王仕英　陳　煣

有機添加物對軟棗獼猴桃組織培養(yǎng)的影響

王仕英陳煣

（阿壩師范學(xué)院四川阿壩623000）

文章以軟棗獼猴桃莖尖為外植體，MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L為芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L為增殖培養(yǎng)基，1/2MS+IBA 0.4 mg/L為生根培養(yǎng)基，分別添加不同濃度香蕉泥或椰汁，以不添加有機添加物為空白對照，探究香蕉泥和椰汁對軟棗獼猴桃組織培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：軟棗獼猴桃莖尖組織培養(yǎng)中，添加有機添加物能夠有效促進植物組織芽分化、增殖及生根；添加100 g/L香蕉泥更有利于誘導(dǎo)芽分化，添加150 g/L香蕉泥或150 mL/L椰汁更有利于增殖，添加100 g/L香蕉泥更有利于生根及根系生長。

軟棗獼猴桃；組織培養(yǎng)；香蕉泥；椰汁

軟棗獼猴桃又稱軟棗子、藤梨等，為獼猴桃科獼猴桃屬多年生藤本植物，在我國南北方均可栽培，既可作為果蔬資源，又可用于園林庭院綠化。研究表明，軟棗獼猴桃為藥食兩用水果，不僅含有豐富的維生素、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，還含有蒽醌類、多糖類及多酚類等藥理活性成分，具有抗炎、抗氧化活性[1-4]。隨著人們生活水平的提高和對天然健康食品的追求，由軟棗獼猴桃開發(fā)出的產(chǎn)品越來越多，如軟棗獼猴桃果醬、飲料、果脯等[5]。由此可見，軟棗獼猴桃的市場前景較為廣闊。

依賴于其適應(yīng)性強的特點，目前我國已開始規(guī)模化種植軟棗獼猴桃，特別是在東北三省。軟棗獼猴桃的繁殖方式以播種、嫁接及扦插為主，由于其繁殖受季節(jié)、氣候等因素的影響較大，因此各國利用組織培養(yǎng)方式進行繁殖育種由來已久[6]。在我國，軟棗獼猴桃組織培養(yǎng)研究可以追溯到1991年，張喜春等以軟棗獼猴桃葉片為試材，成功誘導(dǎo)出適合于建立懸浮細胞系的愈傷組織[7]。1992年，胡桂珍等以軟棗獼猴桃的胚為組織培養(yǎng)外植體，成功獲得再生植株[8]；2008年，鄭小華等通過對軟棗獼猴桃莖、葉離體培養(yǎng)的探索，極大地促進育苗效率[9-10]；2018年，李強通過對“龍成2號”軟棗獼猴桃組培體系的探索，得到了最佳誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)基配方[11]。

目前對于軟棗獼猴桃的組織培養(yǎng)，完全依賴化學(xué)添加劑，但在其他物種中成熟的實踐表明，相比化學(xué)添加劑，簡便易得的有機添加物同樣能夠增強植物組織培養(yǎng)中外植體的生長、分化效應(yīng)，促進植物組織增殖及存活。目前植物組織培養(yǎng)中較常使用的有機添加物有椰乳、香蕉汁、蘋果汁、番茄汁、胡蘿卜汁、馬鈴薯汁等，已廣泛應(yīng)用于蝴蝶蘭、鐵皮石斛等珍貴物種的組織培養(yǎng)中[12-13]。本研究選取椰汁和香蕉泥作為有機添加物，探索其在組織培養(yǎng)的不同階段對軟棗獼猴桃生長的影響，以期找到一種適合軟棗獼猴桃組織培養(yǎng)的有機添加物，加快軟棗獼猴桃組織培養(yǎng)速度，為軟棗獼猴桃種苗規(guī)模化工廠化繁殖提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

軟棗獼猴桃植株選用自花授粉品種“庫庫瓦”，購自虹越官方店，2020年3月選擇當(dāng)年生帶芽幼嫩莖條作為試驗材料。

1.2 外植體消毒

試驗前取長勢相同的帶腋芽幼嫩莖段，放置于燒杯中，并用紗布封口，置于自來水下流水沖洗2 h，沖洗完畢后轉(zhuǎn)移至提前消毒的超凈工作臺，用75%乙醇消毒10 s，無菌水清洗后置于無菌濾紙上吸干水分，繼而置于三角瓶中用0.15%氯化汞溶液浸泡7 min～8 min，其間不斷搖晃以使外植體充分接觸氯化汞，保證消毒效果。最后用無菌水沖洗4次～5次，將消毒后的外植體置于滅菌的培養(yǎng)皿中濾紙上，切成長約2 cm的帶芽莖段，便于之后接種于待測培養(yǎng)基中。

