吳勝斌 曹振東 王應燈 王蕾 蕢綱

(上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院 1.腎臟內科;2.中醫(yī)科，上海 200011)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最常見并發(fā)癥之一，數(shù)據(jù)[1]顯示，我國糖尿病患者35%以上會發(fā)展為糖尿病腎病。目前，臨床上一般采用控制飲食、生活方式及降糖藥物等控制患者血糖，以此延緩發(fā)展為DN的速度，但并不能從實質上對糖尿病腎病進行治療[2]。糖尿病患者發(fā)展為損傷的機制較為復雜，目前學者們一致認為主要因素為高糖、高血壓導致的代謝異常和血流動力學改變[3]。腎小球系膜細胞過度增殖、細胞外基質聚集等是DN早期重要的病理表現(xiàn)，其中腎小球系膜細胞和DN的發(fā)展密切相關[4]。近年來研究[5]發(fā)現(xiàn)，腎小球系膜細胞會因多種不同因素刺激而造成損傷，例如高糖、超氧化物、炎性因子、血管緊張素Ⅱ等，最終導致患者發(fā)展為糖尿病腎病。因此以人腎小球系膜細胞(Human mesangial cells，HMC)為研究對象，尋找合適的藥物修復其在特殊情況下導致的損傷具有重要的科研意義。人參皂苷是人參中有效活性成分之一，在抗炎、抗氧化等中發(fā)揮多種藥理作用[6-7]。有研究證實，人參皂苷Rg3可保護糖尿病大鼠的腎臟，并有效延緩纖維化的發(fā)展，在多種腎疾病中均有很好的保護作用[8]。目前DN的發(fā)病機制尚未完全闡明，有研究證實氧化應激和炎癥反應是DN發(fā)展中不可或缺的兩個驅動因素。核因子NF-E2相關因子(Nrf2)是轉錄因子中的一種，介導氧化應激通路，當Nrf2和抗氧化物反應元件(Antioxidant response elements，ARE)進行相互作用時，促進抗氧化蛋白、Ⅱ相解毒酶的表達，同時對體內氧化應激產(chǎn)生的自由基能有效清除，進而對細胞的氧化還原狀態(tài)進行維持；相反Nrf2的缺失會減少機體內的抗氧化酶，加重細胞中氧化應激的負效應，進而對氧化應激性纖維化疾病進行誘導[9-10]。本研究探討人參皂苷Rg3對高糖誘導腎小球系膜細胞纖維化、生物活性及Nrf2/ARE信號通路的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系 人腎小球系膜細胞購自中國上?？茖W院。

1.1.2 試劑和儀器 人參皂苷Rg3(山東靶點藥物研究有限公司)；Nrf2、ARE多克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；MTT試劑(廣州康盛生物科技股份有限公司)；MoFlo XDP流式細胞儀(Beckman Coulter公司)；150i二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)；TDZ4臺式低溫離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司)；電子分析天平(美國丹佛儀器公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組 常規(guī)復蘇人腎小球系膜細胞，將細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2及飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長，2～3 d傳代，當細胞生長達到60%～80%融合狀態(tài)時，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。將人腎小球系膜細胞分NC組(用含5.6 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)HMC細胞48 h)、HG組(用含30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)HMC細胞)、Rg3A組(用含30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)HMC細胞)、Rg3B組(用含30 mmol/L葡萄糖+30 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)HMC細胞)、Rg3C組(用含30 mmol/L葡萄糖+50 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)HMC細胞)。

1.3 MTT法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長的人腎小球系膜細胞，消化后接種于96孔板內，置于常規(guī)培養(yǎng)箱中分別配于12、24、48、72 h。將新鮮配制的5 g/L MTT溶液分別加入到空版內，棄掉上清液，將150 μL二甲基亞砜加入到各孔的細胞中，溶解甲瓚。測定酶標儀于490 nm處的吸光度值。

1.4 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 將各組細胞置于24孔板內，每組設4個復孔，培養(yǎng)48 h后，將Matrigel基質膠稀釋1倍后均勻的鋪在Transwell小室的上室微孔膜上，于常規(guī)培養(yǎng)箱孵育4 h。收集各組HMC細胞制成單細胞懸液，調整細胞密度為2×105/mL，常規(guī)培養(yǎng)箱饑餓培養(yǎng)細胞24 h。在上室中加入不含血清的饑餓培養(yǎng)細胞懸液，同時上室加入0.1%BSA，將500 μL含15%FBS的DMEM培養(yǎng)基加入到Transwell小室的下室中，培養(yǎng)36 h，用棉簽將上室上面的非侵襲細胞及基質膠擦拭干凈，于4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.01%伊紅染色液37℃染色30 min，懸掛晾干小室并置于載玻片上，倒置顯微鏡下隨機讀取10個高倍視野，計算穿模細胞數(shù)并取均值。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周期水平 取各組細胞，培養(yǎng)48 h后，用胰蛋白酶消化，PBS溶液洗滌細胞并重懸，用5 μL膜聯(lián)蛋白V-FITC和10 μL PI于室溫環(huán)境中染色細胞，15 min后孵育細胞，用流式細胞儀檢測細胞。凋亡細胞用膜聯(lián)蛋白V表達標記，和對照組比較后計算細胞的凋亡率。將各組細胞用冰冷的70%乙醇固定，PBS重懸細胞，將RNA酶加入到細胞中，于37℃環(huán)境中孵育細胞，30 min后將細胞置于400 μL PI中，室溫培養(yǎng)細胞40 min。用流式細胞儀分析G0、G1、S、M中不同相中的細胞。

