晏 英，王 丹，張 雄，彭明友，鄢小燕，徐 冉，李 毅，楊小生

(1.貴州醫(yī)科大學 藥學院/貴州省化學合成藥物研發(fā)利用工程技術研究中心，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學 醫(yī)藥衛(wèi)生管理學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州醫(yī)科大學 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550014)

糖尿病是由胰島素分泌不足引起的一種以高血糖為特征的代謝性疾病，與惡性腫瘤、心血管疾病并稱世界三大疾病。近年來，隨著環(huán)境污染加重、生活方式的改變、人口老齡化加劇等因素導致糖尿病日益惡化，患病人數(shù)呈指數(shù)增長，且呈現(xiàn)年輕化趨勢。

α-葡萄糖苷酶的主要作用是將碳水化合物分解成葡萄糖，α-葡萄糖苷酶抑制劑可以有效阻斷該過程，以此達到控制餐后血糖，有效降低餐后血糖的峰值，是2型糖尿病的有效治療方案之一。α-葡萄糖苷酶抑制劑安全性高，是少數(shù)能干預糖耐量受損的口服降糖藥之一，在2型糖尿病治療中具有明顯優(yōu)勢。目前，臨床上常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑有阿卡波糖、米格列醇及伏格列波糖等，但常常會引起嚴重的腸道副作用而限制使用。我國在中藥治療糖尿病方面歷史悠久，大量文獻報道多種天然活性成分表現(xiàn)出良好的對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，如皂苷、黃酮、多糖、生物堿等，這些天然來源成分的α-葡萄糖苷酶抑制劑將成為研究與治療2型糖尿病的潛在資源。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用墊狀卷柏采自貴州省貴陽市藥用植物園，夏枯草采自貴州省龍里縣，由貴州中醫(yī)藥大學陳德媛教授分別鑒定為墊狀卷柏()和夏枯草()，標本保存于貴州醫(yī)科大學藥學實驗室。α-葡萄糖苷酶對照品(SLBX6245，100UN，美國Sigma公司)、阿卡波糖對照品(J1824027，阿拉丁試劑有限公司)、4-硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(pNPG，E1828029，阿拉丁試劑有限公司、其余試劑均為國產(chǎn)分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)、HP8345紫外分光光度儀(美國惠普公司)、MR-96A多功能酶標儀(瑞士TECAN 有限公司)、KQ-100B型超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)、BSA224S型電子天平(德國賽多利斯公司)、SQP型十萬分之一電子天平(德國賽多利斯公司)、101型電熱鼓風干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)、HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市天瑞儀器有限公司)。

1.3 方法

..墊狀卷柏提取物制備

干燥墊狀卷柏藥材500 g，粉碎，用5倍量95%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮得到95%乙醇浸膏21.8 g，加適量水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到石油醚萃取物0.12 g，乙酸乙酯萃取物2.1 g，水層17.9 g，另取干燥墊狀卷柏藥材粉末500 g，用水煎煮2次，每次1 h，得到的墊狀卷柏藥渣再用5倍量95%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮得到95%乙醇浸膏17.1 g，加適量水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到石油醚萃取物0.1 g，乙酸乙酯萃取物1.9 g，水層14.3 g。將卷柏各提取物用DMSO溶解，配制成濃度為10 g/L的溶液備用。

..夏枯草提取物制備

干燥夏枯草藥材粉末500 g，粉碎，用水煎煮2次，每次1 h，藥液合并過大孔樹脂柱層析，先用水洗脫得到水層，再用70%乙醇洗脫得到70%乙醇洗脫物，水煎煮后得到的夏枯草藥渣再用5倍量70%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮得到70%乙醇浸膏23.6 g，加適量水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到石油醚萃取物0.14 g，乙酸乙酯萃取物2.5 g，水層19.2 g。將夏枯草各提取物用DMSO溶解，配制成濃度為10 g/L的溶液備用。

..α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

先后迎接全國人大執(zhí)法檢查組、國家食品藥品監(jiān)管總局等國家、省、市有關部門各級領導蒞臨檢查指導62次，食品藥品監(jiān)管工作受到各界一致肯定，實現(xiàn)了食品藥品安全“零事故”—西安市未央?yún)^(qū)食品藥品監(jiān)督管理局取得的這一成績無疑使人振奮。近年來，該局始終堅持以習近平總書記指示的“四個最嚴”要求為綱領，凝心聚力，真抓實干，依法行政，科學監(jiān)管，切實提升食品藥品安全監(jiān)管能力。2016年5月，未央?yún)^(qū)被省政府授予“省級食品安全示范區(qū)”榮譽稱號；區(qū)食品藥品監(jiān)管局榮獲了市、區(qū)目標責任考核及政風行風建設優(yōu)秀單位稱號，局黨支部被區(qū)委授予“先進基層黨組織”。

