范會(huì)利 趙如華 張赫 林旭 薛剛 吳靖芳

河北北方學(xué)院1形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，2耳鼻咽喉頭頸外科教研室（河北張家口 075000）

甲狀腺乳頭狀癌（papillarythyroidcarcinoma，PTC）是甲狀腺癌最常見的病理類型。近30年甲狀腺癌發(fā)病率增長(zhǎng)迅速，與PTC 發(fā)病率增加密切相關(guān)［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌可從緩慢進(jìn)展的惰性腫瘤發(fā)展為高度侵襲性腫瘤［3］。通過(guò)切除術(shù)和放射性碘等治療PTC 達(dá)到一定的治療效果，但是未能有效降低它的復(fù)發(fā)率，PTC 的發(fā)病機(jī)制尚未闡明［4-5］。因此，迫切需要深入研究PTC 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，降低PTC 復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

E2F 轉(zhuǎn)錄因子家族有E2F1- 8 八個(gè)成員，E2F1- 3 是轉(zhuǎn)錄活化因子，而E2F4- 8 作用相反。E2F 轉(zhuǎn)錄因子7（E2F7）作為非典型E2F 家族一員，在腫瘤中的作用存在爭(zhēng)議。其在肺腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膽管癌等多種惡性腫瘤中上調(diào)，是一種促腫瘤的轉(zhuǎn)錄因子［6-8］；但在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中作為保護(hù)因子，E2F7 通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期基因的轉(zhuǎn)錄抑制來(lái)發(fā)揮保護(hù)作用［9］。然而，E2F7 在PTC 的臨床意義及其作用機(jī)制尚不清楚。因此，進(jìn)一步探究E2F7基因在PTC 中作用機(jī)制具有深遠(yuǎn)意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和耗材 人甲狀腺乳頭狀癌K1、TPC-1 和BCPAP 細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所，正常甲狀腺濾泡上皮Nthy-ori 3-1 細(xì)胞購(gòu)于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；FBS、H-DMEM 和RMPI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；shE2F7和shRNAC質(zhì)粒由北京合生有限公司構(gòu)建；Trizol 試劑購(gòu)自Invitrogen 公司；RT-PCR 試劑盒購(gòu)自天根生物科技（北京）有限公司；抗體購(gòu)自Affinity 公司；PowerUpTMSYBR TM Green Master Mix 購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司；PTC 組織芯片（OD-CT EdThy03）購(gòu)自上海芯超有限公司，該芯片已經(jīng)通過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn) 組織芯片經(jīng)脫蠟、復(fù)水，枸櫞酸抗原修復(fù)，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷后，Ⅰ抗4 ℃孵育過(guò)夜（E2F7 工作濃度1∶100），Ⅱ抗（羊抗鼠lgG）37 ℃孵育30 min，用HRP 標(biāo)記鏈霉卵白素37 ℃孵育30 min，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。用雙盲法確定組織的陽(yáng)性率，結(jié)果以胞質(zhì)出現(xiàn)淺黃色至棕褐色者為陽(yáng)性，染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為基本不著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色依次記為0、1、2、3 分；陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0、1%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%依次計(jì)為0、1、2、3、4 分。相乘兩項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分，判定結(jié)果如下：陰性為0 ～3 分、陽(yáng)性為4 ～12 分。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染分組 Nthy-ori 3-1、K1、TPC-1 和BCPAP 細(xì)胞分別用含有10%FBS、1%青、鏈霉素雙抗的H-DMEM、RMPI1640 培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。1∶2 傳代取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。選出E2F7的表達(dá)水平最高的K1細(xì)胞株進(jìn)行沉默效率的檢測(cè)。將shE2F7 重組質(zhì)粒、空載體和只含有等量轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000 的溶液分別轉(zhuǎn)染K1 細(xì)胞，即為：基因沉默組（shE2F7）、空載體對(duì)照組shRNAC-K1（shRNAC）和空白對(duì)照組（K1 組）。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法 RIPA 裂解法提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE 和轉(zhuǎn)膜，4 ℃孵育I 抗β-actin（1∶4 000）、E2F7（1∶1 000）、cyclinD1（1∶1 000）、cyclinE1（1∶800）、EIF4A3（1∶1 000）、CDK4（1∶1 200）、AKT，p-AKT（1∶1 500）過(guò)夜；Ⅱ抗（1∶4 000）孵育1 h，以β-actin 作為內(nèi)參，ECL 發(fā)光液顯影，應(yīng)用Image J 1.48 圖像分析軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 qRT-PCR Trizol 法分別提取3 組細(xì)胞的總RNA、定量后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin 為內(nèi)參，反應(yīng)體系和條件根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.5 檢測(cè)細(xì)胞增殖、遷移能力

