洪照微，韓如意，王 沛，杜子成，陳小慶

南昌市雞蛔蟲形態(tài)學(xué)與分子特征分析

洪照微，韓如意，王 沛，杜子成，陳小慶*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045）

【目的】旨在通過分析雞蛔蟲的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征，以了解南昌市雞蛔蟲與其他蛔蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系?！痉椒ā坑^察并記錄分離自南昌市雞蛔蟲的形態(tài)學(xué)特征，隨后提取每個(gè)樣本總DNA，PCR擴(kuò)增基因并測(cè)序，序列經(jīng)NCBI比對(duì)后，對(duì)蛔蟲樣本ITS基因進(jìn)行同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析。【結(jié)果】所有蛔蟲樣本蟲體呈淡黃色，頭部可見唇瓣3片，近頭端可見神經(jīng)環(huán)。雄蟲尾部向腹部彎曲而雌蟲尾部尖直?；紫x樣本基因大小均為1 000 bp左右，與安徽、湖南、波蘭雞蛔蟲分離株(登錄號(hào)分別為：MN158368、OM876368、KY789470）以及與鴿蛔蟲（登錄號(hào)：JQ995321）高度同源，與鵝蛔蟲（登錄號(hào)：KC905082）同源性相對(duì)較高。實(shí)驗(yàn)分離的雞蛔蟲樣本序列與其他國(guó)家或地區(qū)的雞蛔蟲序列及鴿蛔蟲序列聚為一簇，與其他國(guó)家或地區(qū)的雞蛔蟲親緣關(guān)系最近，與鴿蛔蟲親緣關(guān)系也很近；鵝蛔蟲與其互為姊妹群，有獨(dú)立的進(jìn)化分支，親緣關(guān)系相對(duì)較近?！窘Y(jié)論】分離自南昌的雞蛔蟲與安徽、湖南、波蘭雞蛔蟲分離株高度同源，親緣關(guān)系很近，初步判定它們具有相同的起源，同時(shí)也表明南昌地區(qū)雞蛔蟲可能由安徽、湖南等地區(qū)流入；而與鵝蛔蟲同源性相對(duì)較高，但具有一定差異性，說明種間ITS基因存在一定變異，是分析蛔蟲種間發(fā)育關(guān)系的良好標(biāo)記基因。雞蛔蟲的形態(tài)學(xué)和分子特征分析可為雞蛔蟲的鑒定以及雞蛔蟲病的防控奠定理論基礎(chǔ)。

雞蛔蟲；形態(tài)特征；基因；系統(tǒng)發(fā)育分析；南昌市

【研究意義】隨著生活水平的提高，人們對(duì)畜禽類產(chǎn)品要求也逐漸提高，愈發(fā)追求綠色、安全、健康的畜禽產(chǎn)品，散養(yǎng)家禽模式也越來越受歡迎。散養(yǎng)雞因其陸地啄食的生活習(xí)性，易吞食被感染性蟲卵污染的飼料、飲水或啄食攜帶有感染性蟲卵的轉(zhuǎn)續(xù)宿主而感染雞蛔蟲病。因此，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對(duì)南昌地區(qū)雞蛔蟲進(jìn)行鑒定分析，了解該地區(qū)雞蛔蟲系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，對(duì)于當(dāng)?shù)仉u蛔蟲的防治及后續(xù)研究具有一定意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】雞蛔蟲（）隸屬于蛔目（Ascaridida）禽蛔科（Ascarididae）禽蛔屬（）[1]，常寄生于雞小腸，也可寄生于胃和食道等其他消化器官。雞蛔蟲病多發(fā)于春、夏、秋季[2]，以三月齡以下的散養(yǎng)的雛雞最為易感。雞感染后常出現(xiàn)精神沉郁、食欲不良、腹瀉、體重減輕、產(chǎn)蛋率下降等病癥[3-5]，當(dāng)病雞體內(nèi)定殖的蛔蟲達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，影響宿主正常的生長(zhǎng)發(fā)育，從而造成養(yǎng)殖成本上升，影響?zhàn)B殖戶的經(jīng)濟(jì)效益[6-9]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年國(guó)內(nèi)外已有眾多關(guān)于寄生蟲種類鑒定、分子分類和遺傳學(xué)研究的報(bào)道?；蛭挥?8S rDNA和28S rDNA之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，由ITS-1、5.8S rDNA和ITS-2組成。因其不參與成熟核糖體，故變異較快，具有種內(nèi)變異小而種間變異大的特點(diǎn)，常作為一種分子標(biāo)記用于寄生蟲的種類鑒定，同時(shí)也是種內(nèi)遺傳變異研究的常用基因之一[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】?jī)H基于形態(tài)學(xué)特征和流行學(xué)特點(diǎn)對(duì)雞蛔蟲進(jìn)行分類顯然達(dá)不到精準(zhǔn)分類的目標(biāo)[12]，故對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的分類鑒定、了解遺傳發(fā)育關(guān)系對(duì)雞蛔蟲防治有重要意義。研究擬通過結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)，以為標(biāo)記基因，探究南昌市雞蛔蟲的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分析南昌市雞蛔蟲與其他蛔蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為雞蛔蟲的分子生物學(xué)分析和種群遺傳研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

