李亮，胡登林，羅鵬輝*，楊會(huì)國(guó)

（1.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站，烏魯木齊 830000；2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊 830000）

綿羊是人類最早馴養(yǎng)的家畜種類，我國(guó)先后從澳大利亞、新西蘭、南非等引進(jìn)了不同的綿羊品種，且在不斷引進(jìn)、變化中[1]。據(jù)《中國(guó)畜禽遺傳資源志·羊志》統(tǒng)計(jì)，我國(guó)一共有71個(gè)綿羊品種，其中42個(gè)地方品種，21個(gè)培育品種，8個(gè)引入品種。眾多綿羊品種為我國(guó)今后的綿羊育種工作、基因挖掘等科技研究提供了良好的基礎(chǔ)條件。

綿羊基因組一共27對(duì)，其中26對(duì)常染色體，1對(duì)性染色體。2004年美國(guó)、新西蘭、英國(guó)的科學(xué)家公布了第三代高密度的綿羊遺傳連鎖圖[2]。綿羊基因組學(xué)是開(kāi)展綿羊分子遺傳標(biāo)記研究應(yīng)用的基礎(chǔ)[3]。選擇性清掃是在全基因組水平上通過(guò)掃描家養(yǎng)動(dòng)物群體在馴化過(guò)程所受正向選擇的基因區(qū)域或分子標(biāo)記[4]，家畜在歷史馴化和品種培育及改良過(guò)程中已經(jīng)受到了強(qiáng)烈的人工和自然選擇，在家畜的基因組上留下了選擇信號(hào)。

細(xì)毛羊脫毛癥，病程為1～3個(gè)月，發(fā)病率高，死亡率低，病羊體溫偏低；羊毛無(wú)光澤，毛質(zhì)粗糙，營(yíng)養(yǎng)不良，還會(huì)出現(xiàn)啃食被毛等異食癖，進(jìn)入干草期后，羊毛質(zhì)量更差，大量灰塵粘附在表皮，變?yōu)辄S土色，皮膚粗糙，彈性差，最終導(dǎo)致羊毛質(zhì)量下降和減產(chǎn)，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。為了找出細(xì)毛羊脫毛癥的病因，全球各國(guó)的科研人員都在努力，但始終無(wú)法確定病因。而且相關(guān)研究大多停留在表面。由于病因復(fù)雜，一般將其簡(jiǎn)單分為以下幾個(gè)方面：寄生蟲(chóng)病（疥螨和癢螨）；營(yíng)養(yǎng)代謝?。ㄈ狈α蚣昂虬被峄蜾\元素或銅元素等）；傳染?。ňd羊痘和山羊痘等）；皮膚真菌病等。

多年以來(lái)，防治細(xì)毛羊脫毛癥的方法一般為：在飼料中添加缺少的營(yíng)養(yǎng)元素或者投放礦物質(zhì)緩釋丸，定期驅(qū)蟲(chóng)和使用抗生素等。但是這些防治手段效果差且多有反復(fù)，帶來(lái)許多不必要的麻煩，造成巨大的人力、物力和時(shí)間上的損失。在此情況下，從基因入手研究細(xì)毛羊脫毛癥是一個(gè)不錯(cuò)的選擇，因ORA2存在綿羊生長(zhǎng)選育相關(guān)分子標(biāo)記，受人工選擇強(qiáng)度大。存在更強(qiáng)的基因印跡，因此本研究將挖掘和分析中國(guó)美利奴羊OAR2上與脫毛癥有關(guān)的QTL。

在綿羊方面，Moradi等[5]基于Ovine SNP50 BeadChip對(duì)兩種不同類型的綿羊脂尾品種進(jìn)行基因組件的選擇信號(hào)分析，發(fā)現(xiàn)肥尾綿羊在OAR5和OARX有QTL重疊區(qū)域，瘦尾綿羊在OAR7有QTL重疊區(qū)域。Huihua Wang等[6]基于Ovine SNP50 BeadChip對(duì)三個(gè)綿羊品種（Mongolian fat-tailed，German Mutton Merino，African white Dorper）進(jìn)行基因組選擇信號(hào)分析，獲得APOBP和GTO為身體指數(shù)相關(guān)的候選基因，ALDOA為肉質(zhì)性狀候選基因，EDAR是羊毛性狀候選基因，MSRB3影響耳型大小等。Guan Wang[7]等通過(guò)對(duì)小尾寒羊和藏羊的心肌、骨骼肌、脾臟和腎臟基因表達(dá)的研究，發(fā)現(xiàn)在藏綿羊OPA1和MIC60基因表達(dá)高于小尾寒羊。王維民[8]基于綿羊重測(cè)序的方法，利用藏羊、阿爾泰羊、多浪羊、湖羊和蒙古羊的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)位于22號(hào)染色體上22.425-22.575Mb的選擇區(qū)域內(nèi)，存在已報(bào)道參與調(diào)控在血液中血紅蛋白水平和紅細(xì)胞數(shù)量及高海拔紅血球增多癥相關(guān)的CYP17基因，還發(fā)現(xiàn)多浪羊的2號(hào)染色體上53.1-53.25Mb區(qū)域內(nèi)的DNAJB5基因，該基因能提高細(xì)胞對(duì)熱應(yīng)激原的耐受性。