1.6 ROS水平檢測 采用熒光探針DCFH-DA法檢測細胞內ROS水平。取各組細胞，培養(yǎng)48 h后，并懸浮于1 mL終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA液中，置于37℃培養(yǎng)箱避光孵育。30 min后離心細胞(1000 r/min，5 min)和PBS洗滌，上流式細胞儀488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長檢驗熒光強度(FI)，間接檢測ROS含量。

1.7 蛋白質印跡檢測細胞中Nrf2/ARE信號通路相關蛋白 Nrf2、HO-1蛋白表達及TGF-β、Ⅳ-C、FN的表達取各組細胞，培養(yǎng)48 h后裂解，離心裂解后的細胞，收集上清液，用BCA法測定上清液中的蛋白濃度。將5×上樣緩沖液加入到細胞中，煮沸細胞至變性，保存于-80℃環(huán)境中。取5 μL蛋白樣品并電泳，待半干時轉移到PVDF膜上，脫脂奶粉(5%)封閉1 h，用特異性抗體孵育膜過夜(4℃)，用對應的二抗繼續(xù)孵育2 h。用ECL法檢測，并分析蛋白條帶灰度值。

2 結果

2.1 各組細胞增殖能力比較 HG組細胞增殖活性較NC組顯著增加(P<0.05)；與HG組相比，Rg3A組、Rg3B組、Rg3C組細胞增殖活性均顯著降低(P<0.05)；Rg3C組細胞增殖活性低于Rg3B組，Rg3B組細胞增殖活性低于Rg3A組(P<0.05)。見圖1。

圖1 細胞增殖能力比較

2.2 各組細胞侵襲能力比較 NC組細胞侵襲數(shù)量為(1.10±0.10)個，與NC組相比，HG組細胞侵襲數(shù)量[(51.32±5.14)個]顯著增加(P<0.05)；與HG組相比，Rg3A組(34.67±4.08)個、Rg3B組(19.36±2.94)個、Rg3C組(6.82±1.17)個細胞侵襲數(shù)量均逐漸降低(P<0.05)；Rg3C組細胞侵襲數(shù)量均低于Rg3A組和Rg3B組。見圖2。

圖2 Transwell小室法檢測細胞侵襲數(shù)量

2.3 各組細胞凋亡能力和周期比較 HG組細胞凋亡率較NC組顯著降低(P<0.05)；與HG組相比，Rg3A組、Rg3B組、Rg3C組細胞凋亡率均顯著增加，且呈遞增趨勢(P<0.05)，且Rg3C組細胞凋亡率明顯高于Rg3A組和Rg3B組(P<0.05)。HG組細胞G1期明顯高于NC組(P<0.05)；與HG組相比，Rg3A組、Rg3B組、Rg3C組細胞G1期均顯著降低(P<0.05)；Rg3C組細胞G1期

表1 各組細胞凋亡能力和周期比較

圖3 流式細胞儀檢測細胞凋亡

2.4 各組細胞中ROS含量比較 NC組細胞中ROS含量為(1.00±0.11)，與NC組相比，HG組細胞中ROS含量(110.23±5.15)顯著增加(P<0.05)；Rg3A組(72.81±4.06)、Rg3B組(56.27±2.97)、Rg3C組(23.46±1.38)細胞中ROS含量顯著低于HG組(P<0.05)；與Rg3A組和Rg3B組相比，Rg3C組細胞中ROS含量最低(P<0.05)。見圖4。

圖4 顯微鏡下細胞內活性氧熒光強度(DCFH-DA探針染色，200×)

2.5 各組細胞中Nrf2、HO-1蛋白表達及TGF-β、Ⅳ-C、FN表達 與NC組相比，GH組細胞中Nrf2/ARE信號通路相關蛋白Nrf2和HO-1蛋白表達均顯著降低(P<0.05)；與GH組相比，Rg3A組、Rg3B組、Rg3C組細胞中Nrf2、HO-1蛋白表達均顯著增加，且Rg3C組細胞中蛋白表達增加最顯著(P<0.05)(見圖5A、圖5B)。與NC組相比，GH組細胞中TGF-β、Ⅳ-C、FN明顯增加(P<0.05)；與GH組相比，Rg3A組、Rg3B組、Rg3C組細胞中TGF-β、Ⅳ-C、FN表達均顯著降低，且Rg3C組低于Rg3B組低于Rg3A組(P<0.05)。見圖5C、圖5D。

