莫金英 余 希 周 靜 肖蒲軍 瞿志軍

深圳市龍崗中心醫(yī)院感染科，廣東深圳 518116

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球大約有2.4億人感染乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）。在我國(guó)，HBV的感染者超過(guò)9000萬(wàn)例。目前，主要通過(guò)核苷（酸）類藥物[nucleos （t）ide analogues，NAs]抑制乙肝病毒脫氧核糖核酸（hepatitis B virus deoxyribonucleic acid，HBV DNA）的復(fù)制，延緩肝硬化、肝癌的發(fā)生。長(zhǎng)期的抗病毒治療不僅會(huì)帶來(lái)乳酸酸中毒、腎功能損害、肌炎等藥物相關(guān)毒副作用，還會(huì)增加患者的經(jīng)濟(jì)及心理負(fù)擔(dān)，部分患者因無(wú)法忍受長(zhǎng)期服藥而自行停藥，從而導(dǎo)致肝炎再活動(dòng)甚至肝衰竭、肝硬化的發(fā)生。因此，尋找有效的生物學(xué)標(biāo)志物評(píng)估患者停藥的安全性仍是慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）治療中急需解決的問(wèn)題之一。共價(jià)閉合環(huán)狀脫氧核糖核酸（covalently closed circular deoxyribonucleic acid，cccDNA）是導(dǎo)致CHB患者停藥后復(fù)發(fā)的重要原因。相關(guān)研究表明，乙肝病毒前基因組核糖核酸（hepatitis B virus prege nomic ribonucleic acid，HBVpgRNA）是HBV復(fù)制的中間產(chǎn)物，由cccDNA轉(zhuǎn)錄而來(lái)，與肝細(xì)胞內(nèi)的cccDNA轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)。本研究主要比較CHB患者停用NAs治療后病毒學(xué)復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組患者血清中HBVpgRNA、乙肝病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）等相關(guān)指標(biāo)的差異性，探討HBVpgRNA表達(dá)水平對(duì)CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學(xué)復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2020年1月深圳市龍崗中心醫(yī)院肝病門診就診的42例CHB停藥患者作為研究對(duì)象，對(duì)入組患者進(jìn)行24個(gè)月的隨訪，將病毒學(xué)復(fù)發(fā)作為隨訪終點(diǎn)，根據(jù)隨訪結(jié)果分為病毒學(xué)復(fù)發(fā)組（20例）和未復(fù)發(fā)組（22例）。病毒學(xué)復(fù)發(fā)組中，男16例，女4例；年齡30～50歲，平均（39.50±5.99）歲。未復(fù)發(fā)組中，男18例，女4例；年齡28～53歲，平均（42.27± 7.09）歲。兩組患者的性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。停藥時(shí)病毒學(xué)復(fù)發(fā)組有7例患者的HBVpgRNA檢測(cè)陽(yáng)性，未復(fù)發(fā)組有2例HBVpgRNA檢測(cè)陽(yáng)性。兩組間的HBVpgRNA檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①CHB患者停藥前接受NAs治療4年；②停藥時(shí)乙肝病毒e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）陰性，且HBV DNA＜20 U/ml，肝功能丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ala nine aminotransferase，ALT）、門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）均在正常值范圍內(nèi)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他病毒如丙型肝炎病毒、艾滋病病毒感染者；②合并自身免疫性肝病或其他結(jié)締組織病需長(zhǎng)期使用激素或免疫抑制劑治療者；③合并肝癌或肝硬化患者；④合并妊娠的患者?；颊呒捌浼覍倬橥獗狙芯?，且本研究經(jīng)深圳市龍崗中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批[批準(zhǔn)文號(hào)：20210426022（SZLG）250001]。

1.2 方法

分別于患者停藥時(shí)、停藥后前3個(gè)月每個(gè)月及隨后的每3個(gè)月各采集外周血15～20 ml，室溫下用3500 r/min（離心機(jī)半徑13.5 cm）的速度離心處理10 min分離出血清。使用美國(guó)ABI Prism 7500熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀，采用磁珠法進(jìn)行HBVpgRNA檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自北京熱景生物技術(shù)股份有限公司；使用美國(guó)VIIA7熒光定量PCR儀，采用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行HBV DNA檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自湖南圣湘生物科技股份有限公司；使用美國(guó)雅培I2000SR免疫分析儀，采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行乙肝五項(xiàng)定量測(cè)定，試劑盒購(gòu)自美國(guó)雅培公司；使用羅氏全自動(dòng)生化分析儀（C702-2），采用酶法檢測(cè)肝功能，試劑盒購(gòu)自羅氏集團(tuán)有限公司，均嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

