系列免疫應(yīng)答。

M 細(xì)胞的研究大多來自腸系M 細(xì)胞，其與呼吸道M 細(xì)胞存在差異。因此，口服M 細(xì)胞靶向的佐劑在呼吸道給藥中的效果仍需驗(yàn)證[16]。糖蛋白-2（glycoprotein-2，GP-2）是M 細(xì)胞表面特異性表達(dá)的蛋白。Khan 等[27]通過噬菌體展示文庫篩選出與GP-2 高親和力結(jié)合的短肽Gb-1，并驗(yàn)證了其作為鼻內(nèi)給藥疫苗佐劑的效果。結(jié)果表明，Gb-1 能與鼻黏膜M 細(xì)胞有效結(jié)合，F(xiàn)G-Gb1 疫苗（Gb-1 與呼吸道合胞病毒的F 和G 蛋白偶聯(lián)）鼻內(nèi)給藥BALB/c小鼠后誘導(dǎo)了Th1 型免疫反應(yīng)和保護(hù)作用。相比未加佐劑的FG 抗原，F(xiàn)G-Gb1 顯著提高了IgA 和中和抗體誘導(dǎo)水平，并顯著降低了肺部病毒載量，減少了小鼠在接觸病毒后的體質(zhì)量下降。類似地，由Park 等[28]篩選出能與M 細(xì)胞特異性結(jié)合的短肽Co4B，其能將抗原靶向NALT。為了證明佐劑Co4B 的作用，結(jié)合和不結(jié)合Co4B 的胸膜肺炎放線桿菌抗原分別被鼻內(nèi)注入小鼠，結(jié)果表明佐劑Co4B 能有效提高血清IgG和分泌型IgA 水平，促進(jìn)肺部殘留病菌的清除。

TLR 是重要的模式識(shí)別受體，因此也成為黏膜佐劑的重要靶點(diǎn)。TLR 激動(dòng)劑主要通過與DCs 的TLR結(jié)合，促進(jìn)抗原被DCs 捕獲，從而激活DCs 啟動(dòng)一系列免疫應(yīng)答，特別是Th1 型免疫反應(yīng)[16]。實(shí)驗(yàn)證明TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7 和TLR9的激動(dòng)劑可以加強(qiáng)鼻內(nèi)疫苗的免疫原性[4,16,19]。

TLR3 激動(dòng)劑聚肌苷酸-胞苷酸[poly(I: C)]是合成的雙鏈RNA 類似物，通過模仿病毒RNA 活化多種APCs[19]。一項(xiàng)研究表明poly(I: C)能有效提高H1N1 病毒疫苗產(chǎn)生血清IgG 和黏膜IgA 的水平，而且促進(jìn)NALT 中生發(fā)中心的形成、提高B 細(xì)胞和Tfh 應(yīng)答，而這些是通過活化鼻黏膜CD103+DCs 介導(dǎo)的。與不加佐劑的疫苗組相比，poly(I: C)佐劑組能有效保護(hù)小鼠對(duì)抗H1N1 病毒感染[29]。

TLR5 激動(dòng)劑鞭毛蛋白是來自細(xì)菌鞭毛的主要蛋白，能靶向呼吸道上皮細(xì)胞、DCs 和其他淋巴細(xì)胞表面的TLR5，促進(jìn)抗原經(jīng)上皮轉(zhuǎn)運(yùn)和誘導(dǎo)DCs遷移到上皮層[19]。Song 等[30]將H7N9 抗原HA1-2短肽與鼠傷寒沙門菌的鞭毛蛋白fliC 融合表達(dá)（命名為HA1-2-fliC），驗(yàn)證鞭毛蛋白的佐劑效應(yīng)。結(jié)果表明，與不加佐劑的抗原相比，HA1-2-fliC 顯著增加了血清IgG 和支氣管肺泡灌洗液中IgA 水平。HA1-2-fliC 誘導(dǎo)的IgG1/IgG2a 比值為0.9，HA1-2-fliC 免疫后小鼠脾細(xì)胞中分泌IFN-γ 和IL-4 的細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)，這些表明HA1-2-fliC 既能誘導(dǎo)Th1 型免疫反應(yīng)也能誘導(dǎo)Th2 型免疫反應(yīng)。