圖5 各組細胞中Nrf2、HO-1蛋白表達及TGF-β、Ⅳ-C、FN表達

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病患者中最嚴重的一種微血管并發(fā)癥[11]。系膜細胞是腎小球內固有的活躍功能細胞，其過度增殖是糖尿病腎病中重要的病理特征。有研究發(fā)現(xiàn)，高糖可誘導系膜細胞的過度增殖，并對糖尿病腎病的發(fā)展有明顯的促進作用[12]。有學者們研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導的系膜細胞是觀察細胞增殖最優(yōu)的體外模型。因此，本研究采用人腎小球系膜細胞作為實驗細胞，同樣用高糖誘導系膜細胞發(fā)現(xiàn)其發(fā)生過度增殖，和前文結果一致。

文獻顯示，中醫(yī)可有效治療糖尿病腎病且療效確切，雖然部分中藥的成為較復雜，但中藥在臨床上的治療不僅可以對臨床癥狀進行改善，緩解患者的病情，而且還能對患者的腎臟進行保護。近些年，隨著天然藥物化學等領域的興盛，中藥在治療糖尿病腎病的治療上顯現(xiàn)出廣闊的應用前景。人參皂苷Rg3主要提取于人參，是其中重要的活性成分之一，在減輕炎癥反應、氧自由基和抗氧化等中有很好的療效[13]。有學者研究發(fā)現(xiàn)，DN大鼠的腎臟病理損傷可用過人參皂苷Rg3進行改善，同時對大鼠的血糖、肌酐、24 h蛋白尿具有很好的抑制作用，進而對腎臟進行保護[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3能有效調控系膜細胞的生物學活性，提示其對腎小球系膜細胞的過度增殖有很好的抑制作用。冀楷等[15]研究證實，人參皂苷Rg3可有效抑制高糖誘導的系膜細胞增殖，可預防并治療糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，進而發(fā)揮腎臟保護作用。TGF-β是高糖以及一些導致腎臟損傷的生化因素的重要遞質，介導糖尿病腎病的生物活性等，TGF-β可作為檢測腎間質纖維化成為的指標之一[16]。Ⅳ-C是腎小球基底膜膠原中重要成分之一，是基質膠原中最典型的一種，可由多種細胞分泌和合成，例如活化的腎小球系膜細胞、上皮細胞等，因此Ⅳ-C合成和降解平衡出現(xiàn)失調，可導致糖尿病腎病腎小球發(fā)生病理性改變。FN是組成細胞外基質的部分之一，正常狀態(tài)下系膜細胞會產(chǎn)生少量FN，在病理情況下系膜細胞產(chǎn)生FN的含量增多。本研究結果顯示，不同濃度的人參皂苷Rg3均可抑制細胞中TGF-β、Ⅳ-C、FN表達。吳勝斌等[17]研究證實，人參皂苷Rg1可通過上調腎間質HGF水平，抑制TGF-β1表達來延緩腎間質纖維化進展，發(fā)揮腎組織保護作用。

有學者研究發(fā)現(xiàn)，ROS是氧化應激中高活性分子之一，對腎細胞損傷有一定促進作用，且高糖會促進ROS的生成，進而破壞腎小球濾過膜，誘導蛋白尿的發(fā)生；大量的ROS會激活細胞內的轉導信號，增加ECM蛋白合成，減少其降解，進而對糖尿病腎病起促進作用[18]。Nrf2/ARE為機體內重要的抗氧化信號通路，Nrf2可通過對ARE依賴的第Ⅱ相解毒酶基因和抗氧化基因的轉錄活性進行調控，如SOD、HO-1等，進而對氧化應激反應進行抑制。有研究[19]證實，Nrf2在組織對抗糖尿病氧化應激損傷中起著重要作用。本研究結果顯示，不同濃度的人參皂苷Rg3均可抑制細胞中ROS含量，同時增加細胞中Nrf2和HO-1蛋白表達，提示人參皂苷Rg3能通過抑制ROS含量和調控Nrf2/ARE信號通路的相關蛋白，加強人腎小球系膜細胞的抗氧化能力，進而減輕DN導致的氧化損傷。趙穎丹等[20]研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5誘導腎小管上皮細胞出現(xiàn)氧化損傷，黃芪甲苷可抑制細胞中氧化應激反應，其機制是通過調控Keap1-Nrf2-ARE信號通路來實現(xiàn)的。

4 結論

人參皂苷Rg3可抑制高糖誘導的HMC細胞增殖、侵襲，促進HMC細胞凋亡，通過對細胞內Nrf2/ARE信號通路相關蛋白的調控加強系膜細胞的抗氧化能力。