徐嫚鴻 綜述 李筱榮 審校

天津醫(yī)科大學眼科醫(yī)院 天津醫(yī)科大學眼視光學院 天津醫(yī)科大學眼科研究所 國家眼耳鼻喉疾病臨床醫(yī)學研究中心天津市分中心 天津市視網(wǎng)膜功能與疾病重點實驗室，天津 300384

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者常見的神經(jīng)血管性并發(fā)癥之一，其特征是視網(wǎng)膜血管滲漏、視網(wǎng)膜缺血、血管生成和視網(wǎng)膜炎癥[1]。患者眼底表現(xiàn)為棉絮斑、滲出液、小靜脈迂曲、動脈瘤和出血，可能導致視力下降、色覺喪失和夜視障礙[2]。DR是一種多系統(tǒng)、多因素相互作用的慢性疾病，炎癥機制在其發(fā)病中發(fā)揮重要作用[3-4]。有研究者稱DR為可防不可治盲，多數(shù)患者就診時已發(fā)展至增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)階段，需接受玻璃體腔注射抗血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)藥物或手術治療，但經(jīng)治療患者的視力恢復情況并不理想，因此尋找更準確便捷的DR早期篩查手段顯得尤為重要。

1996年Wilkins等[5]首次提出蛋白質組學的概念，即研究特定細胞、組織或生物體中所包含的全部蛋白質信息，包括蛋白質的表達水平、蛋白質的三維結構、翻譯后修飾和蛋白與蛋白之間相互作用關系等，從而在蛋白質表達水平上全面而整體地揭示細胞代謝、疾病發(fā)生和發(fā)展等過程。淚液、房水、玻璃體液、視網(wǎng)膜下液和外周血清等與DR相關的生物流體樣本通過蛋白質組學技術進行了大量的研究，不斷有新的與DR中血管炎癥相關的差異蛋白被深度挖掘，并作為DR診斷的生物標志物[6-7]。當血-視網(wǎng)膜屏障功能正常時，由活化的小膠質細胞和補體系統(tǒng)所導致的低度炎癥水平在DR早期階段起到維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡的作用[8]。隨著疾病進展，活化的小膠質細胞、內皮細胞、大膠質細胞甚至神經(jīng)元產(chǎn)生的炎性細胞因子水平增加并不斷累積，不僅造成DR早期神經(jīng)元細胞死亡，并且也在血管生成中發(fā)揮重要作用[9-10]。因此，本文就近年來蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)的DR相關炎性生物標志物作一綜述。

1 蛋白質組學研究所涉及與DR相關的生物流體

生物流體指動物和人體內循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等生理性流體，如血液、氣體、尿液、淋巴液和其他體液[11]。眼部的不同組織和相關生物流體中蛋白質可反映眼科疾病的病理特征，DR患者反映疾病炎癥狀態(tài)的生物流體主要包括淚液、房水、玻璃體液和血漿。DR患者高血糖引起房水滲透壓降低，進而影響房水蛋白水平改變[12]。玻璃體無血管，大部分玻璃體蛋白質來自視網(wǎng)膜，DR患者視網(wǎng)膜滲漏、出血、血-視網(wǎng)膜屏障受損均可導致玻璃體蛋白質成分和含量的變化[13-14]。糖尿病患者淚腺微血管損傷伴自主神經(jīng)病變可能損害淚腺功能，其淚液蛋白的組成與健康人不同[15]。上述眼部生物流體通過毛細血管壁與血液以及通過直接和間接接觸與各種眼組織不斷交換物質，其中的蛋白質水平不僅有助于指示血管和/或眼組織的健康狀態(tài)，也能作為潛在的疾病診斷和預后生物標志物[16]。