TLR9 激動(dòng)劑CpG 是寡聚脫氧核苷酸，有相關(guān)研究提示其可以通過促進(jìn)上皮細(xì)胞分泌趨化因子CCL20 招募DCs 到上皮層，促進(jìn)DCs 捕獲呼吸道腔內(nèi)抗原[31]。在甲型流感病毒H7N9 疫苗的鼻內(nèi)給藥研究中發(fā)現(xiàn)，佐劑CpG 有效提高血清、NALT 上清液以及支氣管肺泡灌洗液中的IgG 和IgA 水平，還能提高長(zhǎng)效IFN-γ+T 細(xì)胞水平。在用H7N9 病毒感染小鼠后，未使用佐劑的鼻內(nèi)免疫組小鼠死亡率達(dá)60%，存活小鼠體質(zhì)量均下降；相反，使用佐劑的鼻內(nèi)免疫組小鼠存活率100%，僅在感染初期發(fā)生體質(zhì)量輕微下降[32]。

STING 信號(hào)通路能產(chǎn)生Ⅰ型干擾素和促炎因子，在固有免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，因此能啟動(dòng)STING 信號(hào)通路的環(huán)二核苷酸（cyclic dinucleotide，CDN）也是黏膜疫苗佐劑的重要候選物。許多研究團(tuán)隊(duì)將CDN 作為呼吸道黏膜疫苗佐劑，證明其可以促進(jìn)趨化因子CXCL1，CCL2，CCL3，CXCL2，CCL5 的分泌和炎癥細(xì)胞的招募，顯著增強(qiáng)CD11c+細(xì)胞對(duì)抗原的攝取，可以明顯提高血清IgG 和黏膜IgA 水平，增強(qiáng)宿主對(duì)各種致病菌感染的抵抗力，例如流感病毒、百日咳桿菌和肺炎鏈球菌等[33]。

4 遞送系統(tǒng)

除了通過佐劑來提高抗原的免疫原性，還需要遞送系統(tǒng)來為抗原“保駕護(hù)航”。只有讓抗原完整到達(dá)免疫誘導(dǎo)部位，才有望激活免疫反應(yīng)。例如重組蛋白疫苗和核酸疫苗的抗原都是大分子物質(zhì)，很難穿過復(fù)雜的黏膜屏障，必須使用遞送系統(tǒng)將抗原轉(zhuǎn)運(yùn)到合適部位誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。遞送系統(tǒng)的作用，一是保護(hù)抗原免受黏液中蛋白酶、核酸酶和sIgA等物質(zhì)的降解；二是確?？乖c佐劑能共同遞送；三是延長(zhǎng)疫苗在黏膜的保留時(shí)間；四是增加大分子抗原的體積以促進(jìn)局部黏膜免疫，原因是太小顆粒的抗原易逃逸局部加工處理而直接擴(kuò)散到輸出淋巴管，導(dǎo)致局部黏膜免疫耐受[34-35]。不同于注射型疫苗，呼吸道黏膜給藥的抗原需以顆粒形式展示才能被APCs 識(shí)別進(jìn)而激活局部和系統(tǒng)性免疫應(yīng)答[35]。顆粒的直徑也很大程度上導(dǎo)致不同的免疫應(yīng)答類型：20 ～ 300 nm 顆粒偏向引起細(xì)胞免疫，其中200 ～300 nm 顆粒是最理想的能被DCs 攝取的顆粒，顆粒越小T 細(xì)胞免疫反應(yīng)越強(qiáng)；大于500 nm 的顆粒容易引發(fā)體液免疫；大于5 μm 的顆?？杀籑 細(xì)胞攝取，但只能引起一定的黏膜免疫反應(yīng)而不能引發(fā)系統(tǒng)性免疫反應(yīng)[9,35]。遞送系統(tǒng)按組成成分不同可分為多聚體顆粒、無機(jī)顆粒、脂類顆粒、病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）、自組裝蛋白顆粒、病毒載體和細(xì)菌載體等，本文主要介紹發(fā)展成熟的幾款遞送系統(tǒng)。需要說明的是，遞送系統(tǒng)也可能有佐劑效應(yīng)，一部分是材料本身具有佐劑效應(yīng)，另一部分是通過將佐劑與遞送系統(tǒng)結(jié)合增加了后者的靶向作用。

