胡文婷，裴徐梨，荊贊革

（昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650214）

南瓜是葫蘆科（Cucurbitaceae）南瓜屬（）植物，起源于美洲大陸。白粉病是南瓜生產(chǎn)上的重要病害，能侵染除根之外的任何組織。嚴(yán)重情況下能導(dǎo)致南瓜果實(shí)數(shù)量下降和品質(zhì)價值損失，甚至導(dǎo)致提前收秧。侵染瓜類的白粉病病原菌主要分為3個屬：單囊殼屬（）、內(nèi)絲白粉菌屬（）和白粉菌屬（），其中的6個種是關(guān)鍵病原：、、、、和，而由引起的白粉病是全球葫蘆科植物產(chǎn)量的主要威脅。

選育抗病的南瓜品種可在生產(chǎn)上減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，節(jié)約勞動力。目前已有許多抗白粉病南瓜品種的報道，如四季綠南瓜、金香栗南瓜、興蔬紅蜜南瓜和華美2009等，這些品種都在試驗(yàn)當(dāng)?shù)厝〉昧溯^好的品質(zhì)、產(chǎn)量和抗病性。云南為高原山區(qū)省份，南瓜種植面積已超4.7萬hm，良好的生產(chǎn)品種能帶來較高的經(jīng)濟(jì)效益。

為進(jìn)一步了解云南省昆明地區(qū)白粉病病原菌類型，本研究首先采用形態(tài)鑒定、致病性檢測和分子鑒定的方法確定其種類，然后利用該類白粉菌對150份南瓜種質(zhì)資源進(jìn)行白粉病抗性鑒定，以期為云南省南瓜生產(chǎn)品種的選擇提供指導(dǎo)意見，也為抗病新品種選育及抗性遺傳分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

選取南瓜品種“正源2號蜜本”，用于白粉病病原菌的分離純化。從市面采集150份南瓜種質(zhì)資源（品種），用于白粉病抗性鑒定。

1.1.2 白粉病病原菌材料

白粉病病原菌取自昆明學(xué)院試驗(yàn)田自然發(fā)病的南瓜植株葉片。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 白粉病病原菌鑒定

1.2.1.1 白粉病菌的分離純化 選取南瓜葉片上的單菌落于無菌水中，制成孢子懸浮液并噴施在健康的南瓜葉片上，后置于小拱棚中保溫。待葉片發(fā)病，再次從單菌落上分離白粉病病原菌，重復(fù)上述操作。經(jīng)過3次分離純化后，在南瓜葉片上存在大量擴(kuò)繁純化后的白粉病菌，并活體保存，以備后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)應(yīng)用。

1.2.1.2 白粉病病原菌形態(tài)觀察 挑取純化后的白粉病病原菌制作臨時玻片，在顯微鏡下觀察分生孢子和分生孢子梗，再滴加3%KOH溶液觀察纖維狀體。

1.2.1.3 致病性檢測 按照柯赫氏法則，使用噴霧法（孢子懸浮液濃度2.5×10～5.0×10個/mL）在3株南瓜葉片上回接白粉菌，檢測致病性。

1.2.1.4 白粉病病原菌分子鑒定 使用OMEGA（D3195 HP Fungal DNA Kit）試劑盒提取南瓜白粉病病原菌總D N A。利用I T S 1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板量2 μL，ddHO 21 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 90 s；變性94 ℃ 20 s，退火50 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 60 s，30次循環(huán)；延伸72 ℃ 5 min；保溫4 ℃。取2 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至測序公司進(jìn)行測序。

獲得的序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對。利用Mega 6.0軟件構(gòu)建白粉病病原菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。方法參數(shù)為：鄰接法，Bootstrap method 1000，Maximum Composite Likelihood，Partial deletion 95。

1.2.2 南瓜種質(zhì)資源白粉病抗病性鑒定

利用分離純化后的白粉病菌對150份南瓜種質(zhì)資源進(jìn)行苗期的抗病性鑒定。每個品種南瓜設(shè)置3次重復(fù)，每個重復(fù)種植3株。待南瓜苗長至3葉1心時期，用噴霧法（孢子懸浮液濃度2.5×10～5.0×10個/mL）接種純化擴(kuò)繁后的白粉病菌。保持溫度23～27 ℃，相對濕度70%以上。14 d后觀察南瓜苗發(fā)病情況，根據(jù)鑒定標(biāo)準(zhǔn)（表1）和病情指數(shù)判斷種質(zhì)資源的抗性表現(xiàn)，病情指數(shù)計算公式為：病情指數(shù)（DI）＝Σ（病級數(shù)×相應(yīng)病級株數(shù)）/（總株數(shù)×最高級病級）×100。