1.2.5.1 生長(zhǎng)曲線 將三組細(xì)胞制成1 × 107/L 細(xì)胞懸液接種于96 孔板，設(shè)3 個(gè)平行的復(fù)孔，放于機(jī)器IncuCyte ZOOM 進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)儀器攝片結(jié)果統(tǒng)計(jì)并繪制出生長(zhǎng)曲線。

1.2.5.2 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 三組細(xì)胞以每500個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于六孔板，各3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)至一周后終止培養(yǎng)，用4%多聚甲醛固定，Giemsa染色，流水沖洗，自然干燥。選取克隆細(xì)胞數(shù)大于50 的集落團(tuán)計(jì)數(shù)。

1.2.5.3 細(xì)胞劃痕 三組細(xì)胞以5 × 108/L 細(xì)胞懸液接種于6 孔板，用ZOOM40731 的96 孔劃痕器（Wound Maker Tool）單向移動(dòng)“一”字劃痕。PBS洗，繼續(xù)培養(yǎng)。3 個(gè)復(fù)孔，分別在0、12、24 h 進(jìn)行攝片，計(jì)算劃痕愈合率。應(yīng)用Image J1.48 圖像分析軟件計(jì)算遷移面積分析。

1.2.6 檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡 將三組細(xì)胞消化離心，PBS 重懸細(xì)胞，儲(chǔ)存于4 ℃75%乙醇4h 備用。離心去除酒精，PBS 清洗加入PI 溶液和RNase溶液，避光15 min ，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。用1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞，分別加入5 μL Annexin V-FITC 與PI，避光孵育10 min，加入PBS 至500 μL，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織芯片驗(yàn)證PTC 中E2F7 的表達(dá) PTC 患者組織E2F7 陽(yáng)性率為88%（51/58），癌旁組織陽(yáng)性率為12%（7/58），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。不同性別、年齡的PTC 患者E2F7 陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），不同腫瘤大小、腫瘤分期以及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 患者E2F7 陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1 和表1。

表1 PTC 中E2F7 的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 Relationship between E2F7 expression in PTC and clinicopathological parameters 例

圖1 E2F7 在PTC 和癌旁正常織中的表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色×100，Bar=50 μm）Fig.1 E2F7 in PTC and adjacent normal tissues（IHC×200，Bar=50 μm）

2.2 E2F7 在PTC 細(xì)胞系及正常甲狀腺濾泡細(xì)胞中的表達(dá) 三株P(guān)TC 細(xì)胞系E2F7 蛋白表達(dá)水平高于Nthy-ori 3-1 細(xì)胞（P＜0.01）。K1 細(xì)胞表達(dá)水平最高，故選擇K1 細(xì)胞敲低E2F7 進(jìn)一步驗(yàn)證E2F7 對(duì)PTC 細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。見圖2。

圖2 濾泡上皮Nthy-ori 3-1 細(xì)胞及甲狀腺乳頭狀癌K1、BCPAP、TPC-1 細(xì)胞和E2F7 蛋白表達(dá)Fig.2 E2F7 expression among Papillary thyroid carcinoma K1，TPC-1，BCPAP cells and thyroid follicular Nthy-ori3-1 epithelial cells