4.1 多聚體顆粒

多聚體顆粒通常由生物可降解的高分子材料組成，可分為天然多聚物和合成多聚物兩大類。天然多聚物包括殼聚糖、透明質(zhì)酸、普魯蘭淀粉納米顆粒、海藻酸鈉鹽納米顆粒等；合成多聚物包括聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(D，L-lactic-co-glycolic acid)，PLGA]、聚乳酸[poly(lactic acid)]、聚己酸內(nèi)酯納米顆粒、聚酸酐納米顆粒、聚磷腈納米顆粒等[36]。多聚體顆粒因其生物兼容性、生物降解性、無毒性以及方便修飾成所需形狀和尺寸等特點(diǎn)而得到廣泛研究。

上一部分提到了殼聚糖的佐劑效應(yīng)，實(shí)際上殼聚糖顆粒也是非常合適的鼻內(nèi)免疫遞送系統(tǒng)。殼聚糖顆粒有較大的容載量，可延長(zhǎng)抗原在黏膜的保留時(shí)間，易通過修飾控制抗原的釋放速率，可促進(jìn)DCs 攝取抗原，在小鼠、兔、雞、豬和牛等動(dòng)物模型中均顯示出良好的遞送能力[37]。同時(shí)擁有佐劑效應(yīng)和遞送能力的殼聚糖顆粒既能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的黏膜免疫反應(yīng)也能誘導(dǎo)有效的系統(tǒng)性免疫應(yīng)答，是呼吸道黏膜疫苗的理想遞送系統(tǒng)。

PLGA 是另一個(gè)研究成熟的且獲得美國(guó)FDA 批準(zhǔn)的有機(jī)多聚體遞送系統(tǒng)。PLGA 是由乳酸和羥基乙酸混合形成的共聚物，乳酸的比值越大，PLGA的生物降解速率越小。因此，可通過改變?nèi)樗岷土u基乙酸二者比值來影響包裹在PLGA 內(nèi)抗原的釋放速率或控制抗原的持續(xù)釋放，進(jìn)而影響免疫反應(yīng)[38]。例如，在一項(xiàng)研究中對(duì)比了脂質(zhì)-抗原肽被PLGA包裹其中（稱為NPs-1）或吸附在PLGA 表面（稱為NPs-2）這2 種形式疫苗的效果。結(jié)果顯示，不加載體的脂質(zhì)-抗原肽與NPs-1 和NPs-2 均能被DCs 捕獲，但脂質(zhì)-抗原肽組無法有效激活A(yù)PCs，而NPs-1 和NPs-2 均顯著提高APCs 表面成熟標(biāo)志物的水平，說明遞送系統(tǒng)PLGA 能輔助抗原活化APCs；同時(shí)，NPs-1 比NPs-2 更有效地促進(jìn)了抗原特異性IgG 和IgA 的表達(dá)，這可能與NPs-2 表面抗原更易脫落有關(guān)[39]。

4.2 無機(jī)顆粒

一些生物相容性的無機(jī)材料如金、銀、鉑、硅和碳等也可以形成顆粒，即無機(jī)顆粒，作為黏膜免疫疫苗的遞送系統(tǒng)[40]。無機(jī)顆粒載體擁有許多優(yōu)勢(shì)，比如免疫惰性，即載體本身不具有免疫原性；尺寸和形狀可控；表面易修飾等。Tao 等[41]將金納米顆粒作為鼻內(nèi)免疫的流感疫苗的載體，提高了流感病毒M2e 肽的免疫原性。

