柏文 蔣沁

南京醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院，南京 210029

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病重要的微血管并發(fā)癥，是50歲以上人群致盲的常見原因之一[1]。單純控制血糖對(duì)延緩DR發(fā)生和發(fā)展的效果并不明顯。目前有效抑制DR進(jìn)展的治療手段，如激光光凝、玻璃體腔注射抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)藥物和玻璃體切割術(shù)等具有一定的組織破壞性，且多用于晚期DR的治療[2-3]。傳統(tǒng)中草藥具有天然且安全的特性，其在DR防治中的應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注[4]。銀杏葉有數(shù)千年的臨床應(yīng)用史,目前，銀杏葉制劑已于130多個(gè)國家使用?；诖耍袊t(yī)師協(xié)會(huì)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)師分會(huì)組織知名專家制定了《口服銀杏葉制劑臨床應(yīng)用中國專家共識(shí)(2020)》以指導(dǎo)和規(guī)范銀杏葉制劑的臨床應(yīng)用，并推薦銀杏葉制劑應(yīng)用于早期DR患者[5]。大量的基礎(chǔ)和臨床研究均顯示，銀杏葉提取物可以安全、有效地減輕視網(wǎng)膜微血管和神經(jīng)損傷，可作為預(yù)防和治療DR的代替療法[6-9]。銀杏葉含有許多具有藥理活性的成分，如類黃酮(槲皮素、山柰酚、木犀草素和異鼠李素等)和萜類化合物(銀杏內(nèi)酯等)[10-11]，對(duì)改善血液微循環(huán)、調(diào)節(jié)脂代謝、阻止血凝塊形成、抵抗氧化應(yīng)激和減輕炎癥反應(yīng)等方面具有積極作用[12-14]；但其治療DR的具體機(jī)制尚未完全明確。因此，需要進(jìn)一步篩選銀杏葉中的活性成分，闡明其改善DR的具體作用通路及機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法可以研究藥物在生物體內(nèi)作用的潛在機(jī)制，能夠有效揭示小分子藥物的調(diào)控原理，并逐漸應(yīng)用于眼科領(lǐng)域[15-17]。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索銀杏葉提取物治療DR的潛在機(jī)制，以期為DR治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫篩選銀杏葉活性成分及其靶點(diǎn)

檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)，以口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18為閾值篩選銀杏葉活性成分，并根據(jù)已知具有藥理功能的銀杏葉活性成分進(jìn)行擴(kuò)充。同時(shí)檢索TCMSP和Swiss target prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫，以Probability>0.3為閾值篩選銀杏葉活性成分的已知靶點(diǎn)和預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.2 數(shù)據(jù)庫篩選DR相關(guān)靶點(diǎn)并獲取銀杏葉治療DR的潛在靶點(diǎn)

以diabetic retinopathy為檢索詞檢索GeneCards(https://www.genecards.org/)和DisGENET(https://www.disgenet.org/home/)數(shù)據(jù)庫中與DR相關(guān)的治療靶點(diǎn)。分別以Relevance score>5和Gene-disease association score>0.1為閾值篩選與DR高度相關(guān)的靶點(diǎn)。將得到的靶點(diǎn)與銀杏葉活性成分靶點(diǎn)取交集，獲取銀杏葉治療DR的潛在靶點(diǎn)。

1.3 銀杏葉活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)分析

靶點(diǎn)蛋白經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)規(guī)范靶點(diǎn)名稱后，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)。將高等置信度(High confidence>0.7)的靶點(diǎn)蛋白相互作用信息導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，構(gòu)建銀杏葉活性成分-潛在治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.8.2軟件中的NetworkAnalyzer插件，根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值(degree)參數(shù)篩選重要程度較高的關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)。度值參數(shù)是節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)相互作用的數(shù)目，反映節(jié)點(diǎn)的重要程度。

1.4 功能富集分析和通路分析探索靶點(diǎn)的生物學(xué)功能與信號(hào)通路

使用R軟件(R-3.6.3)對(duì)銀杏葉治療DR的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行功能富集分析、通路分析和可視化。經(jīng)org.Hs.eg.db包將上述靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)換成entrez ID后，使用clusterProfiler包以P值<0.05和Q值<0.05為閾值進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)生物學(xué)功能和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號(hào)通路富集分析。根據(jù)富集基因數(shù)目count值排序，使用enrichplot包對(duì)生物學(xué)過程、細(xì)胞組成與分子功能3個(gè)模塊的前10條GO條目和前20條信號(hào)通路進(jìn)行可視化。

