黃小蘭,彭彥,楊宇超,樊庭宇,孫冰,Asmat Ullah Khan,戴景興,歐陽鈞,鐘世鎮(zhèn)

南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室暨廣東省醫(yī)學生物力學重點實驗室，廣州 510515

干細胞作為骨組織工程中的重要種子細胞來源而備受關注，有研究表明人成纖維細胞（fibroblast）具有干細胞特性，可以重編程為誘導多能干細胞，然后分化為神經細胞、心肌細胞和造血干細胞等，在再生醫(yī)學中作為理想的細胞種子來源而受到廣泛的應用[1,2]。因此研究調控人成纖維細胞的生物學行為的相關調控分子具有重要意義。而細胞骨架相關蛋白PDLIM5，作為一個肌動蛋白細胞骨架銜接蛋白而受關注，它在參與形成特異性蛋白大分子復合物中發(fā)揮著重要的介導作用[3]，而且細胞骨架作為細胞與胞外信號連接的橋梁，參與眾多信號通路的轉導，完整的細胞骨架是細胞內信號分子協同作用的基礎[4]。已有相關研究報道PDLIM5 在心血管系統(tǒng)、神經系統(tǒng)，腫瘤等領域中作為重要的調節(jié)因子而發(fā)揮關鍵作用，但其在人皮膚成纖維細胞中扮演的角色還未完全闡明。因此，本研究旨在通過研究細胞骨架相關蛋白PDLIM5 對人成纖維細胞的調控作用及其細胞定位來探討調控人成纖維細胞的可能相關調控因子，從而為臨床應用于骨組織工程研究的種子細胞提供更多選擇。

1 材料與方法

1.1 人皮膚成纖維細胞的培養(yǎng)

人皮膚成纖維細胞（HSFs）購自中喬新舟公司細胞庫。取購回的人皮膚成纖維細胞，按照說明書用生長培養(yǎng)基重懸后接種于細胞培養(yǎng)皿中于37 ℃恒溫、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待細胞融合度達80%～90%時進行傳代培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)液為全DMEM 培養(yǎng)液（含15% FBS、1% 雙抗）。細胞用0.25% 胰酶-0.02% EDTA 消化傳代。FBS、雙抗購自Gibco 公司。

1.2 慢病毒介導的轉導

為了下調PDLIM5，將PDLIM5 特異性短發(fā)卡RNA 包裝成慢病毒（慢病毒來自上海吉凱）。為了感染靶細胞，病毒上清液在轉導前在新鮮培養(yǎng)基中按照轉染接種的細胞密度及試劑商提供的病毒濃度來計算所需感染細胞的病毒濃度，并添加病毒感染增強液P 液。感染前一天，將細胞消化后按7 000 個/cm2的密度接種板，于37 ℃培養(yǎng)16～24 h，至細胞匯合度為20%～30%。到第2 天，根據細胞MOI 及病毒滴度，加入相應病毒量及相應的感染增強液，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)。感染后12 h 用完全培養(yǎng)基進行換液，繼續(xù)培養(yǎng)到72～96 h 后，顯微鏡下觀察感染效果，選擇感染效率達80%，且細胞生長良好的組用于后續(xù)實驗。

1.3 蛋白免疫印跡實驗

使用全蛋白提取試劑盒(購自凱基生物)提取總蛋白，使用10 % SDS-PAGE 分離蛋白，轉至PVDF 膜，用5%牛奶封閉1 h，孵育一抗（GAPDH、PDLIM5，購自Abcam），4 ℃過夜，0.01%TBST 清洗3 遍后室溫下孵育二抗2 h，0.01% TBST 清洗3 遍后，使用超敏ECL 發(fā)光液顯色，蛋白化學發(fā)光圖像分析儀進行。

1.4 qRT-PCR 實驗

使用Trizol 試劑（美國Invitrogen）根據提供的說明進行操作，從細胞中提取總RNA。然后使用逆轉錄試劑盒（美國Thermo Fisher）進行逆轉錄后，進行實時聚合酶鏈反應，用熒光標記SYBR Green 試劑，使用針對PDLIM5 和GAPDH 的特異性引物用ABI Step One Plus 系統(tǒng)（美國Applied Biosystems）一式三份進行反應。GAPDH 用作內源性對照，通過ΔΔCt 方法計算不同基因轉錄本的相對表達。以下引物用于qRTPCR：PDLIM5，上游引物：5'? TTAGTGGCACTGGGG AAATC?3'和下游引物：5'? GATCTTCCTTTGGCATC GA C?3'；GAPDH，上游引物：5'? TCGGAGTCAACGG ATTTGGT ?3'和下游引物：5'? TTCCCGTTCTCAG CCTTGAC ?3'。