4.3 脂類顆粒

基于脂質(zhì)的遞送系統(tǒng)是指主要成分含有脂質(zhì)的一類顆粒狀載體，包括脂質(zhì)體、脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticle，LNP）、病毒小體、免疫刺激復(fù)合物等。脂質(zhì)體的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)是磷脂雙分子層和親水核心，是直徑在幾十納米至幾微米的球形載體，按形態(tài)可以分為單層磷脂雙分子層脂質(zhì)體、多層同球心磷脂雙分子層脂質(zhì)體和多囊泡脂質(zhì)體[42]。脂質(zhì)納米顆粒由陽離子脂質(zhì)/可電離脂質(zhì)和其他輔助性脂質(zhì)（如磷脂、膽固醇和聚乙二醇修飾脂）組成[43]。病毒小體是一類特殊的脂類顆粒，通過重建病毒包膜（含磷脂和包膜蛋白）來模擬病毒從而提高其載體效應(yīng)[44]。免疫刺激復(fù)合物是抗原與膽固醇、磷脂和皂苷QuilA混合后自發(fā)形成的帶負(fù)電荷的五角形十二面體，具有環(huán)狀穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[19]。

本文主要以脂質(zhì)體和LNPs 為例介紹脂類顆粒遞送系統(tǒng)。脂質(zhì)體的組成成分、形態(tài)結(jié)構(gòu)和修飾等會(huì)影響其遞送。例如磷脂尾部基團(tuán)的不飽和鍵數(shù)量和長(zhǎng)度會(huì)影響脂質(zhì)體的流動(dòng)性和滲透性；頭部基團(tuán)主要決定脂質(zhì)體的表面電荷，其中正電荷的遞送系統(tǒng)更有利于與表面負(fù)電的DCs 結(jié)合；膽固醇含量對(duì)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性有重要影響[19,45]。脂質(zhì)體和LNPs攜帶抗原的方式（抗原被包裹在顆粒內(nèi)或吸附在顆粒表面）也會(huì)影響免疫應(yīng)答[19,45]。此外，可以通過多種方式修飾脂質(zhì)體和LNPs 并將多種佐劑與遞送系統(tǒng)結(jié)合以誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答，例如通過靜電作用和共價(jià)結(jié)合在顆粒表面修飾佐劑或抗原；混合脂類佐劑到磷脂雙分子層內(nèi)部；包裹佐劑和抗原到顆粒內(nèi)部[45]。

Tada 等[46]為了研究陽離子脂質(zhì)體在鼻內(nèi)給藥疫苗中的作用，將卵清蛋白(ovalbumin，OVA) 混合陽離子脂質(zhì)體后鼻內(nèi)免疫小鼠。結(jié)果表明，對(duì)比僅免疫OVA 組，陽離子脂質(zhì)體+OVA 組顯著提高了OVA 特異性黏膜IgA 和血清IgG 的表達(dá)，有效誘導(dǎo)IL-6 在鼻道和脾臟中的分泌。該團(tuán)隊(duì)也證明了IL-6的分泌對(duì)鼻黏膜抗原特異性IgA 的分泌有重要影響。

Bernasconi 等[47]通過在LNP 表面共價(jià)結(jié)合抗原復(fù)合物和（或）包裹抗原復(fù)合物在親水核心內(nèi)來驗(yàn)證LNPs 是否能促進(jìn)抗原復(fù)合物誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)和預(yù)防效果。抗原復(fù)合物是甲型流感病毒M2e肽融合CTA1-DD 后形成的多肽，通過硫醇-馬來酰亞胺反應(yīng)與LNP 表面融合了馬來酰亞胺的脂質(zhì)（或聚乙二醇）共價(jià)結(jié)合。聚乙二醇能提高LNP 表面結(jié)合蛋白的容載量以及增加LNP 在體內(nèi)的保留時(shí)間。結(jié)果表明，相比單純鼻內(nèi)免疫抗原復(fù)合物，通過LNP 遞送抗原復(fù)合物能在呼吸道局部有效誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗原特異性IgA表達(dá)以及Th1和Th17型免疫應(yīng)答、提高肺部駐留CD4+T 細(xì)胞水平。LNP 遞送抗原復(fù)合物鼻內(nèi)免疫后的小鼠在高毒性流感病毒感染后存活率明顯提高。