2 DR患者各生物流體中炎性相關蛋白變化

目前已有大量研究顯示DR患者生物流體中存在有炎性相關蛋白表達變化，本小節(jié)根據(jù)DR相關的生物流體進行分類概述(圖1)。

圖1 DR患者各生物流體中炎性蛋白變化 NPDR：非增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變；B2M：β-2微球蛋白；LCN：脂蛋白；PDR：增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變；LF：乳鐵蛋白；LACRT：催淚蛋白；LYSC：溶菌酶C；DR：糖尿病視網(wǎng)膜病變；AH：房水；APOA：載脂蛋白A；TF：轉鐵蛋白；KRT：角蛋白I型細胞骨架；CBS：胱硫醚β-合酶；MMP：基質金屬蛋白酶；SEPP：硒蛋白P；CRP：C-反應蛋白；ICAM：細胞間黏附分子；TNF：腫瘤壞死因子；sVCAM：可溶性血管黏附分子；VCAM：血管黏附分子；CCL：C-C基序趨化因子；PEDF：色素上皮衍生因子；AZU1：炎癥反應蛋白；VH：玻璃體液；LUM：細胞外基質蛋白多糖；KERA：角膜蛋白多糖；AGT：血管緊張素原；C3：補體蛋白C3；VEGF：血管內皮生長因子；AβA4：β淀粉樣蛋白A4；TIMP：組織金屬蛋白酶抑制劑；CLU：凝集素；CLSTN：鈣結合蛋白；RBP：間皮受體視黃醇結合蛋白；SOD：細胞外超氧化物歧化酶；A2M：α2-巨球蛋白；CFH：補體因子H

2.1 淚液

淚液蛋白可反映眼部和全身系統(tǒng)性疾病病理特點，已成為近年來研究的熱點[11]。與健康組淚液相比，非增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)患者淚液中β-2微球蛋白(beta-2 microglobulin，B2M)上調，脂蛋白1(lipocalin 1，LCN-1)及其前體明顯下調[17]。B2M高表達可通過釋放促炎細胞因子和活性氧代謝產(chǎn)物損害視網(wǎng)膜細胞[18]。脂蛋白是多種疾病的生物學標志物，如炎癥性疾病、癌癥、肝腎功能紊亂等，LCN-1很可能與DR患者炎癥狀態(tài)相關[19]。Wang等[20]采用基于光電珠的免疫傳感技術檢測到DR患者淚液中LCN-1的水平隨DR嚴重程度增加而升高，提示淚液中LCN-1可能是DR的生物學標志物之一。Cs?sz等[21]通過對健康對照組、糖尿病組、NPDR組和PDR組患者的淚液樣本進行蛋白質譜分析來識別DR生物標志物，其中PDR組乳鐵蛋白和Ig-λ明顯上調，可能與異常血管形成、視網(wǎng)膜出血和黃斑水腫引起的炎癥相關。此外，Hagan等[22]利用乳鐵蛋白、Ig-λ和該研究中的其他4個候選生物標志物LCN-1、催淚蛋白、溶菌酶C和親脂素A建立了蛋白表達水平聯(lián)合臨床指標的視網(wǎng)膜疾病診斷模式。

2.2 房水

Chiang等[23]通過二維差異凝膠電泳法(2D-DIGE)和基質輔助激光解吸飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)方法共鑒定了11種與DR相關的差異表達蛋白質，這些差異表達蛋白參與多種生物學過程，包括炎癥、視網(wǎng)膜血管微結構和細胞外基質的重組、血管生成、抗氧化和神經(jīng)保護等，其中與炎癥相關的差異表達蛋白包括載脂蛋白A-1(apolipoprotein，APOA-1)、血清轉鐵蛋白、角蛋白Ⅰ型細胞骨架10、基質金屬蛋白酶13、硒蛋白P和胱硫醚β-合酶(cystathionine beta-synthase，CBS)。硒蛋白P維持體內氧化還原信號平衡，在DR患者的房水中顯著下調[24]；CBS在DR患者房水中明顯上調，該酶負責合成硫化氫，并與炎癥和細胞凋亡相關[25]。研究表明CBS促進同型半胱氨酸的表達，進而激活視網(wǎng)膜和大腦中的小膠質細胞并誘導視網(wǎng)膜和大腦的炎癥反應[26]。近期有研究采用液相色譜-質譜/質譜方法探討PDR患者和對照組患者房水中差異表達的蛋白質，發(fā)現(xiàn)有10種與PDR相關，其中APOA-1、APOA-2和APOA-4與PDR的炎癥反應密切相關[27]，提示促炎細胞因子可能通過脈管系統(tǒng)或玻璃體進入房水，同時這些促炎細胞因子也可作為PDR患者房水中的生物標志物。

