劉 妍，付 玉，王成龍，賈 銘，鄭 秀，李春紅

1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室（瀘州646000）；2.瀘州市龍馬潭區(qū)中醫(yī)院婦產(chǎn)科（瀘州646000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以對(duì)稱性關(guān)節(jié)滑膜炎為特征，骨和關(guān)節(jié)呈慢性和進(jìn)行性破壞的全身性自身免疫性疾病，病變呈持續(xù)性、反復(fù)發(fā)作過程，最終造成全身關(guān)節(jié)破壞，并呈現(xiàn)出功能漸進(jìn)性障礙，甚至殘疾，且多數(shù)RA 病人10 年內(nèi)失去勞動(dòng)能力[1-4]。

糖皮質(zhì)激素能夠迅速控制RA病情和緩解疼痛，使得其在RA 的藥物治療中占有重要地位。地塞米松（dexamethasone，DEX）是臨床最常用的治療RA的糖皮質(zhì)激素類藥物之一，但是由于DEX 的受體在體內(nèi)各臟器均有分布，使其不具備靶向性，從而需要反復(fù)給藥，這樣長(zhǎng)期大劑量應(yīng)用DEX 勢(shì)必會(huì)造成較大的毒副作用，如引起骨質(zhì)疏松、青光眼、繼發(fā)性感染加重以及高血糖等[5-8]。將藥物用適當(dāng)載體包載，制備成納米遞藥系統(tǒng)可以增加藥物在炎癥部位的蓄積，從而減少其在健康部位的分布，可以極大降低藥物毒副作用和增強(qiáng)治療效果[9-13]。本課題組在前期工作中，已經(jīng)利用γ-PGA 作為載體，將DEX 制備成了γ-PGA-DEX 納米膠束，體外性質(zhì)考察以及體外細(xì)胞學(xué)考察顯示，γ-PGADEX 可以增加局部滯留作用，并具有較好的體外治療效果和細(xì)胞攝取效率[14]。

本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察γ-PGADEX 治療RA 的體內(nèi)藥效學(xué)，并對(duì)其體內(nèi)毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為制備一種新型的抗RA納米制劑提供前期基礎(chǔ)研究。

1 儀器與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1 儀器與試藥

XR205SM-DR 型電子天平（瑞士Precisa）；離心機(jī)（Beckman-Coulter，USA）；γ-PGA-DEX為自制；牛二型膠原蛋白、完全弗式佐劑、不完全弗式佐劑（Chondrex，USA）；水為超純水；其余試劑為分析純級(jí)別試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性DBA/1小鼠，體重（20±2）g，購(gòu)自北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)西南醫(yī)科大學(xué)關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和使用準(zhǔn)則進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（許可證號(hào):20210223-231）。

2 方法

2.1 小鼠膠原蛋白誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（CIA）模型的建立

健康DBA/1小鼠在自由飲水和飼料的條件下飼養(yǎng)一周，使其充分適應(yīng)環(huán)境。于第1 d，取等體積的牛二型膠原蛋白和完全弗式佐劑，充分混勻制備成乳劑后，每只小鼠尾根部皮下注射上述乳劑各100 μL。接著于第21 d boost，取等體積的牛二型膠原蛋白和不完全弗式佐劑充分混勻制備成乳劑，各取50 μL注射到上述各小鼠尾根部皮下。

2.2 小鼠分組及給藥方案

normal 組：選擇健康的DBA/1小鼠5只作為normal組，于第21 d給予生理鹽水，每3 d給藥一次，共三次。

游離DEX 組：隨機(jī)選擇造模后的小鼠作為游離DEX組，于第21 d給予2 mg/kg游離DEX藥物，每3 d給藥一次，共三次。

γ-PGA-DEX 組：隨機(jī)選擇造模后的小鼠作為γ-PGA-DEX組，于第21 d給予γ-PGA-DEX（劑量相當(dāng)于2 mg/kg游離DEX藥物），每3 d給藥一次，共三次。

2.3 體內(nèi)藥效學(xué)檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 小鼠體重變化情況 各治療組分別于第21 d 開始測(cè)定體重，3 d測(cè)定一次，至第27 d，計(jì)算并作圖。