2.3 K1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后E2F7 沉默效率 qRT-PCR 結(jié)果顯示shE2F7 沉默效率為shRNAC 組的60.2%，為K1組的59.8%。WB顯示與K1、shRNAC相比，shE2F7組E2F7 翻譯水平分別降低了70%和60%左右，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

圖3 沉默E2F7 對(duì)K1 細(xì)胞mRNA 及蛋白水平的影響Fig.3 Effects of Silencing E2F7 on mRNA and protein levels of K1 cells

2.4 沉默E2F7 對(duì)K1 細(xì)胞增殖、遷移能力的影響 shE2F7 細(xì)胞生長(zhǎng)速度在第2、3 天明顯慢于shRNAC 組和K1 組（P＜0.01，圖4A-B）。細(xì)胞克隆數(shù)與shRNAC組和K1組相比明顯減少，克隆形成能力明顯降低（P＜0.01，圖5C-D）。12 h和24 h細(xì)胞遷移速度慢于shRNAC組和K1組（P＜0.01，圖4E-F）。

圖4 沉默E2F7 細(xì)胞增殖、克隆能力和遷移能力變化Fig.4 Changes of proliferation，cloning and migration ability after inhibition of E2F7 expression

2.5 干擾E2F7 對(duì)K1 細(xì)胞周期及凋亡的影響shE2F7組G0/G1期細(xì)胞比例為（65.13±4.25）%高于shRNAC 組的（37.65±3.09）%和K1組細(xì)胞的（40.06± 3.75）% ，而S 期細(xì)胞比例為（20.07 ± 0.94）%，明顯低于shRNAC 組的（40.63 ± 3.89）%和K1 組的（40.06 ± 1.45）%，G2 期細(xì)胞比例也有所減少（P＜0.01，圖5A-B）；說(shuō)明shE2F7延長(zhǎng)了K1細(xì)胞在G0/G1期滯留的時(shí)間，細(xì)胞周期受到阻滯。shE2F7 組細(xì)胞凋亡率比空載體組和K1 組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖5C-D）。

圖5 沉默shE2F7 對(duì)K1 細(xì)胞周期，凋亡的影響Fig.5 The effect of shE2F7on apoptosis of K1 cells

2.6 干擾E2F7 對(duì)K1 細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及AKT信號(hào)通路的影響 敲低E2F7 后cyclin D1 和CDK4、cyclinE1、EIF4A3 mRNA和蛋白水平降低（P＜0.01）；Akt，pAkt 蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05）。見圖6。

圖6 E2F7 參與細(xì)胞周期和信號(hào)通路調(diào)控Fig.6 E2F7 is involved in regulating the cell cycle and signaling pathways

3 討論

E2F 轉(zhuǎn)錄因子家族是細(xì)胞增殖的重要調(diào)節(jié)因子，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）CDK-RB-E2F 軸構(gòu)成了細(xì)胞周期進(jìn)程的核心轉(zhuǎn)錄機(jī)制，CDK 的激活，RB 的磷酸化等均可導(dǎo)致E2F 活性升高，細(xì)胞增殖失控，致瘤性增強(qiáng)［8，10］。研究發(fā)現(xiàn)E2F7 作為一種潛在的致癌基因可導(dǎo)致膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的進(jìn)展，并作為一個(gè)有希望的抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療靶點(diǎn)［11］。

本研究分析了E2F7 在PTC 中高表達(dá)并驗(yàn)證了E2F7 在PTC 表達(dá)水平高于癌旁組織，并與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。為明確E2F7 在PTC 中的作用機(jī)制，選擇三株P(guān)TC 細(xì)胞中E2F7 基因表達(dá)最高的K1 細(xì)胞進(jìn)行E2F7 敲減，證明E2F7mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯降低。K1 細(xì)胞遷移和克隆能力明顯下降，增殖能力減弱。