雖然傳統(tǒng)的育種方法在動(dòng)物育種工作中的確實(shí)取得了一些成果，但其局限性也很明顯，它無(wú)法準(zhǔn)確指明各個(gè)基因的功能，而且人工干預(yù)的程度低，無(wú)法在早期進(jìn)行選種，縮短世代間隔，育種的結(jié)果也不穩(wěn)定。很明顯這種費(fèi)時(shí)費(fèi)力并且結(jié)果不穩(wěn)定的育種技術(shù)已經(jīng)不能夠滿足現(xiàn)代畜牧業(yè)的育種要求，而分子遺傳學(xué)和動(dòng)物分子育種技術(shù)為此提供了新的解決辦法。

QTL是影響數(shù)量性狀的一個(gè)染色體片段[9]，包含決定某個(gè)數(shù)量性狀的基因或微效基因簇。它可以借助遺傳標(biāo)記和統(tǒng)計(jì)分析來(lái)確定性狀與基因的關(guān)系。這一現(xiàn)象為動(dòng)物的育種技術(shù)升級(jí)提供理論依據(jù)。目前，Animal QTLdb數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)收錄了大量畜禽的QTL，其中豬有25 610個(gè)，雞有7 812個(gè)，牛有99 652個(gè)，羊有1 658個(gè)，并且還在不斷收錄新的QTL，為未來(lái)精確研究單個(gè)基因效應(yīng)做好基礎(chǔ)工作，以推動(dòng)分子育種技術(shù)發(fā)展。

羊是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一，與羊毛相關(guān)的產(chǎn)業(yè)在我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中也非常重要，而我國(guó)羊毛生產(chǎn)現(xiàn)狀無(wú)論是數(shù)量還是質(zhì)量都無(wú)法滿足相關(guān)產(chǎn)業(yè)的需求，其中細(xì)毛羊脫毛是一個(gè)重要原因。對(duì)綿羊QTL研究開(kāi)發(fā)是利用遺傳資源最快的方法之一，但是細(xì)毛羊脫毛癥QTL的研究報(bào)道卻很少，因此這項(xiàng)工作非常必要。

綜上所述，對(duì)于中國(guó)的綿羊品種出現(xiàn)脫毛癥的問(wèn)題，在基因水平上的認(rèn)識(shí)十分有限。本研究擬從綿羊基因組芯片選擇性清掃分析的方法入手，考慮到OAR2分子標(biāo)記豐富，遺傳物質(zhì)多樣，因此進(jìn)行OAR2的挖掘及其分析，為細(xì)毛羊脫毛癥基因水平上的防治提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

在伊犁庫(kù)克圖拜種畜場(chǎng)，隨機(jī)挑選150只中國(guó)美利奴羊，分為病例組（50只）和健康組（100只）。樣品病理情況調(diào)查時(shí)間為2006年至2016年。

1.2 耳組織采集

用剪耳鉗在耳緣處剪下一黃豆大小的組織塊，去除掉組織塊上的毛和雜物，置于己滅菌的1.5 mL離心管中，編號(hào)后放入采樣冰盒，送往實(shí)驗(yàn)室，保存于-70℃的冰箱。

1.3 樣品DNA提取

粉碎耳組織，采用氛氯仿法進(jìn)行DNA提取。由生物公司進(jìn)行Ilumina Ovine SNP50 BeadChip制備，再由BeadScan Software軟件將圖像進(jìn)行轉(zhuǎn)換，形成數(shù)據(jù)信號(hào)，然后我們?cè)倮肎enome Studio軟件對(duì)基本的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行處理，Plink1.07軟件將其轉(zhuǎn)換為MAP和PED文件。

1.4 基因型檢測(cè)

篩選生物技術(shù)公司提供的數(shù)據(jù)和SNP等位基因頻率分析，舍棄非目標(biāo)SNPs位點(diǎn)。用Plink1.07軟件對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制：排除樣品中檢出率低于95%的單體樣品。同時(shí)，排除質(zhì)量不合格的SNPs，檢出率低于90%、最小等位基因頻率低于5%、哈代-溫伯格平衡檢驗(yàn)P值低于1×10-6的SNPs。