2.3.2 小鼠關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)及關(guān)節(jié)評(píng)分情況 小鼠關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[15-17]：觀察小鼠關(guān)節(jié)炎癥表現(xiàn)，進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分。按照如下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分:0分為無關(guān)節(jié)炎；1分為趾關(guān)節(jié)輕微紅斑、腫脹；2分為關(guān)節(jié)輕度紅腫，2個(gè)區(qū)域以上的炎癥；3分為關(guān)節(jié)中度紅腫，輕度功能障礙；4分為多關(guān)節(jié)重度紅腫，嚴(yán)重功能障礙。

各治療組關(guān)節(jié)評(píng)分情況：各治療組分別于第21 d開始對(duì)其關(guān)節(jié)指數(shù)進(jìn)行評(píng)分，3 d評(píng)分一次，至第27 d，計(jì)算并作圖。

2.3.3 關(guān)節(jié)病理組織切片 各組小鼠給藥3次后，每組隨機(jī)挑選3 只。處死小鼠后剪下小鼠右后踝關(guān)節(jié)。PBS 沖洗后浸泡于5 倍體積的4%的多聚甲醛中固定48 h，再用PBS 漂洗后轉(zhuǎn)入10%EDTA 脫鈣液（pH 7.2-7.5）中脫鈣2周，每天更換一次脫鈣液。至關(guān)節(jié)組織變軟，硬度與肌肉相仿，針刺無阻力視為組織脫鈣完成。制備石蠟切片，并進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片，并于顯微鏡下觀察病理切片，同時(shí)進(jìn)行病理組織學(xué)評(píng)分。

2.3.4 血清中前炎癥因子的測(cè)定 小鼠眼眶取血，全血置肝素化EP管中，4 500 rpm離心5 min，精密吸取上清0.30 mL，置于-40 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用ebiosicence的小鼠TNF-α、IL-1β 和IL-6 測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定上述血清中的前炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6。

3 結(jié)果

3.1 各治療組小鼠體重變化情況

由圖1可知，γ-PGA-DEX 治療組小鼠體重呈現(xiàn)一定的增長(zhǎng)趨勢(shì)，并且與normal 組小鼠體重?zé)o顯著性差異，證明γ-PGA-DEX具有較好的治療效果。

圖1 各組小鼠體重變化情況（n=5）Figure 1 Changes of body weights of mice after different treatments（n=5）

3.2 各治療組關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分情況

從上述圖2顯示，γ-PGA-DEX 治療組小鼠關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分顯著低于游離DEX治療組（P ＜0.05），且在所有治療組中為最低，顯示出其較好的治療效果。

學(xué)者們對(duì)于“法律術(shù)語”的外部特征一般定義如下:詞匯、短語、用語、表達(dá)、因素、符號(hào),其中以“詞匯(短語)”“用語”居多[1-3]。

圖2 各組關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分情況（n=5）Figure 2 Scores of articular index of mice in each group（n=5）

3.3 病理組織切片評(píng)價(jià)

關(guān)節(jié)病理切片HE染色顯示：正常關(guān)節(jié)滑膜襯里層厚為1～2層，細(xì)胞排列整齊，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血管增生，關(guān)節(jié)軟骨光滑無破壞；而Saline 組的關(guān)節(jié)囊內(nèi)具有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)（包括中性粒和淋巴細(xì)胞，以淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主）。部分骨質(zhì)破壞嚴(yán)重，關(guān)節(jié)囊內(nèi)大量纖維增生，關(guān)節(jié)周炎細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)腔間隙縮?。梢妷乃拦牵洳±碓u(píng)分＞7 分；游離DEX 組仍可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)、骨質(zhì)破壞和纖維增生，但程度明顯低于saline組，其病理評(píng)分大約為5分；γ-PGA-DEX 組與normal 組相比沒有顯著性差異，無明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和骨破壞現(xiàn)象，病理評(píng)分為2 分。以上結(jié)果顯示，γ-PGA-DEX 組具有明顯優(yōu)于游離DEX組的治療效果，見圖3。

圖3 各組踝關(guān)節(jié)病理組織切片圖（A）及病理評(píng)分（B）Figure 3 Histopathology of the joints（A）and pathological scores（B）in different treatment groups