1.5 分子對(duì)接驗(yàn)證銀杏葉關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合作用

從Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵活性成分mol2格式結(jié)構(gòu)文件，通過Chem3D軟件將上述文件轉(zhuǎn)換為pdp格式的3D結(jié)構(gòu)文件。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb)中直接下載關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白pdp格式的3D結(jié)構(gòu)文件。通過Autodock 4.2軟件根據(jù)蛋白活性位點(diǎn)設(shè)置Gridbox參數(shù)范圍，并利用Autodock vina 1.1.2軟件進(jìn)行分子對(duì)接。PyMOL用于顯示靶點(diǎn)蛋白和活性成分的對(duì)接示意圖。根據(jù)結(jié)合自由能最低的原則，確定與每個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白對(duì)接最佳的關(guān)鍵活性成分，即結(jié)合自由能越低，意味著靶點(diǎn)蛋白與活性成分結(jié)合越穩(wěn)定，相互作用可能性也越大。本研究的設(shè)計(jì)流程圖見圖1。

圖1 銀杏葉提取物對(duì)DR治療作用的研究設(shè)計(jì)流程圖 DR：糖尿病視網(wǎng)膜病變Figure 1 Research design flowchart of effect of ginkgo leaves extract on DR DR:diabetic retinopathy

2 結(jié)果

2.1 銀杏葉活性成分

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共檢索到307個(gè)銀杏葉化合物成分。根據(jù)口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18篩選后，補(bǔ)充文獻(xiàn)[18]中含量較高且具有藥理活性的銀杏葉成分銀杏內(nèi)酯A，共得到27個(gè)銀杏葉活性成分。銀杏葉活性成分基本信息見表1。

2.2 銀杏葉治療DR的潛在靶點(diǎn)

根據(jù)Swiss target prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)得到活性成分的118個(gè)作用靶點(diǎn)，TCMSP數(shù)據(jù)庫中收錄活性成分的224個(gè)作用靶點(diǎn)，最終合并得到銀杏葉13個(gè)活性成分的312個(gè)作用靶點(diǎn)。在GeneCards和DisGENET數(shù)據(jù)庫共檢索到1 553個(gè)DR相關(guān)治療靶點(diǎn)，篩選出196個(gè)與DR高度相關(guān)的靶點(diǎn)。將312個(gè)銀杏葉活性成分作用靶點(diǎn)與196個(gè)DR相關(guān)治療靶點(diǎn)取交集，得到共同靶點(diǎn)34個(gè)，作為銀杏葉治療DR的潛在靶點(diǎn)(圖2)。

圖2 銀杏葉治療DR的潛在靶點(diǎn)Venn圖 DR：糖尿病視網(wǎng)膜病變Figure 2 Venn diagram of potential targets of ginkgo folium in the treatment of DR DR:diabetic retinopathy

2.3 功能富集分析和通路分析

2.3.1銀杏葉治療DR潛在靶點(diǎn)的生物學(xué)功能 在生物過程中，靶點(diǎn)主要涉及化學(xué)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、活性氧代謝和蛋白激酶B信號(hào)等；在細(xì)胞組分中，靶點(diǎn)主要涉及分泌顆粒腔、胞漿囊泡腔、膜區(qū)域和脂筏等；在分子功能中，靶點(diǎn)主要涉及受體配體活性、信號(hào)受體激活劑活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性和生長因子活性等(圖3A)。

圖3 銀杏葉治療DR的潛在靶點(diǎn)GO及KEGG富集分析 A：GO富集分析 B：KEGG富集分析 AGE-RAGE：晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體；MAPK：絲裂原活化蛋白激酶；PI3K-Akt：脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B；HIF：缺氧誘導(dǎo)因子；TNF：腫瘤壞死因子；IL：白細(xì)胞介素；EGFR：表皮生長因子受體Figure 3 GO and KEGG enrichment analysis for the potential targets of ginkgo folium in the treatment of DR A:GO enrichment analysis B:KEGG enrichment analysis AGE-RAGE:advanced glycation end product-receptor for advanced glycation end product;MAPK:mitogen active protein kinase;PI3K-Akt:phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B;HIF:hypoxia inducible factor;TNF:tumor necrosis factor;IL:interleukin;EGFR:epidermal growth factor receptor

