嚴(yán)勇亮，張 恒，張金波，時(shí)曉磊，耿洪偉，肖 菁，路子峰，倪中福，叢 花

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，北京 100193；2. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，新疆烏魯木齊 830091;3. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院國際科技合作交流處，新疆烏魯木齊 830091；4. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830052)

小麥?zhǔn)侵袊饕Z食作物之一，其產(chǎn)量高低直接關(guān)系國家糧食安全。培育高產(chǎn)小麥新品種是提高產(chǎn)量最直接有效的方法，而小麥種質(zhì)資源的遺傳分析對小麥遺傳改良具有重要作用。小麥籽粒性狀與產(chǎn)量關(guān)系密切，對小麥最終產(chǎn)量形成有重要作用。在育種工作中通常通過改良籽粒性狀來提高小麥產(chǎn)量，但傳統(tǒng)育種方法盲目性大、效率較低，導(dǎo)致品種同質(zhì)化嚴(yán)重，分子標(biāo)記輔助選擇(marker-assisted selection，MAS)技術(shù)的發(fā)展，有助于提高選擇效率和可預(yù)測性，進(jìn)而加速育種進(jìn)程。

小麥的千粒重、粒長、粒寬等籽粒性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀，受基因和環(huán)境共同調(diào)控，QTL定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association study，GWAS)是研究數(shù)量性狀的主要方法。GWAS是以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，在全基因組水平上對自然群體目標(biāo)性狀的遺傳變異與基因多樣性進(jìn)行關(guān)聯(lián)，篩選出與表型變異相關(guān)的分子標(biāo)記的一種方法，也被稱為連鎖不平衡作圖。傳統(tǒng)的QTL定位精度較低，只能將目標(biāo)QTL定位在5～20 cM的基因組區(qū)間內(nèi)，相較于雙親連鎖分析，GWAS考慮了更加復(fù)雜的遺傳背景，在解析小麥數(shù)量性狀遺傳基礎(chǔ)方面的應(yīng)用越來越廣泛。前人以不同來源的小麥品種(系)為材料，利用小麥SNP和SSR標(biāo)記并結(jié)合GWAS，在除1A、1D、3D、4D和6A之外的16條小麥染色體上發(fā)現(xiàn)了大量與千粒重顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，表型貢獻(xiàn)率為6.7%～ 13.0%；在除6B之外的20條染色體上發(fā)現(xiàn)了大量與小麥粒長顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，其表型貢獻(xiàn)率為2.40%～ 53.84%；在除1B、1D、2D、6D和7B之外的16條染色體上發(fā)現(xiàn)了大量與小麥粒寬顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，其表型貢獻(xiàn)率為2.80%～47.12%。

SNP標(biāo)記在基因組中具有分布廣、數(shù)量多以及定位精度高等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于育種工作中。新疆作為中國小麥主產(chǎn)區(qū)之一，小麥產(chǎn)量的提升至關(guān)重要。但常規(guī)育種手段跟不上生產(chǎn)需求，需對分子標(biāo)記等新技術(shù)進(jìn)行充分使用，但基于高密度芯片技術(shù)對新疆小麥籽粒性狀的GWAS鮮有報(bào)道。因此，本研究以298份新疆種植的春小麥品種為材料，利用55K SNP基因芯片對5個(gè)環(huán)境下的千粒重、粒長、粒寬3個(gè)主要籽粒性狀進(jìn)行GWAS分析，以期獲得新的控制小麥籽粒性狀的遺傳位點(diǎn)，并挖掘相關(guān)的候選基因，為精細(xì)定位、基因克隆和分子標(biāo)記輔助選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以298份新疆種植的春小麥品種為材料，其中國外引進(jìn)品種110份、新疆地方品種141份、新疆育成品種47份，該群體在一定程度上反映了不同時(shí)期適合新疆地區(qū)種植的小麥種質(zhì)特性。于2018、2019、2020連續(xù)3年將供試材料種植于新疆烏魯木齊市新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院安寧渠基地，分別簡稱為E1、E2、E4；于2019、2020連續(xù)2年將供試材料也種植于新疆喀什市新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院澤普小麥育種家基地，分別簡稱為E3和E5。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每份材料種植3行，行長2 m，行距20 cm，3次重復(fù)，人工播種。在試驗(yàn)田四周設(shè)置保護(hù)行，大田管理同當(dāng)?shù)剞r(nóng)田基本栽培管理措施。