1.5 Fst檢測(cè)

本研究中，根據(jù)無(wú)偏估計(jì)Fst方法計(jì)算留下的SNP位點(diǎn)，獲得兩個(gè)群體的每個(gè)SNP位點(diǎn)的群體分化指數(shù)Fst值[10]。計(jì)算公式如下：

MSG為檢測(cè)的群體內(nèi)部位點(diǎn)的誤差均方：

MSP是檢測(cè)的群體之間位點(diǎn)的均方差：

校正后的群體間平均樣本大?。?/p>

上述公式中，i是總亞群數(shù)S的一個(gè)群體，i=1，2，3，4…S；PAi是第i個(gè)亞群中SNP等位基因A的頻率；ni是亞群體i的平均樣本大??；PA是各群體中PA的加權(quán)平均值，即

本研究的Fst數(shù)據(jù)計(jì)算基于（http：//www.r-project.org/）R語(yǔ)言pegas軟件包完成，畫(huà)圖基于R語(yǔ)言ggplot軟件包完成。

2 結(jié)果與分析

用分光光度計(jì)來(lái)檢測(cè)所提取的耳組織DNA的濃度和純度，濃度大于50 ng/μL，純度OD260/OD280在1.7～2.0之間，OD260/OD230應(yīng)介于1.8～2.1之間。用0.8%的瓊脂糖凝膠，驗(yàn)證所提取的耳組織基因組DNA。

如圖1所示，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的條帶清晰帶型完整，點(diǎn)樣空干凈無(wú)污染沒(méi)有拖尾現(xiàn)象。可以說(shuō)明所作電泳檢測(cè)的DNA沒(méi)有被蛋白污染，沒(méi)發(fā)生降解，其檢測(cè)質(zhì)量合格，滿足高密度基因組芯片制備的條件。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)過(guò)PLINK提取2號(hào)染色體，共獲得5 470個(gè)，經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制后獲得SNPs 3 125個(gè)。對(duì)該染色體利用vcftools軟件對(duì)病例組和健康組進(jìn)行基因組選擇信號(hào)分析，通過(guò)Fst計(jì)算，將所對(duì)應(yīng)1% SNPs閾值以上的位點(diǎn)為有意義的分子標(biāo)記。共獲得31個(gè)分子標(biāo)記，對(duì)其進(jìn)行基因功能注釋，獲得相關(guān)基因51個(gè)(表1，圖2)，通過(guò)查閱文獻(xiàn)和基因功能分析，其中有7個(gè)和脫毛癥相關(guān)，分別是ADAM29、CTLA4、LPL、RPL21、NR4A2、TMEFF1、ICOS（表2）。

表2 脫毛癥相關(guān)候選基因及其主要功能

圖2 健康和脫毛癥綿羊全基因組分化系數(shù)分析（Fst）曼哈頓圖及OAR2上Fst值分布情況

表1 在2號(hào)染色體上健康和脫毛癥綿羊全基因組選擇信號(hào)分析（Fst≥0.247）

續(xù)表

3 討 論

本研究通過(guò)對(duì)中國(guó)美利奴羊脫毛癥在OAR2上進(jìn)行選擇信號(hào)分析，共獲得有意義的分子標(biāo)記31個(gè)，經(jīng)過(guò)基因功能注釋，獲得相關(guān)基因51個(gè)。中國(guó)美利奴羊脫毛癥在基因因素提供分子標(biāo)記，為以后中國(guó)美利奴羊健康選育提供分子理論支撐，通過(guò)選擇育種后，使得中國(guó)美利奴羊向著疾病少，產(chǎn)毛好的方向發(fā)展。細(xì)毛羊脫毛癥給全世界的細(xì)毛羊羊毛產(chǎn)業(yè)帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)損失，但是對(duì)于細(xì)毛羊脫毛癥在基因組水平研究報(bào)道較少。不同的疾病或營(yíng)養(yǎng)都會(huì)引起綿羊免疫系統(tǒng)下降導(dǎo)致脫毛癥現(xiàn)象的產(chǎn)生，因不同個(gè)體綿羊的免疫系統(tǒng)受到父本和母本影響，在這種遺傳形式下，因免疫系統(tǒng)下降導(dǎo)致出現(xiàn)脫毛癥的個(gè)體，將會(huì)發(fā)病，引起發(fā)病的原因主要受環(huán)境和基因共同決定。環(huán)境層面主要是集中在疾病、寄生蟲(chóng)、營(yíng)養(yǎng)等因素，而對(duì)于基因組層面的研究較少，本論文正是通過(guò)基因組層面對(duì)綿羊脫毛癥的現(xiàn)象進(jìn)行分析，從而獲得和脫毛癥相關(guān)的分子標(biāo)記。經(jīng)過(guò)基因組選擇信號(hào)分析，我們一共找到了7個(gè)脫毛癥相關(guān)的候選基因，它們分別是ADAM29、CTLA4、LPL、RPL21、NR4A2、TMEFF1、ICOS。