建立pNPG的體外評價模型進行活性測試。將墊狀卷柏和夏枯草提取物配制成不同濃度的樣品溶液，試驗分為空白組、空白對照組、樣品組、樣品空白組。空白組在96孔板中加PBS溶液10 μL，空白對照組在96孔板中加DMSO代替樣液10 μL，樣品組、樣品空白組在96孔板中加DMSO溶解的樣液10 μL，每組3復孔，分別加入60 μL 0.1 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 6.8)，空白對照組和樣品空白組加入10 μL 0.1 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 6.8)，其他各組加入10 μL α-葡萄糖苷酶磷酸緩沖溶液(2 U/mL)，在恒溫振蕩器中37 ℃保溫15 min后取出，隨即加入20 μL 5 mmol/L pNPG溶液，充分混勻，于37 ℃孵育20 min，結(jié)束后加入50 μL 0.1 mol/L的NaCO終止反應。以阿卡波糖為陽性對照，在405 nm處測定吸光值，酶抑制率I % = [(A-A)-(A-A) / A-A]×100(A1：空白組吸光值，A2：空白對照組吸光值，A3：樣品組吸光值，A4：樣品空白組吸光值)，計算出各樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率，求出相應的IC值。

..墊狀卷柏和夏枯草高活性部位的確定

將墊狀卷柏、夏枯草的各提取物及陽性對照物阿卡波糖配制成不同質(zhì)量濃度的樣品液，按照“..”方法分別測定不同濃度墊狀卷柏和夏枯草各提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制活性最高的提取物為α-葡萄糖苷酶抑制活性的高活性部位。

..α-葡萄糖苷酶抑制的抑制動力學分析

按照“..”方法分別測定不同濃度墊狀卷柏和夏枯草高活性部位與酶濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 U/mL時反應的初速度，底物最終濃度為0.5 mmol/L，每個濃度重復三次，以酶濃度E(U/mL)為橫坐標，反應初速度(ΔOD/min)為縱坐標作圖，利用圖的特征推斷酶的結(jié)合方式。墊狀卷柏和夏枯草高活性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制類型由Linewaver-Burk方法確定。配制不同濃度的墊狀卷柏和夏枯草高活性部位，分別與濃度為4.0、5.0、6.0、8.0、10.0 mmol/L的底物溶液，混勻，加入0.8 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液，測定α-葡萄糖苷酶抑制的反應速率。以底物濃度的倒數(shù)1/[]為橫坐標，1/為縱坐標進行Lineweave-Burk雙倒數(shù)作圖分析。以直線的斜率和對軸的截距分別對墊狀卷柏和夏枯草高活性部位濃度二次作圖，分別求出墊狀卷柏和夏枯草高活性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制常數(shù)()和對酶—底物絡合物抑制常數(shù)()，由此判斷酶的抑制類型。

..墊狀卷柏和夏枯草高活性部位的組合效應

根據(jù)兩種藥物的組合原則，在墊狀卷柏和夏枯草高活性部位稱樣量恒定的前提下，確定7種不同的組合方式，如表1所示。采用“..α-葡萄糖苷酶抑制活性測定”的方法，對墊狀卷柏和夏枯草高活性部位的組合方式測定抑制活性，并計算IC值。采用抑制濃度的分數(shù)之和值(SFIC)及等效劑量分析方法評價聯(lián)合用藥的作用性質(zhì)。抑制濃度的分數(shù)之和(SFIC)按以下公式計算：SFIC=一個藥物聯(lián)用時的IC值/這個藥物單用時的IC值+另一藥物聯(lián)用時的IC值/另一藥物單用時的IC值。當SFIC值小于、大于或者是等于1.0，則分別被認為兩者聯(lián)用時具有增效﹑拮抗和相加作用。另外得到相應的等效劑量分析圖，如果折線圖呈現(xiàn)凹形或凸型則認為聯(lián)用時兩藥物相互作用的本質(zhì)為增效或拮抗作用。