對(duì)購自南昌市某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的5只散養(yǎng)雞采用動(dòng)物蠕蟲學(xué)剖檢技術(shù)進(jìn)行解剖，在其體內(nèi)分離得到24條蛔蟲，編號(hào)為H1-H24，所有樣品用生理鹽水洗凈后進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，最后置于無菌生理鹽水中，4 ℃保存。

1.2 主要試劑

TAKARA（Ex Taq DNA聚合酶，Mg2+plus，dNTP mixture，pMD18-T載體，Solution I，DNA DL 2 000 Marker DL 2 000，6×loading buffer），天根TIANamp Genomic DNA Kit，Genstar StarPrep Gel Extraction Kit，全式金DH5α感受態(tài)細(xì)胞，其余試劑全部為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察

將所有蛔蟲樣本用生理鹽水洗凈后逐個(gè)置于載玻片上，滴加適量生理鹽水后蓋上蓋玻片，光學(xué)顯微鏡觀察樣本形態(tài)學(xué)特征，拍照并記錄。

1.4 提取蛔蟲總DNA、PCR擴(kuò)增

無菌剪刀剪碎樣本后嚴(yán)格按照組織DNA提取試劑盒說明書提取所有蛔蟲樣本總DNA，提取的DNA保存于-20 ℃?zhèn)溆?。參照文獻(xiàn)[13]合成蛔蟲基因引物（上游引物：5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′；下游引物：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′），引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成?；紫x基因PCR擴(kuò)增體系（25 μL）如下：17 μL ddH20，2.5 μL 10×PCR Buffer（Mg2+plus），2 μL dNTP，上下游引物各0.5 μL，2 μL模板DNA，0.5 μL Ex Taq DNA聚合酶。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃末期延伸5 min，PCR產(chǎn)物于4 ℃保存。每個(gè)反應(yīng)都包含一個(gè)以蒸餾水為模板的陰性對(duì)照。每個(gè)樣均取5 μL PCR產(chǎn)物與1 μL 6×Loading Buffer混合后加入上樣孔，10 g/L瓊脂糖凝膠120 V電泳30 min，用EB（溴化乙錠）對(duì)DNA染色，凝膠成像儀成像并拍照記錄PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.5 克隆與序列測(cè)定

DNA經(jīng)膠回收純化后與pMD-18T載體連接，連接體系為：3 μL ddH2O，3 μL Solution Ⅰ溶液，3 μL膠回收DNA，1 μL pMD18-T載體。4 ℃過夜連接。將5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入50 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，搖床200 r/min培養(yǎng)2 h，整個(gè)轉(zhuǎn)化過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。取200 μL菌液均勻涂布于含有氨芐（氨芐濃度為0.1 g/mL）的固體LB培養(yǎng)基，隨后37 ℃培養(yǎng)過夜。槍頭挑選單個(gè)白色菌落于含有氨芐（氨芐濃度為0.1 g/mL）的1 mL液體LB培養(yǎng)基中，搖床200 r/min培養(yǎng)6 h。菌液PCR（條件和體系同1.4）后，挑選電泳結(jié)果條帶清晰明亮的菌液200 μL送往擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.6 序列對(duì)比與系統(tǒng)發(fā)育分析

用Chromas校準(zhǔn)測(cè)序所得序列后將序列拼接，去除載體序列后在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)。在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索并下載已收錄的代表性線蟲的基因序列，用Megalign和MEGA 7.0.26分別進(jìn)行同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹（基于線蟲基因，以鄰交法和Komura 2模式，自舉值設(shè)置1 000）的構(gòu)建。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