4.4 病毒樣顆粒

VLPs 是由一種或多種病毒蛋白組裝成的模擬病毒形態(tài)的遞送系統(tǒng)。VLPs 大小和結(jié)構(gòu)都與病毒粒子相似，具有免疫原性而無感染性，其表面可以展示高度重復(fù)的抗原表位。有許多病毒蛋白能自組裝成VLPs，例如流感病毒M1 蛋白、乙型肝炎病毒（hepatitis B，HBV）核心蛋白、噬菌體Qβ 衣殼蛋白和諾如病毒衣殼蛋白突出結(jié)構(gòu)域（protrusion domain，P-domain）。部分VLPs 自身即是抗原，例如流感病毒VLPs 和HBV-VLPs，可直接作為相應(yīng)病原體的預(yù)防性疫苗；另一部分VLPs 通過表面修飾抗原或內(nèi)部包裹抗原成為很好的遞送系統(tǒng)，例如Qβ-VLPs 和P-VLPs[19]。

在呼吸道給藥疫苗研究中，流感病毒VLPs 的研究相對(duì)成熟，一項(xiàng)研究表明H1N1-VLPs 鼻內(nèi)給藥能誘導(dǎo)有效的保護(hù)性免疫反應(yīng)。該團(tuán)隊(duì)重組表達(dá)H1N1 流感病毒的H1，N1 和M1 蛋白并獲得這3 種蛋白組裝而成的VLPs。相比肌肉注射，鼻內(nèi)免疫VLPs 能在支氣管和肺部誘導(dǎo)更高濃度的炎癥相關(guān)細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，且伴隨肺部CD11bhigh和CD103+DCs數(shù)量的增加，鼻內(nèi)給藥VLPs 能誘導(dǎo)更強(qiáng)的T 細(xì)胞反應(yīng)且偏向Th1 型免疫應(yīng)答[48]。流感病毒VLPs 有望解決流感病毒多亞型、易變異等問題，方法是混合多亞型流感病毒抗原構(gòu)建多效價(jià)的VLPs 疫苗，以及添加佐劑修飾VLPs 促進(jìn)其成為廣譜流感疫苗[49]。

Bessa 等[50]通過Qβ-VLPs 遞送流感病毒M2 蛋白，研究該疫苗在鼻內(nèi)給藥和肌肉注射2 種途徑下的免疫效果。結(jié)果表明，鼻內(nèi)給藥和肌肉注射均能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗原特異性IgG 反應(yīng)，但是鼻內(nèi)給藥更能誘導(dǎo)肺部IgA 的分泌。鼻內(nèi)給藥M2-Qβ-VLPs 能有效保護(hù)小鼠，使所有小鼠在致死劑量H1N1 病毒感染后存活下來。

4.5 自組裝蛋白顆粒

自組裝蛋白由多個(gè)重復(fù)蛋白自組裝成顆粒，可以包裹或吸附抗原。鐵蛋白自組裝蛋白遞送系統(tǒng)在鼻內(nèi)免疫中也得到了廣泛研究和應(yīng)用。一項(xiàng)研究表明鐵蛋白遞送系統(tǒng)能在沒有佐劑的輔助下誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答和有效的保護(hù)。該團(tuán)隊(duì)將表面共價(jià)結(jié)合流感病毒M2 蛋白的鐵蛋白納米顆粒通過鼻內(nèi)免疫小鼠，使小鼠獲得呼吸道黏膜和系統(tǒng)性免疫保護(hù)，并在同型H1N1 和異型H9N2 病毒的致命感染下存活。這項(xiàng)研究提示鐵蛋白納米顆粒能有效提高抗原的免疫原性以及提供交叉免疫保護(hù)[51]。