ADAM29是ADAM（解整合素和金屬蛋白酶）基因家族中的一個(gè)，以前已經(jīng)證明它在食管癌中具有重要影響，根據(jù)最新調(diào)查結(jié)果顯示，超過(guò)15%的黑素瘤病例中發(fā)現(xiàn)它的突變，在人類疾病中，黑素瘤病因免疫力下降，導(dǎo)致出現(xiàn)脫發(fā)等現(xiàn)象。ADAM29中鑒定突變子集的功能分析顯示出它們?cè)黾恿撕谏亓黾?xì)胞與對(duì)膠原蛋白I，II和IV的粘附，這表示他們的確是黑色素瘤的啟動(dòng)因素[11]。

CTLA4是白細(xì)胞分化抗原，是T細(xì)胞上的受體，與CD28共享B7分子配體，當(dāng)CTLA4與B7分子結(jié)合后，誘導(dǎo)T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性，參與免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)。人CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和人IgG1的Fc部分的片段組成CTLA4Ig，這是一種可溶性嵌合蛋白。它與抗原呈遞細(xì)胞（APC）上的B7-1和B7-2分子結(jié)合，阻斷CD28介導(dǎo)的共刺激信號(hào)，以進(jìn)行T細(xì)胞活化[12]。CTLA4通過(guò)與B7結(jié)合抑制T細(xì)胞活性，造成自身免疫疾病，由此引發(fā)包括卵巢、食管、腸道、皮膚等全身多處的病變，根據(jù)研究顯示，斑丘疹、瘙癢、牛皮癬、皮疹、天皰瘡、皮肌炎、斑禿、苔蘚樣反應(yīng)、白癜風(fēng)、結(jié)節(jié)病、指甲和口腔粘膜病變等多種皮膚問(wèn)題都與CTLA4有關(guān)[13～15]。

LPL是脂蛋白脂肪酶基因，但是最新研究發(fā)現(xiàn)，它可以通過(guò)影響抗氧化酶的表達(dá)水平，影響細(xì)胞衰老，對(duì)真皮成纖維細(xì)胞的修復(fù)造成影響[16]。

RPL21基因編碼核糖體蛋白L21，它是60S亞單位的組分。L21由160個(gè)氨基酸殘基組成，屬于L21e家族。它位于細(xì)胞質(zhì)中，是核糖體結(jié)構(gòu)的一部分。核糖體蛋白L21的功能分析表明，它與白內(nèi)障和結(jié)直腸癌有關(guān)[17，18]。此外，RPL21可能與遺傳少毛癥有關(guān)[19]。

NR4A2編碼的產(chǎn)物可以導(dǎo)致極化T細(xì)胞不能進(jìn)一步分化成成熟Th17細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致無(wú)法產(chǎn)生IL-21和IL-17，IL-17A特異性抗體在人類銀屑病，葡萄膜炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床試驗(yàn)中是有效的[20]。

TMEFF1編碼的跨膜蛋白，在其細(xì)胞外區(qū)域含有兩個(gè)卵泡抑素結(jié)構(gòu)域和一個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域。TGF-β信號(hào)能夠激活干細(xì)胞分化成為毛囊，雖然對(duì)TMEFF1蛋白質(zhì)知之甚少，但是霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所已經(jīng)證明了TMEFF1是TGF-β信號(hào)的直接靶基因并且在Telogen→Anagen轉(zhuǎn)變中的毛發(fā)表達(dá)[21]。

ICOS編碼的蛋白質(zhì)是CD28和CTLA-4細(xì)胞表面受體家族中的一員。它能夠形成同源二聚體，參與信號(hào)之間的信號(hào)傳導(dǎo)，免疫應(yīng)答和細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)。能夠引起自生免疫疾病，從而引發(fā)銀屑病等皮膚問(wèn)題，在皮膚傷口愈合等方面起到了關(guān)鍵的作用[22]。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)中國(guó)美利奴羊2號(hào)染色體進(jìn)行基因組選擇信號(hào)分析，經(jīng)過(guò)基因組注釋獲得7個(gè)和脫毛癥相關(guān)的基因ADAM29、CTLA4、LPL、RPL21、NR4A2、TMEFF1、ICOS。本研究結(jié)果，為中國(guó)美利奴羊的品種保護(hù)提供參考，為綿羊脫毛癥的育種選擇提供分子標(biāo)記，也為綿羊健康養(yǎng)殖提供參考。