為明確E2F7 促進(jìn)K1 細(xì)胞增殖的機(jī)制，細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)顯示shE2F7 組細(xì)胞大多停滯于G0/G1 期或S 期，細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。ZHAO 等［12］報(bào)道了肝細(xì)胞癌miR-424-5p 下調(diào)，靶基因E2F7 上調(diào)，促進(jìn)G0/G1向S 轉(zhuǎn)換促進(jìn)細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期的進(jìn)展是由CDKs 與相應(yīng)的周期蛋白結(jié)合控制的［13］。楊閃閃等［14］發(fā)現(xiàn)CCNL1 家族成員CyclinD1 能夠抑制人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖并影響細(xì)胞周期分布。WB結(jié)果顯示shE2F7 組G0/G1 關(guān)鍵周期蛋白cyclinD1/CDK4明顯下調(diào)，G1期進(jìn)入向S期的關(guān)鍵基因cyclin E1/CDK2 也下調(diào)，與流式細(xì)胞周期結(jié)果一致。凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示shE2F7 組細(xì)胞凋亡率增加。真核生物起始因子4A-III（eIF4A3）是外顯子連接復(fù)合物（exon junction complex，EJC）的核心解旋酶成分，作為EJC 的一種新成分，研究發(fā)現(xiàn)eIF4A3 存在于細(xì)胞核中。EIF4A3 可能直接與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因CDK1、CDK2、CHEK1 和E2F1 等外顯子區(qū)結(jié)合調(diào)節(jié)其表達(dá)［15］。Lnc casc11在肝癌中上調(diào)并與預(yù)后不良相關(guān)，證明Lnc casc11 通過(guò)招募eIF4A3 調(diào)節(jié)E2F1，影響肝癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞活動(dòng)、凋亡和細(xì)胞代謝，促進(jìn)肝癌的進(jìn)展［16］。上述提示本研究沉默E2F7后可能通過(guò)eIF4A3下調(diào)抑制了cyclinD1，E/CDK4 等基因轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞周期阻滯。

Akt在PI3K/Akt 信號(hào)通路中起主要作用。磷酸化的Akt（pAkt）參與調(diào)節(jié)凋亡、增殖和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)［12］。WANG 等［17］研究發(fā)現(xiàn)黃芩素下調(diào)PI3K/AKT 通路蛋白可以抑制TC 細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，激活凋亡信號(hào)通路。本研究顯示沉默E2F7 基因可以誘導(dǎo)K1細(xì)胞凋亡，PI3K/AKT 通路相關(guān)蛋白p-Akt/Akt 蛋白表達(dá)明顯X 下調(diào)，提示PI3K/Akt 通路參與K1 細(xì)胞增殖。Ma 的研究顯示microRNA-302a/d 通過(guò)靶向E2F7/Akt 軸抑制肝癌干細(xì)胞的自我更新能力促進(jìn)AKT1-cyclin D1進(jìn)入細(xì)胞周期［18］。Mir-129-5p 和si-E2F7 均能顯著誘導(dǎo)直腸腺癌sw1463 細(xì)胞凋亡，上調(diào)E2F7 抑制凋亡［19］。有研究發(fā)現(xiàn)LINC00284 可作 為ceRNA 吸附miR-3127-5p 靶 向E2F7 發(fā)揮促進(jìn)PTC 增殖。GUO 等［20］報(bào)道m(xù)iR-30a 通過(guò)直接靶向E2F7 在PTC 中起腫瘤抑制作用，而miR-30a 可能是PTC 患者的新型治療靶點(diǎn)。但是這兩項(xiàng)研究均未在組織層面系統(tǒng)探索E2F7 和TPC 之間作用機(jī)制。本研究在組織水平、細(xì)胞層面對(duì)E2F7 促增殖機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)研究。表明沉默E2F7 可通過(guò)Akt信號(hào)通路抑制甲狀腺乳頭狀癌K1 細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡。但尚有待對(duì)E2F7 在PTC 中上調(diào)機(jī)制及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入研究。