1.3 供試培養(yǎng)基配制

通過查閱資料，芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基選擇MS+6-BA2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L，增殖培養(yǎng)基選擇MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L，生根培養(yǎng)基選擇1/2MS+IBA 0.4 mg/L[11]。選擇椰汁及香蕉泥作為有機添加物，其中香蕉泥通過市售香蕉去皮勻漿過濾制得。將兩種有機添加物分別添加至3種培養(yǎng)基中，空白對照（CK）為不添加兩種有添加機物的培養(yǎng)基，各處理組有機添加物添加濃度如表1所示。培養(yǎng)基配制完成后調(diào)節(jié)pH至6，121 ℃高壓蒸汽滅菌鍋滅菌15 min，靜置冷卻后用于外植體接種。

表1培養(yǎng)基中有機添加物的添加濃度設(shè)置

編號有機添加物添加濃度/mL/L編號有機添加物添加濃度/g/L A1椰汁50B1香蕉泥50 A2椰汁100B2香蕉泥100 A3椰汁150B3香蕉泥150 A4椰汁200B4香蕉泥200 CK無————

1.4 誘導(dǎo)培養(yǎng)

將經(jīng)過消毒的外植體在超凈工作臺中于無菌條件下接種于含有不同有機添加物的芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種5個外植體，每個處理接種6瓶共計30個外植體，于光照強度2 000 lx，光照時間14 h/d，溫度（25±1）℃下培養(yǎng)25 d后觀察腋芽萌發(fā)情況，統(tǒng)計腋芽萌發(fā)及褐化情況，篩選最適宜的芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.5 增殖培養(yǎng)

將芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長至一定長度的腋芽從莖端基部剪下，剪成1.5 cm左右一芽一段，轉(zhuǎn)接于含有不同有機添加物的增殖培養(yǎng)基中，每瓶接種3個～4個芽段，每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)接種3瓶，30 d后觀察幼苗生長情況，篩選最適宜的增殖培養(yǎng)基。

1.6 生根培養(yǎng)

將增殖培養(yǎng)基上生長健壯的幼嫩無根苗轉(zhuǎn)移至添加不同有機添加物的生根培養(yǎng)基中，每瓶接種無根苗2個，每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)接種3瓶，25 d后觀察生根情況。

1.7 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Excel、Origin 8.0對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同有機添加物對軟棗獼猴桃組培芽分化誘導(dǎo)的影響

添加不同有機添加物的芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上外植體褐化數(shù)及分化數(shù)如圖1所示。

圖1　不同芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上外植體褐化率及分化率

外植體在芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)第10天時腋芽開始萌動，由圖1可以看出，所有芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基都能在一定程度上誘導(dǎo)腋芽分化，但誘導(dǎo)效果存在差異。A3、B2、B3培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果顯著高于其他組，其中B2誘導(dǎo)分化率最高，達到93.3%。不同種類及添加濃度的有機添加物對芽分化誘導(dǎo)過程中褐化率的影響同樣存在差異，添加200 g/L香蕉泥的B4培養(yǎng)基褐化率最高，其次為B3、A4培養(yǎng)基，其他組培養(yǎng)基對芽分化誘導(dǎo)過程中的褐化率沒有顯著影響，分析原因可能為培養(yǎng)基中含量過高的糖類等營養(yǎng)成分提高了多酚氧化酶活性，導(dǎo)致褐化率增大。

2.2 不同有機添加物對腋芽增殖及生長情況的影響

添加不同有機添加物的增殖培養(yǎng)基上腋芽增殖及生長情況如圖2、圖3、圖4所示。

圖2　不同增殖培養(yǎng)基中組培苗平均株高和葉片數(shù)

圖3　不同增殖培養(yǎng)基中組培苗的增殖系數(shù)

圖4　軟棗獼猴桃組培苗增殖情況

由圖2可知，不同有機添加物均可在一定程度上促進腋芽增殖和生長，與CK組相比，添加香蕉泥或椰汁的增殖培養(yǎng)基上生長的組培苗在株高和葉片數(shù)上有顯著優(yōu)勢。由圖4可知，A3、B3培養(yǎng)基上生長的組培苗，其株高、葉片數(shù)以及生長旺盛程度要明顯優(yōu)于CK組，說明香蕉泥和椰汁所含有機營養(yǎng)成分及礦物質(zhì)等均可被軟棗獼猴桃組培苗有效吸收。圖3為不同增殖培養(yǎng)基中組培苗的增殖系數(shù)，可知添加有機添加物的增殖培養(yǎng)基的增殖系數(shù)顯著高于CK組。其中添加150 g/L香蕉泥的B3組增殖系數(shù)最高，達到4.89，其次為添加150 mL/L椰汁的A3組，增殖系數(shù)為4.79，與其他組有顯著差異，且此兩組的平均株高及葉片數(shù)均顯著高于其他組。綜合分析A3、B3組，添加150 g/L香蕉泥或150 mL/L椰汁促進腋芽增殖的效果最好，兩組的平均株高、平均葉片數(shù)和增殖系數(shù)沒有顯著差異，說明在適宜添加濃度下，香蕉泥與椰汁對軟棗獼猴桃組培苗營養(yǎng)成分的供應(yīng)是相似的，但隨著有機添加物添加濃度繼續(xù)增大，組培苗生長情況和增殖系數(shù)反而急劇下降，可能是由于養(yǎng)分過剩導(dǎo)致鹽害，從而影響組培苗生長。