2.3.2銀杏葉治療DR潛在靶點(diǎn)的生物學(xué)信號(hào)通路 靶點(diǎn)參與多種信號(hào)通路，包括糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體(advanced glycation end product-receptor for advanced glycation end product，AGE-RAGE)信號(hào)通路，與血流動(dòng)力學(xué)相關(guān)的流式剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路，與細(xì)胞生存、增生以及調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen active protein kinase，MAPK)信號(hào)通路和磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt)信號(hào)通路，與缺氧應(yīng)激相關(guān)的缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)信號(hào)通路，以及與免疫和炎癥相關(guān)的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號(hào)通路和白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17信號(hào)通路等(圖3B)。

2.4 銀杏葉活性成分-潛在治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及其關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)

網(wǎng)絡(luò)中度值排名前4位的關(guān)鍵活性成分為槲皮素、山柰酚、木犀草素和異鼠李素，排名前8位的關(guān)鍵靶點(diǎn)為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(serine/threonine protein kinase 1，AKT1)、VEGF-A、IL-6、TNF、內(nèi)皮型一氧化氮合酶3(nitric oxide synthase 3，NOS3)、過氧化物酶體增生物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPARG)、IL-10和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)(圖4)。

圖4 銀杏葉活性成分-潛在治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 節(jié)點(diǎn)大小與度值相關(guān)，度值越大，節(jié)點(diǎn)越大。紅色節(jié)點(diǎn)為銀杏葉活性成分，紫色節(jié)點(diǎn)為蛋白靶點(diǎn)Figure 4 Construction of active components-potential therapeutic targets network Node size was related to the degree value,the greater the degree value,the larger the node.Red nodes represented active components in ginkgo folium,and purple nodes represented protein targets

表2 關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接信息Table 2 Information of molecular docking between key active components and key targets關(guān)鍵靶點(diǎn)關(guān)鍵化合物結(jié)合自由能(kcal/mol)關(guān)鍵靶點(diǎn)關(guān)鍵化合物結(jié)合自由能(kcal/mol)AKT1槲皮素-9.8NOS3槲皮素-8.1山柰酚-9.5山柰酚-9.7木犀草素-9.7木犀草素-8.8異鼠李素-9.6異鼠李素-8.3VEGFA槲皮素-7.4PPARG槲皮素-9.4山柰酚-7.1山柰酚-8.2木犀草素-7.2木犀草素-8.8異鼠李素-7.1異鼠李素-9.6IL-6槲皮素-6.7IL-10槲皮素-6.7山柰酚-6.6山柰酚-6.6木犀草素-6.9木犀草素-6.9異鼠李素-6.8異鼠李素-6.8TNF槲皮素-8.5MMP-9槲皮素-10.7山柰酚-7.8山柰酚-10.2木犀草素-8.2木犀草素-10.8異鼠李素-8.4異鼠李素-10.1 注:AKT:絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶;VEGFA:血管內(nèi)皮生長因子A;IL:白細(xì)胞介素;TNF:腫瘤壞死因子;NOS:一氧化氮合酶;PPARG:過氧化物酶體增生物激活受體γ;MMP:基質(zhì)金屬蛋白酶 Note:AKT:serine/threonine protein kinase;VEGF-A:vascular endothelial growth factor A;IL:interleukin;TNF:tumor necrosis factor;NOS:nitric oxide synthase;PPARG:peroxisome proliferator activated receptor-γ;MMP:matrix metalloproteinase

2.5 銀杏葉關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合作用的驗(yàn)證

關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果顯示結(jié)合自由能均≤-5.0 kcal/mol，說明關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的對(duì)接較好(表2)。槲皮素與AKT1的Ser205、Thr211、Ile290、Lys268氫鍵連接(圖5A)，與VEGFA的Leu66氫鍵連接(圖5B)，與TNF的Tyr123、Ser107、Gln110、Glu124氫鍵連接(圖5C)。山柰酚與NOS3的Met358氫鍵連接(圖5D)。木犀草素與IL-6的Arg16、Leu19、Arg24、Gln28氫鍵連接(圖5E)，與IL-10的Glu142氫鍵連接(圖5F)，與MMP-9的Met247、Ala189、Gln227氫鍵連接(圖5G)。異鼠李素與PARRG的Gln273、Thr268氫鍵連接(圖5H)。