病毒學(xué)復(fù)發(fā)定義為HBV DNA＞2000 U/ml，隨訪終點(diǎn)為病毒學(xué)復(fù)發(fā)，無(wú)病毒學(xué)復(fù)發(fā)患者最長(zhǎng)隨訪24個(gè)月。比較病毒學(xué)復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組患者停藥時(shí)及隨訪結(jié)束時(shí)的HBVpgRNA、HBsAg滴度水平，并分析與病毒學(xué)復(fù)發(fā)相關(guān)的危險(xiǎn)因素。HBVpgRNA≥300 copies/ml為陽(yáng)性，將未檢測(cè)到HBVpgRNA的樣本賦值為150 copies/ml進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。HBsAg正常范圍為0.00～0.05 U/ml，HBV DNA檢測(cè)下限值為20 U/ml，ALT正常范圍為7～40 U/L，AST正常范圍為13～35 U/L。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組間相關(guān)指標(biāo)的比較

病毒學(xué)復(fù)發(fā)組在停藥時(shí)及隨訪結(jié)束時(shí)血清中的HBVpgRNA和HBsAg滴度水平均明顯高于未復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。病毒學(xué)復(fù)發(fā)組隨訪結(jié)束時(shí)的HBsAg和HBVpgRNA滴度水平均明顯高于停藥時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。未復(fù)發(fā)組隨訪結(jié)束時(shí)血清中的HBsAg滴度水平明顯高于停藥時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。未復(fù)發(fā)組停藥時(shí)及隨訪結(jié)束時(shí)血清中的HBVpgRNA滴度水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組患者停藥時(shí)的肝功能ALT、AST水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；隨訪結(jié)束時(shí)，病毒學(xué)復(fù)發(fā)組的ALT、AST水平顯著高于未復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組相關(guān)指標(biāo)的比較（±s）

2.2 病毒學(xué)復(fù)發(fā)及預(yù)測(cè)因素分析

采用單因素COX回歸分析篩選出影響患者停藥后病毒學(xué)復(fù)發(fā)的2個(gè)相關(guān)因素，即停藥時(shí)的血清HBVpgRNA陽(yáng)性、HBsAg＞1000 U/ml（表2），同時(shí)對(duì)相關(guān)因素進(jìn)行賦值（表3）。停藥時(shí)血清中的HBVpgRNA陽(yáng)性是導(dǎo)致CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學(xué)復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P=0.045），與HBVpgRNA陰性患者相比，HBVpgRNA陽(yáng)性患者停藥后出現(xiàn)病毒學(xué)復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)明顯升高（HR=3.99，95%CI：1.03～15.38）。停藥時(shí)HBsAg＞1000 U/ml是導(dǎo)致CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學(xué)復(fù)發(fā)的另一獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P=0.000），HBsAg＞1000 U/ml的患者停藥后出現(xiàn)病毒學(xué)復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)要明顯高于HBsAg≤1000 U/ml患者（HR=20.81，95%CI：4.66～92.99）（表4）。

表2 單因素回歸分析篩選出相關(guān)因素

表3 相關(guān)因素賦值

表4 多因素回歸分析結(jié)果

2.3 乙肝病毒前基因組核糖核酸與乙肝病毒表面抗原預(yù)測(cè)病毒學(xué)復(fù)發(fā)的效能

ROC曲線顯示，HBVpgRNA單獨(dú)預(yù)測(cè)CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學(xué)復(fù)發(fā)的曲線下面積（the area under the curve，AUC）為0.857（95%CI：0.71～0.95，P＜0.05），敏感性為65.00%，特異性為100.00%。HBsAg單獨(dú)預(yù)測(cè)CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學(xué)復(fù)發(fā)的AUC為0.886 （95%CI：0.75～0.96，P＜0.05），敏感性為90.00%，特異性為77.27%。HBsAg與HBVpgRNA聯(lián)合檢測(cè)的AUC為0.936，與兩者單獨(dú)預(yù)測(cè)的AUC值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），敏感性為90.00%，特異性為86.36%（表5、圖1）。

圖1 乙肝病毒前基因組核糖核酸與乙肝病毒表面抗原預(yù)測(cè)病毒學(xué)復(fù)發(fā)的ROC曲線圖

表5 乙肝病毒前基因組核糖核酸與乙肝病毒表面抗原預(yù)測(cè)病毒學(xué)復(fù)發(fā)的效能

3 討論

目前，在現(xiàn)有的國(guó)內(nèi)外的CHB防治指南中并未提出能有效預(yù)測(cè)NAs安全停藥的生物學(xué)標(biāo)志物。既往主要依據(jù)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換、HBVDNA轉(zhuǎn)陰、肝功能ALT復(fù)常等情況為患者提供停藥建議，但復(fù)發(fā)率非常高。還有研究建議結(jié)合HBsAg檢測(cè)情況評(píng)估患者停藥的安全性，但結(jié)果并不理想。相關(guān)研究認(rèn)為，CHB患者停用抗病毒藥物時(shí)的HBsAg表達(dá)水平與停藥后的病毒學(xué)復(fù)發(fā)無(wú)明顯相關(guān)性。因此，尋找能有效預(yù)測(cè)NAs安全停藥的生物學(xué)標(biāo)志物指導(dǎo)CHB患者停藥具有非常重要的臨床意義。