研究共分離得到24個(gè)雞蛔蟲樣本，所有樣本蟲體均呈淡黃色，線狀，體表覆角質(zhì)層，橫紋清晰可見。雌雄異體，雌蟲較雄蟲大且長(zhǎng)。顯微鏡下隱約可見唇瓣3片，近頭端至食管可見神經(jīng)干及神經(jīng)環(huán)。雄蟲尾部向腹部彎曲，尾端有一小尖刺，近尾端可見泄殖腔，延伸出一對(duì)幾乎等長(zhǎng)的交合刺。雌蟲尾部尖且直，近尾端可看見肛門（圖1）。

A：雞蛔蟲頭部；B：雌蟲尾部

2.2 蟲體ITS基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

使用保守引物NC2/NC5擴(kuò)增所有蛔蟲樣本基因。結(jié)果顯示基因大小約為1 000 bp，與預(yù)期條帶大小一致，無非特異性條帶產(chǎn)生，陰性對(duì)照均無條帶（圖2）。

10、20、27為陰性對(duì)照

2.3 DNA序列比對(duì)分析

測(cè)序結(jié)果顯示所有蛔蟲樣本基因（登錄號(hào)分別為MW136454、MW218962-MW218982、MW343494-MW343494）大小為1 000 bp，A+T含量為63.15%，G+C含量為36.85%。樣本序列間高度同源，同源性為99.4%～100.0%?；诓糠只蛐蛄羞M(jìn)行同源性分析的結(jié)果表明，樣本序列與安徽雞蛔蟲（MN158368）、湖南雞蛔蟲（OM876368）、波蘭雞蛔蟲（KY789470）和美國(guó)鴿蛔蟲（JQ995321）序列之間同樣高度同源，同源性在99.1%～100.0%；與鵝蛔蟲（KC905082）同源性相對(duì)較高，同源性在94.0%～94.6%；與雞異刺線蟲（MF066726）同源性僅在69.8%～70.3%；與犬弓首蛔蟲（JF837170）、貓弓首蛔蟲（AB571303）、牛弓蛔蟲（KT737382）、獅弓蛔蟲（JF837176）、豬蛔蟲（AB571302）、人蛔蟲（AB571301）、毛圓線蟲（LN999857）和野豬后圓線蟲（KP890023）同源性均低于60.0%（圖3）。

圖3 基于ITS基因同源性分析

2.4 ITS基因序列發(fā)育分析

基于基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示（圖4），實(shí)驗(yàn)得到的雞蛔蟲序列與參考雞蛔蟲（MN158368、OM876368、KY789470）序列聚為一簇，與美國(guó)鴿蛔蟲（JQ995321）序列、中國(guó)鵝蛔蟲（KC905082）和雞異刺線蟲（MF066726）聚為一大支。在所有蛔目蛔蟲所屬支系中，雞蛔蟲（包括樣品序列）與鴿蛔蟲親緣性最近，與鵝蛔蟲（KC905082）親緣關(guān)系較近；在蛔目其他屬線蟲中，與雞異刺線蟲（MF066726）親緣性較近，而與毛圓線蟲（LN999857）和野豬后圓線蟲（KP890023）等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

帶有黑色三角形的為本實(shí)驗(yàn)分離得到序列，三角形右側(cè)為分離序列的GenBank登錄號(hào)

3 討 論

雞蛔蟲是雞最常見的寄生蟲之一，主要寄生于小腸，是小腸內(nèi)最大的線蟲[14]。雞蛔蟲蟲體呈黃白色，線狀，兩側(cè)對(duì)稱，雌雄異體，通常雌蟲較雄蟲大[15-16]。寄生蟲的形態(tài)學(xué)和流行病學(xué)研究為線蟲分類提供了基礎(chǔ)，但由于同源特征、化石記錄等的缺失[17]，以及通過形態(tài)學(xué)分析難以區(qū)分某些寄生蟲形態(tài)及卵的結(jié)構(gòu)特征[18-20]，導(dǎo)致從形態(tài)學(xué)和流行病學(xué)特征中獲得一致的線蟲門系統(tǒng)發(fā)育和分類框架非常困難，故針對(duì)線蟲很難進(jìn)行特異性診斷[21]。