3.4 血清中前炎癥因子測(cè)定

3.4.1 血清中TNF-α 水平 從圖4 的結(jié)果可以看出，與DEX 組相比，γ-PGA-DEX 組在血清中的TNF-α 的水平明顯降低（P ＜0.05），以上結(jié)果顯示γ-PGA-DEX的抗炎效果明顯強(qiáng)于游離DEX。

圖4 各組血清中前炎癥因子TNF-α水平（n=5）Figure 4 Serum levels of pro-inflammatory cytokines TNF-α in different treatment groups（n=5）

3.4.2 血清中IL-1β 水平 從圖5的結(jié)果可以看出，γ-PGA-DEX 組在血清中的IL-1β 的水平明顯低于游離DEX 組和saline 組（P ＜0.05），顯示出其具有較好的抗炎效果。

圖5 各組血清中前炎癥因子IL-1β水平（n=5）Figure 5 Serum levels of pro-inflammatory cytokines IL-1β in different treatment groups（n=5）

3.4.3 血清中IL-6 水平 從圖6 的結(jié)果可以看出，γ-PGA-DEX 組在血清中的IL-6 的水平明顯低于游離DEX 組和saline 組（P ＜0.05），說明γ-PGA-DEX 具有較好的抗炎效果。

圖6 各組血清中前炎癥因子IL-6水平（n=5）Figure 6 Serum levels of pro-inflammatory cytokines IL-6 in different treatment groups（n=5）

4 討論

納米遞藥系統(tǒng)提高了藥物的靶向性，使藥物在疾病部位的蓄積顯著增加，具有降低藥物毒副作用、增強(qiáng)治療效果等優(yōu)勢(shì)。目前治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的載糖皮質(zhì)激素的納米遞藥系統(tǒng)包括脂質(zhì)體[18]、納米粒[19]、膠束[20-22]、水凝膠及各種仿生納米遞藥系統(tǒng)[23-24]，膠束由于其粒徑較小，因此在炎癥部位的蓄積效果更好[20-22]，因此本課題組選擇納米膠束作為納米遞藥系統(tǒng)。課題組前期考察了γ-PGA-DEX 納米膠束的體外性質(zhì)以及體外細(xì)胞學(xué)，并證明了γ-PGA 與DEX 形成膠束后，延緩了DEX 的釋放，增強(qiáng)了其在細(xì)胞的攝取率。本研究基于上述前期工作，進(jìn)一步考察了γ-PGA-DEX 治療RA的體內(nèi)藥效學(xué)，結(jié)果顯示，γ-PGA-DEX能夠顯著增加小鼠體重、降低CIA小鼠關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分，并且通過對(duì)病理切片的量化評(píng)分，顯示出該納米膠束具有顯著的降低炎癥因子和骨保護(hù)作用。

在RA 的炎癥關(guān)節(jié)局部環(huán)境分泌有大量的前炎癥因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6 等，這些炎癥因子同時(shí)又進(jìn)一步促進(jìn)RA 疾病的發(fā)展進(jìn)程，因此，通過考察這些前炎癥因子的水平，可以有效地反應(yīng)對(duì)于疾病的治療效果[25-27]。本研究中，通過測(cè)定血清中前炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6，結(jié)果顯示，與游離DEX組相比，γ-PGA-DEX 均可以顯著降低血清中上述三種前炎癥因子的水平，因此顯示出較好的治療RA的效果。

以上均證明，γ-PGA-DEX 具有較好的治療RA 的療效，同時(shí)也有用于治療其他炎癥性疾病的潛力，有望為開發(fā)治療炎癥疾病的新藥提供一定理論基礎(chǔ)。

5 結(jié)論

本研究構(gòu)建的γ-PGA-DEX 納米膠束在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎CIA 小鼠模型上，顯示出較好的體內(nèi)治療效果，能夠降低關(guān)節(jié)腫脹程度和關(guān)節(jié)評(píng)分，并且抑制促炎癥因子，減少炎癥因子浸潤(rùn)，具有較好的骨保護(hù)作用，為治療炎癥性疾病提供了理論依據(jù)。

（利益沖突：無）