表1 JYC與XXT的配比組合Tab.1 The ratio of JYC and XXT

2 結(jié)果與分析

2.1 墊狀卷柏各提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

墊狀卷柏各提取物對α-葡萄糖苷酶抑制作用結(jié)果見表2。試驗結(jié)果表明，除了墊狀卷柏水提物及其過大孔樹脂后水洗脫部分外，阿卡波糖和墊狀卷柏各提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性均呈現(xiàn)隨著劑量升高而增強的趨勢。其中墊狀卷柏植物水提后95%醇提物的乙酸乙酯萃取物，墊狀卷柏植物95%醇提物的乙酸乙酯萃取物的抑制作用明顯強于陽性藥阿卡波糖，且墊狀卷柏植物95%醇提物的乙酸乙酯萃取物JYC的抑制作用最強，為墊狀卷柏高活性部位。

表2 墊狀卷柏提取物的α-葡萄糖苷酶活性篩選結(jié)果Tab.2 The α-glucosidase inhibition activity of extracts from Selaginella tamariscina

2.2 夏枯草各提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

夏枯草各提取物對α-葡萄糖苷酶抑制作用結(jié)果見表3。試驗結(jié)果表明，夏枯草水提物的大孔樹脂70%乙醇洗脫物，夏枯草水提后70%醇提物，夏枯草水提后70%乙醇提取物得乙酸乙酯萃取物的抑制作用明顯強于陽性藥阿卡波糖，且夏枯草水提物的大孔樹脂70%乙醇洗脫物XXT的抑制作用最強，為夏枯草的高活性部位。

表3 夏枯草粗提物部分的α-葡萄糖苷酶活性篩選結(jié)果Tab.3 Theα-glucosidase inhibition activity of extracts from Prunella vulgaris Linn

2.3 墊狀卷柏和夏枯草高活性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制機制分析

不同濃度的高活性部位，改變酶的濃度，通過酶活力對不同濃度的酶作圖得到一組直線，如圖1和圖2。所有的直線均呈線性關系，且經(jīng)過原點。另外，隨著提取物濃度的增加，直線的斜率在減小，說明墊狀卷柏和夏枯草高活性部位濃度，沒有改變酶的數(shù)量，而是降低了酶的活性。因此，墊狀卷柏和夏枯草高活性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制作用是可逆的。

圖1 墊狀卷柏高活性部位酶濃度與反應初速率圖Fig.1 Relationship between enzyme concentration and initial reaction velocity of the most effective part from Selaginella pulvinata

圖2 夏枯草高活性部位酶濃度與反應初速率圖Fig.2 Relationship between enzyme concentration and initial reaction velocity of the most effective part from Prunella vulgaris

2.4 墊狀卷柏和夏枯草高活性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學研究

采用酶動力學方法探討墊狀卷柏和夏枯草高活性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制機制。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒曲線作圖法，分別作出阿卡波糖、墊狀卷柏和夏枯草高活性部位的抑制動力學曲線，確定抑制類型和抑制常數(shù)。如圖3、圖4和圖5所示，分析發(fā)現(xiàn)，阿卡波糖所有直線與Y軸相交于一點，說明阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶屬于競爭性抑制。墊狀卷柏和夏枯草高活性部位的Lineweaver-Burk 曲線均為一組相交于第二象限的直線，隨著體系中墊狀卷柏和夏枯草高活性部位濃度增大，減小，米氏常數(shù)()增大，表現(xiàn)為混合I型競爭抑制。結(jié)果表明，墊狀卷柏和夏枯草高活性部位同時與結(jié)合酶(ES)及游離酶(E)結(jié)合，且抑制常數(shù)>。以雙倒數(shù)直線的斜率和截距分別對墊狀卷柏和夏枯草高活性部位濃度作圖(圖4b、4c、5b、5c)，均為直線，分別求得墊狀卷柏高活性部位的=0.022 μg/mL，=0.040 μg/mL，夏枯草高活性部位的=0.010 μg/mL，=0.017 μg/mL。競爭性抑制作用強于反競爭性抑制作用，墊狀卷柏和夏枯草高活性部位對游離酶的抑制作用強于其對酶—底物復合物的抑制作用。

圖3 阿卡波糖Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.3 Lineweaver-Burk plot of acarbose