分子生物學(xué)技術(shù)是寄生蟲鑒定及其基因發(fā)育分析的常用手段，與傳統(tǒng)的診斷方法相比，具有更高的敏感性和特異性[18]。部分線粒體（基因等）和核糖體基因（基因等）是寄生蟲鑒定及分類的重要標(biāo)記基因[22-23]。序列屬于高度重復(fù)序列，通過不等交換和基因轉(zhuǎn)換可以在位點(diǎn)間或位點(diǎn)內(nèi)發(fā)生同步轉(zhuǎn)換。同時(shí)，由于序列相對(duì)保守，有利于引物的設(shè)計(jì)，這為利用PCR方法進(jìn)行測(cè)序奠定了基礎(chǔ)[11]。林瑞慶等[24]通過對(duì)雞蛔蟲序列的測(cè)序比較，結(jié)果表明中國(guó)廣州的兩個(gè)雞蛔蟲樣品間沒有差異，與澳大利亞分離株同源性為99.7%，證明雞蛔蟲序列種內(nèi)高度保守，而雞蛔蟲在序列存在的微小差異可能是地理差異，這是國(guó)內(nèi)首次使用PCR擴(kuò)增雞蛔蟲序列并進(jìn)行序列分析。郝桂英等[25]對(duì)中國(guó)涼山地區(qū)雞蛔蟲分離株基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，7個(gè)測(cè)序序列的同源性為98.9%～100.0%，與其他蛔蟲同源性均<94.0%；劉明洋[26]對(duì)擴(kuò)增了5個(gè)雞蛔蟲湖南分離株，其序列間相似性均在98%以上，與其他蛔蟲同源性較低。這些研究進(jìn)一步表明雞蛔蟲序列具有種內(nèi)變異較小、種間差異較明顯的特征，可作為分子遺傳標(biāo)記用于雞蛔蟲的鑒定。實(shí)驗(yàn)以為標(biāo)記基因，分析南昌市雞蛔蟲的系統(tǒng)發(fā)育特征，與世界上目前所發(fā)現(xiàn)的其他雞蛔蟲序列進(jìn)行比較，分析本次收集的雞蛔蟲發(fā)育進(jìn)程。

實(shí)驗(yàn)分離得到的24個(gè)雞蛔蟲樣本種間高度同源，同源性為99.4%～100.0%，且與其他國(guó)家、地區(qū)雞蛔蟲同樣高度同源，這表明此次分離所得雞蛔蟲樣本與參考序列在發(fā)育進(jìn)程中為同一種系，同時(shí)也表明南昌地區(qū)雞蛔蟲可能由湖南、安徽等地流入。此外，樣本序列與鴿蛔蟲同樣高度同源，而與鵝蛔蟲的同源性相對(duì)較高，而與雞異刺線蟲等其他線蟲同源性很低，這表明雞蛔蟲與鴿蛔蟲、鵝蛔蟲在發(fā)育進(jìn)程中可能為同一種系，但存在一定變異。同時(shí)這再次驗(yàn)證了基因種內(nèi)高度保守，種間差異明顯的特點(diǎn)，也說明基因是雞蛔蟲分類鑒定的良好標(biāo)記基因。所有雞蛔蟲樣本序列與參考的雞蛔蟲序列聚為一簇，并與鴿蛔蟲、鵝蛔蟲和雞異刺線蟲聚為一大支，與鴿蛔蟲親緣關(guān)系很近，與鵝蛔蟲親緣關(guān)系相對(duì)較近，與同源性分析結(jié)果一致。雞蛔蟲、鴿蛔蟲、鵝蛔蟲以及雞異刺線蟲等都有獨(dú)立進(jìn)化分支，進(jìn)化距離相對(duì)較遠(yuǎn)，不同蛔蟲間可以顯著區(qū)分開來，同樣說明基因是雞蛔蟲分類、鑒定的良好標(biāo)記基因，同時(shí)也是雞蛔蟲遺傳發(fā)育研究良好靶標(biāo)基因。

目前，左旋咪唑、甲苯咪唑、阿苯達(dá)唑、哌嗪等仍是中國(guó)和許多其他國(guó)家治療蛔蟲病最常使用的藥物，且單獨(dú)口服給藥比飲用水給藥療效更顯著[27]，但重復(fù)或者過度使用這些藥物容易產(chǎn)生耐藥性[28]。靶向治療是防治線蟲的一種方法，指在糞便中發(fā)現(xiàn)蟲卵便立即使用藥物進(jìn)行治療，并對(duì)糞便進(jìn)行處理以減少寄生蟲蟲卵對(duì)環(huán)境的污染，同時(shí)應(yīng)用靶向治療可增加飼料轉(zhuǎn)化率，提高蛋品質(zhì)等[29]。使用疫苗也可以大大降低許多疾病的發(fā)病率和死亡率。鉛亞單位疫苗的靶向目標(biāo)是利用寄生蟲的蛋白組分的經(jīng)典生化技術(shù)（S. mansoni 28 kda谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶和14 kda脂肪酸結(jié)合蛋白抗原）確定的[30-31]，通過這些靶標(biāo)影響寄生蟲入侵及生長(zhǎng)與繁殖[32]，從而達(dá)到防控與治療的目的。