4.6 病毒載體和細(xì)菌載體

作為感染人類的病毒和細(xì)菌，其本身也能成為遞送系統(tǒng)，遞送抗原的模式可分為以下3 種：1）將病原菌或病毒減毒后作為載體；2）重組改造非致病的細(xì)菌或病毒，使其表達(dá)抗原，然后將其作為疫苗；3）重組有活性的非致病的細(xì)菌或病毒攜帶抗原相應(yīng)的DNA，使細(xì)菌或病毒感染人類后在體內(nèi)表達(dá)抗原[52]。

以腺病毒載體為例介紹。腺病毒載體具有以下特點(diǎn)：免疫激活性，腺病毒載體含有多種PAMPs，能激活宿主多條固有免疫反應(yīng)通路，誘導(dǎo)促炎因子的分泌而影響未成熟DCs 的分化；容載量大，能裝載6 ～ 35 kb 外源基因；相對(duì)的安全性；能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。針對(duì)流感、呼吸道合胞病毒綜合征和COVID-19 等多種疾病的腺病毒載體疫苗已進(jìn)入臨床研究階段。另外，腺病毒載體也是開發(fā)通用型流感疫苗的非常有潛力的途徑，例如讓腺病毒載體表達(dá)多種流感病毒高度保守抗原M1，M2 和HA2 以促進(jìn)機(jī)體獲得對(duì)各亞型流感病毒的保護(hù)性免疫[53]。腺病毒載體廣泛應(yīng)用于COVID-19 疫苗的開發(fā)，將在下一部分詳述。

5 呼吸道途徑給藥的COVID-19 疫苗

呼吸道黏膜疫苗雖已經(jīng)被研究多年，但已上市的僅5 款且均為減毒滅活疫苗[16]。然而在COVID-19的全球大流行背景下，呼吸道黏膜疫苗的開發(fā)取得不小進(jìn)展。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，截至2022 年5 月3 日，已有13 款呼吸道途徑給藥的COVID-19 疫苗（以下簡(jiǎn)稱呼吸道給藥新冠疫苗）進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，而且包含腺病毒載體和蛋白亞單位等多種類型的疫苗（見表1）。呼吸道給藥新冠疫苗取得的進(jìn)步將帶動(dòng)其他呼吸道黏膜疫苗的開發(fā)，以下將闡述新冠疫苗在呼吸道給藥研究中取得的進(jìn)展，為呼吸道黏膜疫苗的開發(fā)提供一定的參考。

表 1 進(jìn)入臨床階段的呼吸道給藥的新型冠狀病毒肺炎疫苗[54]Table 1 Respiratory mucosal vaccines against COVID-19 in clinical trials [54]

大部分新冠疫苗只能預(yù)防下呼吸道感染或避免患病，并不能實(shí)現(xiàn)上呼吸道的“消除性免疫”，這意味著病毒仍然可能在已接種疫苗人群中傳播，而呼吸道給藥新冠疫苗有望阻斷病毒在上、下呼吸道的感染及隨后的傳播，具有很高的研發(fā)價(jià)值[55]。ChAdOx1 nCoV-19 是已上市的新冠疫苗之一，給恒河猴肌肉注射該疫苗后雖能預(yù)防其肺部感染和肺炎，但不能避免上呼吸道感染和阻斷病毒脫落[56]。于是相關(guān)團(tuán)隊(duì)對(duì)ChAdOx1 nCoV-19 的鼻內(nèi)給藥方式展開試驗(yàn)，結(jié)果表明在倉鼠和恒河猴動(dòng)物模型中，鼻內(nèi)給藥該疫苗均能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的黏膜免疫和體液免疫反應(yīng)。接觸感染了SARS-CoV2 的倉鼠后，鼻內(nèi)免疫組倉鼠比肌肉注射組顯示出更強(qiáng)的保護(hù)性免疫：鼻內(nèi)免疫組小鼠咽拭子中病毒RNA 和感染性病毒含量更低，肺組織中未檢測(cè)出感染性病毒或病毒RNA，而肌肉注射組4 只倉鼠中有3 只出現(xiàn)輕微的間質(zhì)性肺炎[57]。目前鼻內(nèi)給藥ChAdOx1 nCoV-19 疫苗已進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)。另一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)對(duì)比了腺病毒載體疫苗Ad5-nCoV 在霧化吸入、肌肉注射以及2 種途徑混合給藥中的安全性、耐受性和免疫原性。結(jié)果表明，2 劑劑量的霧化吸入Ad5-nCoV 疫苗（相當(dāng)于1 劑肌肉注射疫苗劑量的1/5或2/5）在18 歲及以上成年人中顯示出良好的耐受性，且未引發(fā)嚴(yán)重的不良反應(yīng)。接種2 劑霧化吸入Ad5-nCoV 疫苗（相當(dāng)于1 劑肌肉注射疫苗劑量的1/5）后，在第28 天測(cè)試志愿者血清中的抗體水平。霧化吸入Ad5-nCoV 疫苗誘導(dǎo)的能夠結(jié)合受體結(jié)合域（receptor-binding domain，RBD) 的 IgG 和IgA水平低于肌肉注射疫苗誘導(dǎo)的相應(yīng)抗體水平，但2種途徑誘導(dǎo)的中和抗體水平相近。霧化吸入Ad5-nCoV 疫苗能誘導(dǎo)抗體和Th1 型免疫反應(yīng)，而混合給藥（第1 劑肌肉注射，第2 劑霧化吸入）比單獨(dú)途徑給藥產(chǎn)生更好的免疫應(yīng)答[58]。