表1 南瓜苗期抗白粉病情況鑒定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 白粉病病原菌鑒定

2.1.1 白粉病病原菌形態(tài)鑒定

通過挑取分離純化后的白粉病菌制作臨時玻片并于顯微鏡下觀察（圖1），發(fā)現(xiàn)分生孢子呈橢圓形，長度為31.42±4.91 μm，寬度為18.36±1.51 μm。無性繁殖的分生孢子梗長度為140.56±31.67 μm，寬度為17.76±1.91 μm。每個分生孢子梗上著生2～6個分生孢子。滴加3%KOH溶液的孢子內(nèi)呈現(xiàn)明顯纖維狀體。根據(jù)以上形態(tài)特征，初步判斷該白粉菌為單囊殼屬白粉菌。

圖1 病原菌形態(tài)

將分離純化后的白粉病菌接種在“正源2號蜜本”葉片上。5 d后葉片表面開始出現(xiàn)白色病斑，12 d后葉片表面白粉層較厚且連片。發(fā)病癥狀與自然發(fā)病的南瓜葉片狀態(tài)相似。挑取白粉病菌再次鏡檢，形態(tài)特征與自然發(fā)病的白粉病菌一致。致病性鑒定該白粉菌為單囊殼屬白粉菌。

2.1.2 白粉病病原菌分子鑒定

使用ITS1和ITS4通用引物對南瓜白粉病菌總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲得519 bp的序列，后在NCBI上比對，結(jié)果與單囊殼白粉菌（P）同源性高達(dá)99%，授權(quán)登錄號為MZ798229.1。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示（圖2），中國南瓜白粉病與恬樓白粉病、赤豆白粉病聚為一類，均屬于單囊殼屬白粉菌。

圖2 植物白粉病系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 南瓜種質(zhì)資源白粉病抗病性鑒定

用分離純化后的單囊殼屬白粉菌鑒定150個南瓜品種的苗期抗病性。用噴霧法接種白粉菌6 d后，部分品種葉片開始出現(xiàn)少量病斑。通過對150個南瓜品種3葉1心期病情調(diào)查，篩選出11個高抗病品種，15個高感病品種（表2）。其中高抗病品種均為中國南瓜，包括6個“蜜本類”南瓜品種、2個“香芋類”南瓜品種、2個“黑皮姜餅瓜類”品種和1個“籽用類”南瓜品種，其中香芋南瓜為免疫品種。

表2 高抗及高感白粉病南瓜種質(zhì)資源

3 結(jié)論與討論

單囊殼屬白粉菌為目前報道最多的瓜類白粉病病原菌，在內(nèi)蒙古、黑龍江、貴州和甘肅等地南瓜白粉病病原鑒定的報道中均得到證實(shí)。纖維狀體是區(qū)分單囊殼白粉菌和二孢白粉菌的有效方法。前人已在美洲南瓜、中國南瓜和苦瓜中運(yùn)用相同的方法成功區(qū)分兩種白粉病菌。本研究中，通過形態(tài)鑒定及分子鑒定，確定南瓜白粉病菌為單囊殼屬白粉菌。不同病原菌類型對南瓜的致病性可能存在差異，因此，此次南瓜種質(zhì)資源的抗性鑒定致病菌采用單囊殼屬白粉菌。

DNA的ITS序列測序分析能有效區(qū)分待測真菌的種屬信息。朱鏈等運(yùn)用ITS序列對6株野生大型真菌進(jìn)行了鑒定。在黃瓜枯萎病拮抗真菌和金線蓮內(nèi)生真菌的研究中，也使用了同樣的方法。本研究純化病原菌的測序結(jié)果比對顯示與單囊殼屬白粉菌高度同源。進(jìn)化分析顯示，在不同植物上的相同種屬病原菌均各自聚為一類，各分支置信度高，進(jìn)化樹構(gòu)建可靠。

種質(zhì)資源抗性鑒定能有效挖掘不同種質(zhì)所蘊(yùn)含的基因信息，為人工育種提供良好的原始材料。車順風(fēng)等通過對737份葡萄種質(zhì)的白粉病發(fā)病調(diào)查，確定我國野生毛葡萄和變?nèi)~葡萄對白粉病具有良好抗性。王曉敏從23份甜瓜種質(zhì)資源中篩選出1份白粉病免疫材料和3份高抗材料。屈淑平等從64份美洲南瓜中篩選出13份高抗白粉病的材料。本研究從150份南瓜種質(zhì)材料中，篩選出11份高抗病品種，均為中國南瓜品種，其中的2份種質(zhì)資源為云南本土南瓜品種。研究成果對指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義，并為抗病基因挖掘和抗病品種培育奠定基礎(chǔ)。