1.2 測定項(xiàng)目與方法

1.3 SNP分型與全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)

本課題前期利用小麥基因組55K SNP芯片對供試材料進(jìn)行基因分型，并進(jìn)行了群體結(jié)構(gòu)分析和連鎖不平衡分析。本研究利用TASSEL 5.0軟件中的Q+K混合線性模型MLM對298份小麥品種在5個(gè)不同環(huán)境下的3個(gè)籽粒性狀進(jìn)行GWAS，以=0.001為閾值，判定SNP標(biāo)記與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的顯著性。以LD衰減距離(8 Mb)作為候選基因的預(yù)測區(qū)間，將多個(gè)環(huán)境中穩(wěn)定出現(xiàn)的SNP標(biāo)記的延伸序列在小麥TGAC v1.0數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/hmmer/index.html)和NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行BLASTX，對候選位點(diǎn)進(jìn)行功能注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽粒性狀表型統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

從表1可以看出，國外引進(jìn)品種、新疆地方品種和新疆育成品種的3個(gè)主要籽粒性狀(千粒重、粒長、粒寬)有一定的差異，三種類型小麥在5個(gè)環(huán)境下的變異系數(shù)分別為4.95%～19.77%、 5.04%～17.39%和3.89%～17.41%，其中粒寬的變異幅度最小，千粒重的變異幅度最大。不同環(huán)境中，新疆育成品種的3個(gè)籽粒性狀的平均值均高于國外引進(jìn)品種和新疆地方品種，新疆地方品種的3個(gè)籽粒性狀的平均值均最低。方差分析結(jié)果表明，基因型、環(huán)境以及基因型與環(huán)境互作對于春小麥籽粒性狀均有極顯著影響，千粒重、粒長和粒寬的遺傳力分別為0.92、0.94和 0.87，說明3個(gè)籽粒性狀受遺傳因素的影響較大。

2.2 全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)結(jié)果

利用TASSEL 5.0軟件中的Q+K混合線性模型MLM，并結(jié)合55 K基因芯片的23 632個(gè)SNP標(biāo)記，對298份小麥品種在5個(gè)環(huán)境下的3個(gè)籽粒性狀進(jìn)行GWAS，結(jié)果共定位到84個(gè)同時(shí)在2個(gè)及2個(gè)以上環(huán)境中顯著關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定SNP標(biāo)記，它們分布在小麥21條染色體上，可解釋3.74%～11.18%的表型變異。檢測到23個(gè)與千粒重顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，它們分布在除2A、4D、5D、6D和7B之外的16條染色體上，可解釋3.85%～9.25%的表型變異，其中在5B染色體上檢測到3個(gè)與千粒重顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記。檢測到54個(gè)與粒長顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，它們分布在除4B和7B之外的19條染色體上，可解釋3.74%～11.18%的表型變異，其中在1B染色體上檢測到7個(gè)與粒長顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，在4A、5B、5D和7D染色體上檢測到4個(gè)與粒長顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，在1A、2B、3D、5A和6D染色體上檢測到3個(gè)與粒長顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，說明這些染色體對粒長影響較大，尤其是1B染色體，可作為研究粒長性狀重要的染色體，另外位于1B染色體上的AX-110525847、1D染色體上的AX-94745216、3B染色體上的AX-111464452、7A染色體上的AX-108802871和AX-111664463在所有環(huán)境下均被檢測到，可作為后續(xù)研究粒長性狀的重要標(biāo)記。檢測到7個(gè)與粒寬顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，它們分布在1B、2B、4B、5B、5D、6B和7B染色體上，可解釋 3.79%～7.74%的表型變異(圖1和表2)。