實(shí)驗(yàn)通過觀察南昌市雞蛔蟲的形態(tài)學(xué)特征，再結(jié)合分子生物學(xué)手段和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，對(duì)其進(jìn)行分類、鑒定，以探究南昌市雞蛔蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。雞蛔蟲南昌分離株與不同國(guó)家/地區(qū)雞蛔蟲分離株高度同源，可能通過種雞引進(jìn)等方式由安徽、湖南等地區(qū)流入；與鴿蛔蟲親緣關(guān)系最近，說明它們可能有相同的起源，在種系發(fā)育進(jìn)程中具有一定的一致性；同時(shí)，與鵝蛔蟲親緣關(guān)系相對(duì)較近且具有一定的差異性，表明其在種內(nèi)發(fā)育過程中產(chǎn)生一定的變異；與其他種類蛔蟲及線蟲同源性很低，進(jìn)一步說明其種間差異明顯。基因不僅是雞蛔蟲種間鑒定的理想標(biāo)記基因，同時(shí)也是研究雞蛔蟲進(jìn)化發(fā)育關(guān)系的理想標(biāo)記基因。研究結(jié)果為雞蛔蟲的分類、鑒定，分子遺傳學(xué)研究以及防控奠定了理論基礎(chǔ)。

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Morphological and Molecular Characteristics ofin Nanchang City

HONG Zhaowei, HAN Ruyi, WANG Pei, Du Zicheng, CHEN Xiaoqing*

（School of Animal Science and Technology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China）

The study aimed to reveal the phylogenetic relationship betweenisolated from Nanchang City and otherby analyzing their morphological and molecular biological characteristics.Themorphological characteristics ofwere observed and recorded, and then DNA of each sample was extracted, through PCR,gene was amplified and sequenced so as to obtain the sequences. All sequences were blasted in GenBank, and then homology and phylogenetic analysis ofgene were performed for all samples.A. gallis were pale yellow with three lips on the head and a nerve ring near the head. The male tail curved towards the abdomen, while the female tail pointed straight.gene sequences ofwere almost 1 000 bp, which was highly homologous toisolated from Anhui Province (MN158368), Hunan Province (OM876368), and Polish (KY789470). Also, it is highly homologous with(JQ995321), and relatively highly homologous with(KC905082). All the sequences ofin this study were clustered with the sequences ofandfrom other countries or regions. They were most closely related to thefrom other countries or regions and were relatively close with the. The large branches formed by, andwere sister groups to each other, with independent evolutionary branches and relatively close affinities.The sequences ofisolated from Nanchang City were highly homologous and closely related to other sequences ofisolated from Poland and Anhui /Hunan Provinces, indicating that they may have the same origin, and also showing thatisolated from Nanchang was probably imported from Anhui and Hunan Provinces. Also, the homology with thewas relatively high. Still, there was some difference, which indicated that some variations in the interspecificgene, which is a good marker gene to analyze the interspecific developmental relationship in Ascaris species. The analysis of morphological and molecular characteristics ofcould lay a theoretical foundation for the identification and prevention and control of.

; morphological characteristics;gene; phylogenetic analysis; Nanchang City

S855.9

A

2095-3704（2022）02-247-07

洪照微, 韓如意, 王沛, 等. 南昌市雞蛔蟲形態(tài)學(xué)與分子特征分析[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2022, 45(2): 247-253.

10.3969/j.issn.2095-3704.2022.02.43

2022-05-18

2020-06-10

江西省自然科學(xué)基金管理科學(xué)類項(xiàng)目：科技特派員“千百萬”幫扶行動(dòng)體制機(jī)制研究（20212BAA10005）和江西省教育廳科技創(chuàng)新項(xiàng)目（GJJ180185）

洪照微（2001—），女，本科生，主要從事動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究，h554526@163.com；*通信作者，陳小慶，講師，博士，chenxiaoqing2013jl@163.com。