2.3 不同有機添加物對組培苗生根情況的影響

添加不同有機添加物的生根培養(yǎng)基上組培苗生根情況如圖5、圖6所示。

圖5　不同生根培養(yǎng)基中組培苗平均根長和根數(shù)

圖6　軟棗獼猴桃組培苗生根情況

由圖5可知，添加不同種類及含量有機添加物的生根培養(yǎng)基中組培苗的生根效果明顯優(yōu)于對照組，其中表現(xiàn)較好的兩組培養(yǎng)基為A2和B2，特別是B2培養(yǎng)基，組培苗平均根長可達到1.81 cm，平均根數(shù)可達到5.32根。A2培養(yǎng)基平均根長為1.70 cm，平均根數(shù)為4.59，生根率達到100%。并且包括CK在內(nèi)，所有生根培養(yǎng)基在不同時間內(nèi)均可使組培苗生根。圖6為將組培苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基后第15天的生根情況，由圖6可知，未添加任何有機添加物的對照組在第15天時只有部分須根及氣生根長出，而添加香蕉泥或椰汁的試驗組第15天時均有粗壯的主根長出，特別是添加100 g/L香蕉泥的B2組，第15天時根系生長已初步完善，主根和須根的根長以及數(shù)量均高于其他組。

3 討論與結(jié)論

本研究以軟棗獼猴桃品種“庫庫瓦”的幼嫩莖段為外植體，研究有機添加物香蕉泥和椰汁對軟棗獼猴桃組織培養(yǎng)不同階段的影響。試驗選擇不同添加濃度的兩種有機添加物，通過統(tǒng)計在腋芽誘導(dǎo)階段的誘導(dǎo)分化率及褐化率，增殖階段的生長情況和增殖系數(shù)以及生根情況等相關(guān)數(shù)據(jù)并進行分析，綜合表明有機添加物在一定程度上可以促進植物組織培養(yǎng)過程中的芽分化、增殖和生根。這與李揚等在有機添加物對馬鈴薯組培苗生長中的影響研究中所得出的結(jié)論一致[14]。在芽分化誘導(dǎo)階段，隨著培養(yǎng)基中兩種有機添加物含量升高，外植體褐化率有升高趨勢，這可能是由于培養(yǎng)基中含量過高的糖等營養(yǎng)成分會加劇褐化[15]。同樣的抑制作用也體現(xiàn)在腋芽增殖及生根階段。從試驗結(jié)果可知，不同添加濃度的兩種有機添加物均對組培苗增殖及生根均有促進作用，但超過適宜濃度后，隨有機添加物添加濃度的持續(xù)增加，其促進作用會降低，說明組織培養(yǎng)過程中組培苗對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收是有限度的，過量添加有機物并不能持續(xù)促進其生長。

該研究結(jié)果表明，最適宜軟棗獼猴桃外植體芽分化誘導(dǎo)的添加有機添加物培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA0.1 mg/L+香蕉泥100 g/L，最適宜的增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L+香蕉泥150 g/L，或MS+6-BA2.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L+椰汁150 mL/L，最適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.4 mg/L+香蕉泥100 g/L。香蕉泥、椰汁等均為易得的有機添加物，其中含有復(fù)合營養(yǎng)成分，如無機物、有機物、生長離子等，任何一種成分都可能是影響植物組織培養(yǎng)效果的關(guān)鍵因素，鑒于其價格低廉、易得的特點，尋找合適高效的組織培養(yǎng)有機添加物或其組合，有利于提高生產(chǎn)效率，降低組織培養(yǎng)育苗成本。

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10.3969/j.issn.2095-1205.2022.09.03

S663.4

A

2095-1205(2022)09-07-04

阿壩師范學(xué)院校級規(guī)劃項目（ASB19-16）；四川省教育廳2021—2023年高等教育人才培養(yǎng)質(zhì)量和教學(xué)改革項目（JG2021- 118）；阿壩師范學(xué)院2019年實踐教學(xué)類綜合改革項目（201904028）

王仕英（1989- ），女，漢族，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向為植物組織培養(yǎng)。