新冠疫苗開發(fā)的另一個(gè)挑戰(zhàn)是能否有效應(yīng)對(duì)SARS-CoV2 變異體。許多進(jìn)入臨床試驗(yàn)的呼吸道給藥新冠疫苗在動(dòng)物模型試驗(yàn)中顯示出很好的交叉免疫，例如在敲入人類血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2 基因的小鼠中，ChAd-SARS-CoV-2-S 展示出對(duì)B.1.351 和B.1.1.28 突變株的模擬病毒產(chǎn)生交叉保護(hù)作用[59]。另外，佐劑和遞送系統(tǒng)能通過誘導(dǎo)廣譜中和性抗體以及長(zhǎng)效CD4+和CD8+T 細(xì)胞來輔助新冠疫苗增強(qiáng)交叉免疫反應(yīng)和長(zhǎng)期保護(hù)能力。有研究表明SARSCoV2 會(huì)通過幾種免疫逃逸機(jī)制，如逃逸RLR 識(shí)別機(jī)制（機(jī)體識(shí)別病毒雙鏈RNA 的機(jī)制）和抑制RIG-Ⅰ蛋白表達(dá)與下游效應(yīng)因子的分泌，使得關(guān)鍵的Ⅰ型干擾素分泌減少，最終導(dǎo)致固有免疫應(yīng)答減弱。適當(dāng)?shù)墓逃忻庖邞?yīng)答對(duì)隨后的T 細(xì)胞活化和抗體親和力成熟具有重要影響。因此誘導(dǎo)合適的固有免疫能促進(jìn)持久的、有效的適應(yīng)性免疫反應(yīng)?；诖?，Jangra 等[60]組合了3 種重要的固有免疫PRR的配體，分別是納米乳劑（TLR 激動(dòng)劑和NLRP3激動(dòng)劑）和IVT DI（RIG-Ⅰ激動(dòng)劑），以此為佐劑及遞送系統(tǒng)結(jié)合SARS-CoV2 S1抗原構(gòu)成新冠疫苗。該新冠疫苗顯著提高小鼠血清中和抗體水平并增強(qiáng)Th1 型免疫應(yīng)答，而且展示出對(duì)B1.1.7，B.1.351 和P.1突變體很好的交叉免疫保護(hù)作用。