1.5 細胞增殖實驗（CCK8 檢測）

PBS 將貼壁細胞清洗3 遍后換用無血清DMEM/F12 配制10%的CCK8（Cell CountingKit-8）工作液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育1 h，用酶標儀測定樣品在450 nm 處的吸光度。

1.6 細胞劃痕實驗

取6 孔板，在板上做好分組標記。以1～4×105密度種板，以第2 天鋪滿為準，培養(yǎng)1 d。第2 天取出鋪滿6 孔板的細胞，用200 μL 槍頭做劃痕，然后棄掉舊的培養(yǎng)基，用PBS 沖洗細胞表面3 次，去除劃下的細胞后，加入無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，分別于0、12、24、48 h 鏡下觀察細胞的運動能力并拍照。

1.7 細胞遷移實驗

24 孔板上放入8.0 μm 孔徑大小的小室（BD 公司），每小室加入100 μL 無血清培養(yǎng)液，將消化混勻重懸的細胞液200 μL（2.5×105/mL，無血清）加入小室內，下室加入750 μL 完全培養(yǎng)液，于37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)12～16 h 后，用PBS 沖洗2 次，4 %甲醛固定30 min，PBS 沖洗2 次，用結晶紫染色液（Solarbio 公司）染色30 min，PBS 沖洗2 次，用棉簽輕輕刮去小室中未遷移的細胞，在顯微鏡下觀察拍照細胞遷移情況。

1.8 免疫熒光染色

將培養(yǎng)于蓋玻片上的HSFs 用DMEM 基礎培養(yǎng)基洗滌3 遍后，置于4 %多聚甲醛中室溫固定10 min，用PBS 洗滌3 遍。細胞在0.1 %Triton X-100 的PBS 溶液中室溫通透5 min 后，PBS 洗滌3 遍，2 % BSA 封閉1 h 后加一抗于4 ℃過夜。將蓋玻片用PBS 洗滌3 遍，每次10 min，分別與Alexa Fluor 488(1：500；碧云天)、Alexa Fluor 568 phalloidin（1:500；Themo）二抗孵育1 h后，PBS 洗滌3 遍，用4‘6-二胺基-2-苯基吲哚(DAPI)固定液(購自Santa Cruz)洗滌貼在玻片上，用共聚焦顯微鏡(Zeiss)成像。

1.9 統(tǒng)計學處理

除非特殊說明，所有實驗重復3 次以上。采用GraphPad Prism5.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，采用t檢驗進行分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PDLIM5 敲減效率驗證

在人成纖維細胞中，感染了shPDLIM5 慢病毒組（實驗組）、shScr組（空質粒對照組）的感染效達到80%～90%以上，提示病毒轉染成功（見圖1A）。慢病毒感染人成纖維細胞后，通過Western Blot 和RTqPCR 檢測PDLIM5 表達水平。結果提示在感染shPDLIM5 后人成纖維細胞系的PDLIM5 蛋白及mRNA 水平均明顯降低（圖1B-C），提示下調PDLIM5表達有效，構建PDLIM5 表達下調的人成纖維細胞成功。

圖1 慢病毒轉染下調PDLIM5 表達效果驗證A：病毒感染5 天后HSF 熒光強度B：慢病毒感染后的PDLIM5 的蛋白表達水平C：慢病毒感染后的PDLIM5的mRNA 表達水平Con組為空白對照，shScr組是空質粒對照組，shPDLIM5 是沉默了PDLIM5 的實驗組，標尺為100 μm，***P＜0.001Fig.1 Verification of down-regulation of PDLIM5 expression by lentivirus transfectionA: HSFs fluorescence intensity 5 days after virus infection; B: PDLIM5 protein expression level after lentivirus infection; C: mRNA level of PDLIM5 after lentivirus infectionCon: Blank control group; shScr: empty control group; shPDLIM5: experimental group of knock-down PDLIM5,Scale bar=100 μm,***P＜0.001

2.2 下調PDLIM5 抑制人成纖維細胞的增殖

在人成纖維細胞系中下調PDLIM5 表達后，分別取0、1、2、3、4、5、6 d 的實驗組和對照組細胞在加入CCK8 溶液后于450 nm 吸光度出測得CCK8 實驗結果表明，實驗組較對照組的OD 值低（圖2），證實了細胞增殖明顯受到抑制，差異具有統(tǒng)計學意義。

圖2 下調HSFs 的PDLIM5 表達后，細胞增殖能力受到抑制 ***P＜0.05, n=3Fig.2 Down-regulating of PDLIM5 inhibits HSFs proliferation,shPDLIM5,PDLIM5 expression down regulated ***P＜0.001, n=3

2.3 下調PDLIM5 表達導致人成纖維細胞的運動、遷移能力下降

通過劃痕實驗檢測下調PDLIM5 表達的人成纖維細胞的運動能力，結果表明，實驗組（shPDLIM5）細胞的劃痕愈合能力較對照組（shScr）明顯下降（圖3 A）。統(tǒng)計分析細胞劃痕愈合面積顯示，實驗組細胞12、24、48 h 的劃痕愈合面積較對照組顯著減少（圖3 B～D）。