圖5 關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接示意圖 A～C：槲皮素與AKT1、VEGFA和TNF分子對(duì)接 D：山柰酚與NOS3分子對(duì)接 E～G：木犀草素與IL-6、IL-10和MMP-9分子對(duì)接 H：異鼠李素與PARRG分子對(duì)接 綠色結(jié)構(gòu)代表蛋白靶點(diǎn)，紅色結(jié)構(gòu)代表蛋白靶點(diǎn)的氨基酸殘基，藍(lán)色結(jié)構(gòu)代表銀杏葉活性成分，黃色虛線代表氫鍵及其鍵長(?)Figure 5 Schematic diagram of molecular docking between key active components and key targets A-C:Molecular docking of quercetin with AKT1,VEGFA and TNF D:Molecular docking of kaempferol with NOS3 E-G:Molecular docking of luteolin with IL-6,IL-10 and MMP-9 H:Molecular docking of isorhamnetin with PARRG Green structure represented protein targets.Red structure represented amino acid residues of protein targets.Blue structure represented active components of ginkgo folium.Yellow dotted line represented hydrogen bond and its bond length (?)

3 討論

本研究中確定了27個(gè)銀杏葉活性化合物和34個(gè)銀杏葉治療DR的潛在靶點(diǎn)。根據(jù)銀杏葉活性成分與其潛在治療靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的度值，進(jìn)一步獲取了4個(gè)關(guān)鍵活性成分，包括槲皮素、山柰酚、木犀草素和異鼠李素，以及8個(gè)關(guān)鍵治療靶點(diǎn)，包括AKT1、VEGF-A、IL-6、TNF、NOS3、PPARG、IL-10和MMP-9。既往研究表明，這些關(guān)鍵活性成分在DR治療中起重要作用，如槲皮素可以減少高糖誘導(dǎo)的TNF和IL-6的產(chǎn)生，并降低DR大鼠MMP-9和VEGF表達(dá)[19-20]；木犀草素和槲皮素在體內(nèi)外均可以抑制VEGF誘導(dǎo)的新生血管形成[21-23]；山柰酚也可以通過靶向抑制VEGF來抑制高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力[24-25]。此外，關(guān)鍵活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)之間分子對(duì)接的結(jié)果也驗(yàn)證了它們之間存在結(jié)合活性。

本研究中對(duì)銀杏葉治療DR的34個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行了GO和KEGG富集分析，結(jié)果表明銀杏葉中的活性成分主要通過脂筏、分泌顆粒腔和胞漿囊泡腔等細(xì)胞組分參與調(diào)節(jié)AGE-RAGE、MAPK、PI3K-Akt、HIF-1、TNF和IL-17等信號(hào)通路，發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激、減輕缺氧誘導(dǎo)損傷和抑制血管生成作用以延緩DR進(jìn)展。這些信號(hào)通路可能是DR的潛在治療靶標(biāo)。AGE-RAGE信號(hào)通路異常是引起糖尿病大血管和微血管并發(fā)癥的重要原因[26]。AGE與RAGE結(jié)合會(huì)引起強(qiáng)烈的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)下游MAPK和PI3K-Akt等信號(hào)通路的異常激活，導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管的損傷，例如內(nèi)皮功能障礙、周細(xì)胞凋亡、新生血管形成和血管炎癥等[27-29]。先前的研究報(bào)道了缺氧通過促進(jìn)新生血管形成和血管營養(yǎng)不良在DR進(jìn)展中起重要作用[30-31]。在DR中，缺氧相關(guān)的HIF-1信號(hào)通路通過影響VEGF表達(dá)調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜新生血管發(fā)育，也可以通過調(diào)節(jié)促炎因子IL-6和TNF-α的表達(dá)參與炎癥反應(yīng)[32-33]，通過抑制TNF和IL-17信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥改善視網(wǎng)膜微血管和神經(jīng)元損傷[33-34]。這提示銀杏葉提取物可作用于多細(xì)胞組分，調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路，產(chǎn)生不同生物學(xué)功能，從而發(fā)揮治療DR的功效。

綜上所述，本研究對(duì)銀杏葉治療DR的活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)及可能的作用機(jī)制進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，并通過分子對(duì)接驗(yàn)證了化合物與靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性，為進(jìn)一步了解銀杏葉提取物治療DR的藥理機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，但仍有待未來進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究加以驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突

志謝感謝復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院研究院顏標(biāo)教授給予本文重要的建議和幫助

作者貢獻(xiàn)聲明柏文：實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)整理、論文撰寫及修改；蔣沁：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、論文審閱