2.3 玻璃體

玻璃體中一些蛋白的差異表達可以反映DR不同階段病理改變，包括VEGF、色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)和人源性激肽釋放酶結合蛋白(kallistatin)等。有研究運用三聯(lián)四極桿液相色譜-質譜/質譜多反應監(jiān)測模式，發(fā)現(xiàn)NPDR患者玻璃體中kallistatin的表達水平明顯高于黃斑裂孔患者[28]。在db/db小鼠誘導的糖尿病模型中，玻璃體腔過表達kallistatin可通過抗氧化、抗炎和抗纖維化等作用保護視網(wǎng)膜免受損傷[29]。

Loukovaara等[30]進行了大規(guī)模的蛋白質組學研究，使用非標記液相色譜-質譜/質譜方法收集138份玻璃體液樣本，結果顯示與NPDR患者相比，PDR患者玻璃體液中細胞外基質蛋白多糖和角膜蛋白多糖表達上調，這2個蛋白可能介導PDR炎癥反應中趨化因子的募集過程，也是區(qū)別NPDR和PDR患者的玻璃體液生物標志物。此外，多項研究均證實炎癥急性反應期的組分如α-1-抗胰蛋白酶，白細胞介素，補體系統(tǒng)如C3，凝血途徑如纖維蛋白原、凝血酶原和其他炎癥途徑如VEGF、β淀粉樣蛋白A4、組織金屬蛋白酶抑制劑1均與PDR具有相關性[1，27，30-31]。作為炎癥過程的負調節(jié)因子，DR患者玻璃體液中PEDF水平較對照組低，這表明在DR的病理過程中不僅促炎細胞因子增加，且平衡抗炎蛋白減少[32]。凝集素是一種參與補體級聯(lián)調節(jié)的蛋白質，在血-視網(wǎng)膜屏障的抗炎保護作用中發(fā)揮重要作用，與PDR相比，凝集素在對照組中呈高表達水平；體內實驗也證明凝集素可降低視網(wǎng)膜屏障損傷，提高早期DR大鼠抗凋亡能力從而保護視網(wǎng)膜神經(jīng)免受損傷[33]。Gao等[34]在PDR患者玻璃體液中發(fā)現(xiàn)血管緊張素原上調和鈣結合蛋白-1、間皮受體視黃醇結合蛋白、細胞外超氧化物歧化酶3和PEDF下調，這些差異表達的蛋白均可作為生物標志物，提示PDR可能發(fā)生或進展。

2.4 血漿

DR是糖尿病的微血管并發(fā)癥，其病理過程中蛋白質組變化在全身循環(huán)中較為明顯。血漿是最常規(guī)的樣本類型，DR患者在接受手術治療時，其血漿樣本相對更容易獲得[35]。血漿樣本中已報道許多與DR發(fā)病相關的蛋白，是DR的潛在生物標志物，如絲氨酸蛋白酶抑制因子2、C-反應蛋白、C-C基序趨化因子5、細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、白細胞介素6、戊聚糖相關蛋白3、PEDF、纖溶酶原激活物抑制劑1，血清淀粉樣蛋白、趨化因子CXCL12、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、血管黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、可溶性VCAM-1和VEGF[36-38]。ICAM-1是核因子-κB信號通路的下游基因之一，視網(wǎng)膜中ICAM-1表達增加與視網(wǎng)膜中白細胞增多相關，TNF-α觸發(fā)視網(wǎng)膜血管內皮細胞炎癥反應，內皮細胞中ICAM-1表達水平明顯增加。體內實驗結果表明鏈脲佐菌素誘導的DR模型第11個月和第15個月，降低小鼠血漿ICAM-1水平則可明顯減少視網(wǎng)膜白細胞黏附[39]。糖尿病患者血漿中炎癥反應蛋白(azurocidin，AZU1)明顯升高，其升高水平在糖尿病并發(fā)癥包括DR患者中尤為明顯。在血管內皮細胞受到炎癥刺激時，AZU1由中性粒細胞釋放，提示其在調節(jié)視網(wǎng)膜血管通透性中起作用[40]。