HBVpgRNA是cccDNA最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其長(zhǎng)度大約為3.5 kb。相關(guān)研究證實(shí)，cccDNA轉(zhuǎn)錄為HBVpgRNA的過(guò)程不會(huì)被NAs的治療所阻斷。在本研究中，42例經(jīng)過(guò)4年及以上長(zhǎng)期使用NAs治療的CHB患者在停藥時(shí)HBVDNA＜20 U/ml的情況下，仍有9例患者的HBVpgRNA檢測(cè)陽(yáng)性；同時(shí)，病毒學(xué)復(fù)發(fā)組在停藥時(shí)基線及出現(xiàn)病毒學(xué)復(fù)發(fā)時(shí)血清中的HBVpgRNA和HBsAg滴度水平均明顯高于未復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示在停藥時(shí)如果CHB患者血清中還檢測(cè)到HBVpgRNA存在，則肝細(xì)胞內(nèi)仍然存在具有轉(zhuǎn)錄活性的cccDNA，預(yù)示停藥后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)大。另一項(xiàng)研究也顯示，相對(duì)于其他病毒學(xué)標(biāo)志物，血清中的HBVpgRNA表達(dá)水平在NAs治療的背景下可以更好地反映肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA的活性。小樣本臨床研究顯示，停藥時(shí)血清HBVpgRNA的表達(dá)水平可以預(yù)測(cè)停藥后HBV反彈的情況。在本研究中，多因素COX回歸分析顯示，停藥時(shí)血清中的HBVpgRNA陽(yáng)性是導(dǎo)致病毒學(xué)復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=3.99，95%CI：1.03～15.38，P=0.045），停藥時(shí)的HBsAg＞1000 U/ml是導(dǎo)致病毒學(xué)復(fù)發(fā)的另一獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=20.81，95%CI：4.66～92.99，P=＜0.001），這與Fan等的研究結(jié)果相類似。Fan等對(duì)40例患者（初治時(shí)HBeAg陽(yáng)性，使用恩替卡韋或替諾福韋治療）進(jìn)行停藥后隨訪5.5年發(fā)現(xiàn)，停藥時(shí)HBV DNA及HBV RNA檢測(cè)均為陰性的患者4年后的臨床復(fù)發(fā)比例（2/35）明顯低于HBV DNA或RNA陽(yáng)性的患者（32/ 102）（P=0.018）。但是，在另一項(xiàng)研究中卻顯示，HB-sAg≤100 U/ml可作為指導(dǎo)CHB患者安全停藥的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，而HBV RNA的表達(dá)水平不是預(yù)測(cè)患者停藥后出現(xiàn)病毒學(xué)或臨床復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這些研究結(jié)果的差異可能與停藥時(shí)患者的HBeAg狀態(tài)、HBsAg滴度水平以及HBV RNA檢測(cè)的敏感性有關(guān)。此外，本研究的ROC曲線結(jié)果顯示，HBVpgRNA表達(dá)水平對(duì)CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學(xué)復(fù)發(fā)具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值，AUC為0.857，特異性為100%，但敏感性較差（僅為65.00%）；與HBsAg聯(lián)合檢測(cè)后，AUC高達(dá)0.936，敏感性也提高到90%，可以為CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學(xué)復(fù)發(fā)的判斷提供輔助依據(jù)。由此可見(jiàn)，停藥時(shí)患者血清中的HBVpgRNA和HBsAg表達(dá)水平可以作為CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學(xué)復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)因子，對(duì)指導(dǎo)CHB患者安全停藥具有一定的臨床參考價(jià)值。由于本研究不是多中心大數(shù)據(jù)臨床研究，研究結(jié)論可能會(huì)存在一定的偏倚，關(guān)于HBVpgRNA 在CHB患者安全停藥方面的價(jià)值仍有待更多的臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，病毒學(xué)復(fù)發(fā)患者停藥時(shí)的HBVpgRNA及HBsAg表達(dá)水平均顯著高于未復(fù)發(fā)患者，HBVpgRNA陽(yáng)性和HBsAg＞1000 U/ml是CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學(xué)復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對(duì)預(yù)測(cè)CHB患者安全停藥具有一定的臨床價(jià)值。