表1 春小麥籽粒性狀表型變異Table 1 Grain phenotypic variation in spring wheat

圖1 春小麥籽粒性狀Q-Q圖和曼哈頓圖

續(xù)圖1 春小麥籽粒性狀Q-Q圖和曼哈頓圖

在1B染色體637.98～643.18 Mb的區(qū)間檢測到與千粒重、粒長和粒寬顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)；在2B染色體11.30～11.90 Mb的區(qū)間檢測到與粒長和粒寬顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)；在3B染色體720.17～725.28 Mb的區(qū)間檢測到與千粒重和粒長顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)；在4B染色體596.35 Mb處檢測到同時(shí)與千粒重和粒寬顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)；在5A染色體511.90～518.31 Mb的區(qū)間檢測到與千粒重和粒長顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)；在5D染色體384.77～390.26 Mb的區(qū)間檢測到與粒長和粒寬顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)標(biāo)記(表2)。這說明B染色體組在小麥籽粒形成過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，這些染色體區(qū)段可作為后續(xù)研究的重點(diǎn)內(nèi)容。

表2 與春小麥籽粒性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記Table 2 SNP marker significantly associated with grain traits in spring wheat

(續(xù)表2 Continued table 2)

2.3 小麥籽粒性狀候選基因的功能預(yù)測

將與小麥籽粒性狀穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的延伸序列在中國春基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，獲取基因序列，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTx，共獲得6個(gè)與籽粒性狀相關(guān)的候選基因(表3)，它們分別編碼含NB-ARC域的抗性蛋白、胚芽蛋白樣蛋白、RING/U-box超家族蛋白、晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白、O-甲基轉(zhuǎn)移酶和含有LRR和NB -ARC域的抗病蛋白。

表3 篩選到的與小麥籽粒性狀相關(guān)的候選基因Table 3 Candidate genes screened potentially related to wheat grain traits

3 討 論

3.1 春小麥籽粒性狀的表型變異

小麥?zhǔn)侵袊饕Z食作物之一，小麥籽粒相關(guān)性狀的遺傳解析對提高中國小麥產(chǎn)量具有重要意義。本研究通過對298份春小麥品種在5個(gè)環(huán)境下籽粒性狀(千粒重、粒長和粒寬)的表型變異進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同環(huán)境下，新疆育成品種的3個(gè)籽粒性狀的平均值均高于國外引進(jìn)品種和新疆地方品種；新疆地方品種的3個(gè)籽粒性狀的平均值最低。馬艷明等研究也表明，新疆冬小麥育成品種的千粒重、粒長和粒寬普遍高于地方品種。其原因可能是當(dāng)?shù)匦←湹胤狡贩N的產(chǎn)量潛力有限，導(dǎo)致小麥籽粒的大小和千粒重成為新疆育種家關(guān)注的重要性狀。本研究還發(fā)現(xiàn)，新疆春小麥品種籽粒性狀變異較大，遺傳背景豐富，且遺傳力較大，比較容易挖掘出調(diào)控小麥籽粒性狀的優(yōu)異候選基因，從而對現(xiàn)有的春小麥品種進(jìn)行遺傳改良，進(jìn)一步提高新疆小麥的產(chǎn)量。

3.2 春小麥籽粒性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)

小麥籽粒性狀是受多基因控制的數(shù)量性狀，GWAS是研究與目標(biāo)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記、挖掘相關(guān)功能基因常用的方法之一。本研究在1A染色體11.57～30.14 Mb的區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)3個(gè)與小麥粒長顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，Li等也在這一區(qū)間發(fā)現(xiàn)了與小麥籽寬顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，說明這一區(qū)間可能存在調(diào)控小麥籽粒形成的重要基因。翟俊鵬等在1B染色體652.58 Mb處發(fā)現(xiàn)的與抽穗期顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記與本研究在637.98～643.18 Mb區(qū)間發(fā)現(xiàn)的與千粒重、粒長和粒寬顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記距離9.40～14.60 Mb，雖然距離超出LD衰減距離，但是距離較近，推測這兩個(gè)位點(diǎn)可能為同一位點(diǎn)，此位點(diǎn)可能為新發(fā)現(xiàn)的控制小麥籽粒性狀的穩(wěn)定的一因多效位點(diǎn)；本研究在5B染色體18.52 Mb處發(fā)現(xiàn)的與粒長顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記與翟俊鵬等發(fā)現(xiàn)的與穗粒數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記距離為8.08 Mb，Sun等也在5B染色體 10.88處發(fā)現(xiàn)了與粒長關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，根據(jù)本研究衰減距離為8 Mb，可將這幾個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)看作為同一位點(diǎn)。這些不同研究中得到的相同或相近位點(diǎn)，具有較高的可靠性，可以為輔助育種的分子標(biāo)記開發(fā)提供參考，同時(shí)對于進(jìn)一步發(fā)掘候選基因具有重要價(jià)值。