Kim等[40]通過蛋白質譜的方法分析NPDR患者與未發(fā)生視網(wǎng)膜病變的糖尿病患者的血漿和玻璃體液，共鑒定出27個存在差異表達的蛋白，進一步通過多反應監(jiān)測方法發(fā)現(xiàn)，APOA-1、α2-巨球蛋白、補體因子H和凝血酶原等蛋白可能是引發(fā)視網(wǎng)膜炎癥反應的關鍵因子；此外，將維生素E結合蛋白、載脂蛋白C-Ⅲ、補體因子B和kallistatin作為聯(lián)合生物標志物用于診斷DR，其準確率可達85%～100%。另一項蛋白質組學研究表明，和健康對照組相比，PDR患者血清α1-糖蛋白水平升高，而α-酸糖蛋白和APOA-1水平降低[41]。此外，也有研究者發(fā)現(xiàn)DR患者血漿中有5種高表達的炎性蛋白CRP、ICAM-1、可溶性糖蛋白130、TNF受體Ⅰ和VCAM-1，其中任1種蛋白在血漿中的高水平表達均能顯著增加DR的患病風險[42]，提示這5種蛋白均可作為DR的生物標志物。

3 蛋白質組學在DR研究中的問題和局限性

蛋白質組學檢測樣本收集方面，淚液取樣是生物流體樣本收集中侵入性最小的方法，但收集足夠用于蛋白質組學檢測的淚液仍存在一定難度。同時，部分合并干眼的患者淚液分泌明顯減少，進一步增加取樣難度。此外，淚液所含蛋白量較少，其中檢測到的差異蛋白對于DR疾病分期和預后的意義仍有待證明。DR視網(wǎng)膜血管滲漏導致房水和玻璃體液中蛋白水平發(fā)生改變，能夠較好地反映視網(wǎng)膜疾病的進程并具有指導疾病治療和提示預后的作用，但房水和玻璃體液樣本的獲取多為有創(chuàng)性操作，很難從健康人人體取材，因而缺乏健康對照。血漿樣本是常規(guī)的臨床檢測樣本，但在研究以糖尿病為基礎疾病的視網(wǎng)膜病變時，血漿中差異表達的蛋白不僅提示視網(wǎng)膜的病理改變，也能體現(xiàn)糖尿病其他臟器并發(fā)癥的嚴重程度。因此，在使用蛋白質組學方法進行研究時，可考慮采集多維度樣本信息，從而更全面、綜合地分析與疾病真正密切相關的蛋白信息。

蛋白質組學檢測過程中，各生物樣本中高豐度蛋白質會影響甚至掩蓋低豐度差異表達蛋白的檢測，容易導致關鍵差異表達蛋白的丟失[31]。

蛋白質組學檢測結果分析過程中，存在著大數(shù)據(jù)分析的共有難題。大規(guī)模蛋白質組學分析的主要局限性在于很難獲取足夠數(shù)量和體積的樣本[43]，過去的大部分研究，特別是探索性的蛋白質組學研究，樣本量相對較小，結果重現(xiàn)性較差。隨著一些新型蛋白質組學技術的發(fā)展，如數(shù)據(jù)非依賴性采集模式，蛋白質組學研究在通量、重現(xiàn)性和靈敏度方面有所改善。目前，越來越多的研究不斷細化疾病的分組和分型，如將NPDR患者按照病程長短、眼底表現(xiàn)差異等進一步細化亞組分型，而隨著檢測組數(shù)目的增加，具體哪2個組之間的差異蛋白更能反映疾病的病變情況還需要研究者不斷探索。

蛋白質組學結果分析和討論的過程中也存在有很大的困難。研究所發(fā)現(xiàn)的差異蛋白并不一定是與疾病發(fā)病機制高度相關的關鍵蛋白。此外，不同生物學液體的檢測結果也存在矛盾的情況，如PDR患者玻璃體液樣本中PEDF水平顯著降低，但其外周血中PEDF表達水平顯著升高[44]。因此蛋白質組學結果需要研究者進一步驗證。

4 蛋白質組學在DR研究中的應用前景

對DR患者的生物流體進行蛋白質組學研究有助于提高對DR發(fā)病機制的認識。隨著高通量蛋白分析技術的不斷改進，這些研究在發(fā)現(xiàn)DR生物標志物和識別新的治療靶點方面具有巨大潛力。此外，蛋白質組學的研究范圍也逐步擴展至檢測蛋白質翻譯后修飾的水平，使研究者能夠評估蛋白的糖基化、磷酸化和乙?；癄顟B(tài)，為DR的蛋白質組差異提供更多功能背景。最重要的是，蛋白質組學與其他組學分析相結合成為篩選新型治療藥物、評判治療效果的新手段?？傊?，高通量蛋白質組學分析為DR的診斷、預后和治療檢測以及開發(fā)新療法提供了新的方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突