6 總結(jié)和展望

呼吸道感染是全球公共健康問題，特別是SARS-CoV2 仍在全球肆虐。呼吸道黏膜免疫對(duì)人類抵御呼吸道傳染性疾病的侵害十分重要，因此本文總結(jié)了呼吸道黏膜結(jié)構(gòu)和免疫機(jī)制及其對(duì)呼吸道黏膜疫苗開發(fā)的重要提示。呼吸道黏膜疫苗具有以下特點(diǎn)：1）能同時(shí)誘導(dǎo)局部免疫和全身性免疫，黏膜局部免疫應(yīng)答有利于誘導(dǎo)組織駐留記憶性細(xì)胞，促進(jìn)機(jī)體在接觸病原體時(shí)迅速誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)；2）有望在上、下呼吸道均建立免疫屏障，該屏障不僅能有效避免接種人員自身的感染，也能真正阻斷呼吸道病原體在人群中的傳播；3）有望誘導(dǎo)交叉免疫應(yīng)答，以應(yīng)對(duì)容易突變的病原體。為了真正實(shí)現(xiàn)呼吸道黏膜疫苗的優(yōu)勢(shì)，需設(shè)計(jì)出有效的疫苗制劑，特別是開發(fā)出適用于呼吸道途徑給藥的佐劑和遞送系統(tǒng)。因此，本文梳理了當(dāng)前研究相對(duì)成熟且有潛力的佐劑和遞送系統(tǒng)，希望能促進(jìn)呼吸道黏膜疫苗的開發(fā)。

呼吸道黏膜疫苗開發(fā)面臨許多挑戰(zhàn)。首先，面對(duì)容易突變的病原體，特別是流感病毒和SARSCoV2，需開發(fā)具有廣譜免疫效果的疫苗。目前已上市的呼吸道黏膜疫苗僅有流感的減毒疫苗，均未使用佐劑，而且因?yàn)榱鞲胁《救菀鬃儺悾@些疫苗在真實(shí)世界使用的有效性不佳[61]。因此廣譜流感疫苗亟待開發(fā)，例如使用其他類型疫苗（如重組亞單位疫苗和病毒載體疫苗等），使用合適的佐劑和遞送系統(tǒng)促進(jìn)交叉免疫反應(yīng)等。但是已獲得批準(zhǔn)的黏膜給藥佐劑和遞送系統(tǒng)數(shù)量有限，這也是亟待解決的問題。

其次，部分疫苗特別是新冠疫苗保護(hù)時(shí)長(zhǎng)有限，需開發(fā)長(zhǎng)效保護(hù)性疫苗。延長(zhǎng)疫苗的保護(hù)時(shí)長(zhǎng)關(guān)鍵在于黏膜組織駐留記憶性細(xì)胞的壽命。在小鼠感染甲型流感病毒后，肺部中CD8+TRM的壽命相對(duì)較短（半年左右），損害了后續(xù)病毒感染的保護(hù)能力。隨后的研究表明，在鼻內(nèi)免疫疫苗后，靜脈注射疫苗誘導(dǎo)的全身性免疫能維持肺部CD8+TRM的穩(wěn)定存在。提示可以針對(duì)呼吸道感染疾病設(shè)計(jì)黏膜免疫和全身性免疫混合接種的疫苗。另外，組織駐留的記憶性B 細(xì)胞和TRM需要肺部駐留的輔助性T 細(xì)胞的支持以應(yīng)答病毒感染，這些細(xì)胞都是促進(jìn)長(zhǎng)期免疫記憶性的重要細(xì)胞[3]。因此在設(shè)計(jì)疫苗的過程中，需充分考慮如何誘導(dǎo)這些關(guān)鍵細(xì)胞。

最后，目前科研人員并不完全清楚黏膜免疫機(jī)制，只有對(duì)呼吸道黏膜結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制了解深入，才能理性開發(fā)出合適的呼吸道黏膜疫苗。因?yàn)殚L(zhǎng)期處于接觸“異物”的一線，黏膜結(jié)構(gòu)多樣，細(xì)胞組成復(fù)雜，擁有特有的IgA 抗體和物理化學(xué)屏障。這些都在黏膜免疫保護(hù)中起重要作用。因此，不管是固有免疫還是特異性免疫，不管是局部還是全身免疫反應(yīng)，都值得深入研究，探明其相互關(guān)系。

綜上，呼吸道黏膜是十分有潛力的疫苗給藥途徑，亟待合適制劑設(shè)計(jì)促進(jìn)其成熟和應(yīng)用。