本研究在1A染色體468.73～488.65 Mb的區(qū)間檢測到與千粒重顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，與Li等發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記在染色體上的距離為28.53～34.63 Mb，說明這兩個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)不是同一位點(diǎn)；與張 芳等在1A染色體473.7 Mb處發(fā)現(xiàn)的調(diào)控小麥粒長和籽粒周長的標(biāo)記距離僅為4.97 Mb，可能為同一位點(diǎn)。本研究在1A染色體 535.43～ 536.44 Mb的區(qū)間也檢測到與千粒重顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，與翟俊鵬等在1A染色體519.47 Mb處發(fā)現(xiàn)的與株高顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記距離為 15.96～16.97 Mb，這與本研究發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記位點(diǎn)不是同一位點(diǎn)，推測本研究發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記位點(diǎn)為新位點(diǎn)。本研究在3B染色體720.17～725.28 Mb的區(qū)間檢測到與粒長和千粒重顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，在4B染色體596.35 Mb處檢測到同時(shí)與粒寬和千粒重顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，但這些標(biāo)記位點(diǎn)均未見報(bào)道，推測這些標(biāo)記位點(diǎn)可能是控制小麥籽粒性狀的新位點(diǎn)。這些新發(fā)現(xiàn)的SNP標(biāo)記位點(diǎn)為解析小麥籽粒性狀的遺傳基礎(chǔ)提供了新的研究方向，同時(shí)為進(jìn)一步挖掘調(diào)控小麥籽粒性狀的基因奠定了基礎(chǔ)，但還需要進(jìn)一步驗(yàn)證這些標(biāo)記位點(diǎn)的穩(wěn)定性、可靠性和多效性。

3.3 候選基因分析

將與小麥籽粒性狀顯著關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定SNP標(biāo)記序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTx，共得到6個(gè)與小麥籽粒性狀相關(guān)的候選基因。其中，位于3B染色體上的TraesCS3B01G473700編碼RING/U-box超家族蛋白，該家族蛋白在泛素通路中起作用，可調(diào)節(jié)種子和器官大小。位于4B染色體上的TraesCS4B01G332700編碼晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白，該蛋白在籽粒干燥耐受性中起重要作用，推測其通過調(diào)控籽粒干燥過程中的耐受性來影響籽粒的最終形成。位于6A染色體上的TraesCS6A01G389900編碼O-甲基轉(zhuǎn)移酶，該酶在細(xì)胞間起黏附作用，推測其通過調(diào)控籽粒內(nèi)細(xì)胞間的黏附程度影響籽粒的重量、大小、形狀等性狀的形成。

4 結(jié) 論

本研究通過對298份春小麥品種3年共5個(gè)環(huán)境的3個(gè)主要籽粒性狀結(jié)合55 K SNP基因芯片進(jìn)行GWAS，共得到84個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定SNP標(biāo)記，并在1A染色體上檢測到2個(gè)與小麥千粒重顯著關(guān)聯(lián)的新標(biāo)記位點(diǎn)，在1B染色體上檢測到1個(gè)與小麥千粒重、粒長和粒寬顯著的新標(biāo)記位點(diǎn)，在3B染色體上檢測到1個(gè)與小麥粒長和千粒重顯著的新標(biāo)記位點(diǎn)，在4B染色體上檢測到1個(gè)與小麥粒寬和千粒重相關(guān)的新標(biāo)記位點(diǎn)。經(jīng)篩選獲得6個(gè)可能調(diào)控小麥籽粒性狀的候選基因，這些候選基因可能通過調(diào)控小麥機(jī)體生理活動(dòng)、有機(jī)物合成、蛋白活性等影響小麥籽粒性狀的最終形成。

致謝：本研究在試驗(yàn)進(jìn)行和論文撰寫過程得到西北農(nóng)林科技大學(xué)許盛寶教授的大力支持，特此致謝！