圖3 下調PDLIM5 表達的HSFs 劃痕愈合實驗結果情況A：實驗組(shPDLIM5)與對照組（shScr）細胞劃痕愈合能力比較 B-D: 12 h、24 h、48 h 后愈合面積的統(tǒng)計比較（***P＜0.001，n=3，標尺為100 μm）Fig.3 Results of cell scratch assay of HSFs after knockdown of PDLIM5A: The cell scratch healing ability in the experimental group (shPDLIM5) and control group (shScr); B-D: The wound healing area 12 h,24 h,48 h after treatment,respectively (***P＜0.001, n=3,scale bar=100 μm)

為了進一步證實上述結果，在人成纖維細胞中饑餓24h 后進行transwell 遷移實驗，以闡明PDLIM5 基因抑制對細胞遷移的影響。結晶紫染色圖像顯示，小室下面shPDLIM5組細胞數量明顯低于其他兩個對照組（圖4）。

圖4 Transwell 細胞遷移實驗結果（標尺為100 μm）Fig.4 Results of Transwell cell migration experiment (bar=100 μm)

2.4 PDLIM5 在人成纖維細胞中與微絲共定位于細胞質

通過免疫熒光染色，觀察到PDLIM5 在成纖維細胞中的位置。可以看到PDLIM5 在成纖維細胞中主要表達于細胞質，并且與肌動蛋白細胞骨架共定位（見圖5）。

圖5 PDLIM5 在HSFs 中的亞細胞定位熒光結果（標尺為10 μm）Fig.5 Fluorescence results of subcellular localization of PDLIM5 in HSFs (bar=10 μm)

3 討論

成纖維細胞是由胚胎時期的間充質細胞分化而來，是結締組織中最常見的細胞，成纖維細胞代謝旺盛、增殖能力強，具有合成和分泌蛋白質的功能，在不同微環(huán)境中可分化為不同細胞，擁有與干細胞接近的多向分化潛能，因此常運用于轉分化、細胞培養(yǎng)、損傷修復以及組織工程，其中促進干細胞增殖及誘導分化的作用尤為顯著[5,6]。早在2006年，Takahashi 團隊通過將4 種轉錄因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc 和Klf4)導入到小鼠成纖維細胞中，重編程獲得了一種和胚胎干細胞相似的多能誘導的全能干細胞[7]，隨后又通過采用不同的轉錄因子將人皮膚成纖維細胞轉化為誘導性多能干細胞，可以分化為軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞等[8]。因此，成纖維細胞具有應用于骨缺損及相關疾病治療的潛能，而研究調控成纖維細胞的蛋白分子對進一步了解成纖維細胞的生物學特征具有重要意義。

細胞骨架相關蛋白PDLIM5 作為一個肌動蛋白細胞骨架支架蛋白，在參與細胞生物學功能的過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。有研究表明，PDLIM5 被認為是通過形成片狀偽足在細胞遷移中必須的，并且PDLIM5 的磷酸化失活可通過滅活Rac1 來削弱細胞轉移能力[9]。此外，PDLIM5 參與成纖維細胞中的細胞伸展過程，是細胞伸展形成中的靶蛋白之一，下調PDLIM5 可減少擴展中肌動蛋白絲的組裝[10]。本實驗通過慢病毒轉染包裝技術，利用針對缺失PDLIM5 靶基因的慢病毒載體轉染整合至HSFs 上，從而達到在人成纖維細胞中下調PDLIM5 表達的目的，研究PDLIM5 對HSFs 生物學功能的影響。實驗發(fā)現，在人成纖維細胞中下調PDLIM5 表達后，不僅抑制了HSFs的的增殖能力，還降低了HSF 的運動和遷移能力。這說明了PDLIM5 參與了成纖維細胞的生命活動過程，并且可能作為一個關鍵調控因子影響著細胞的生物學行。此外，實驗結果表明，PDLIM5 與細胞骨架微絲共定位，隨F-actin 整齊排列，而本課題組前期研究表明，通過對肌動蛋白聚合狀態(tài)的調控，可以抑制或促進成纖維細胞的成骨分化[11]。我們猜測，PDLIM5作為細胞骨架銜接分子，對成纖維細胞生物行為的調控可能與肌動蛋白相關。

總之，本實驗驗證了細胞骨架相關蛋白PDLIM5對成纖維細胞生物學功能的調控,并且PDLIM5 與肌動蛋白微絲存在共定位。未來還需要研究PDLIM5對成纖維細胞多向分化能力的影響，尤其是在成骨分化方面探討其與微絲的聯系對成纖維細胞成骨分化能力的影響。