注：a為曲線中墊狀卷柏高活性部位濃度圖；b為斜率對樣液濃度作圖；c為截距對樣液濃度作圖。圖4 Lineweaver-Burk圖法測定墊狀卷柏高活性部位抑制α-葡萄糖苷酶的機制Fig.4 Lineweaver-Burk plot for the determination of the inhibitory mechanism of the most effective part from Selaginella pulvinate on α-glucosidase

注：a為夏枯草高活性部位濃度圖；b為斜率對樣液濃度作圖；c為截距對樣液濃度作圖。圖5 Lineweaver-Burk圖法測定夏枯草高活性部位抑制α-葡萄糖苷酶的機制Fig.5 Lineweaver-Burk plot for the determination of the inhibitory mechanism of the most effective part from Prunella vulgaris on α-glucosidase

2.5 墊狀卷柏和夏枯草高活性部位的組合效應

..JYC與XXT配比組合的α-葡萄糖苷酶的抑制活性

將JYC與XXT 7種配比組合分別配制成不同質(zhì)量濃度的樣品液，陽性對照品阿卡波糖制備成質(zhì)量濃度分別為10、1、0.1 μmol/mL。JYC與XXT7種配比組合和阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性及IC值見表4，結(jié)果顯示，JYC與XXT的7種配比組合的α-葡萄糖苷酶抑制活性均明顯強于陽性對照阿卡波糖，當JYC與XXT按1∶3組合時，α-葡萄糖苷酶抑制活性最高，為最佳組合。

表4 JYC與XXT的抑制活性篩選結(jié)果Tab.4 The α-glucosidase inhibition activity of JYC and XXT

..JYC與 XXT組合效應的計算

JYC與XXT配比組合的SFIC和和FIC值(藥物聯(lián)用時的IC值/這個藥物單用時的IC值)，見表5，結(jié)果顯示，當JYC與XXT配比為5∶1、3∶1、1∶1時，各組SFIC值均小于1.0，兩者具有協(xié)同增效的α-葡萄糖苷酶抑制活性，當JYC與XXT配比為1∶3、1∶5時，各組SFIC值約等于1.0，兩者具有協(xié)同相加的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

表5 JYC與XXT的組合計算結(jié)果Tab.5 The result of combination between JYC and XXT

用JYC的FIC值(聯(lián)用時的IC值/單用時的IC值)對應圖中橫坐標值，同時用XXT的FIC值對應圖中縱坐標值作折線圖，得出的等效劑量分析圖呈現(xiàn)凹形(圖6)，說明JYC和XXT聯(lián)用時的相互作用本質(zhì)為增效作用。

圖6 JYC與XXT對α-葡萄糖苷酶抑制作用等效劑量分系圖Fig.6 Isobolograms of inhibition interaction between JYC and XXT against α-glucosidase

3 結(jié)論與討論

通過體外α-葡萄糖苷酶活性篩選的方法，得到墊狀卷柏和夏枯草不同提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中墊狀卷柏植物95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物和夏枯草水提物的大孔樹脂70%乙醇洗脫物的抑制作用最強，分別為墊狀卷柏和夏枯草的高活性部位，IC值分別為8.17 μg/mL和2.05 μg/mL，均遠低于陽性對照阿卡波糖。說明兩者具有較強的抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線作圖法探討墊狀卷柏和夏枯草高活性部位對α-葡萄糖苷酶的競爭抑制作用類型，結(jié)果表明，隨著墊狀卷柏和夏枯草高活性部位濃度的增加，減小，米氏常數(shù)()增大，表現(xiàn)為混合I型競爭抑制。說明墊狀卷柏和夏枯草高活性部位同時與結(jié)合酶(ES)及游離酶(E)結(jié)合，且抑制常數(shù)>。競爭性抑制作用強于反競爭性抑制作用，墊狀卷柏和夏枯草高活性部位對游離酶的抑制作用強于其對酶—底物復合物的抑制作用。該結(jié)論與黃曉冬等研究海藻鐵釘菜對α-葡萄糖苷酶抑制類型相一致。墊狀卷柏和夏枯草可作為篩選有效降糖藥物的研究對象，有望從中分離得到安全有效的天然來源α-葡萄糖苷酶抑制劑。

墊狀卷柏和夏枯草高活性部位聯(lián)用時的SFIC值小于或等于1.0，得到的等效劑量分析圖呈凹形，表明兩者聯(lián)用時抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用大于兩種提取物作用的簡單疊加，具有協(xié)同增效作用。首次發(fā)現(xiàn)當墊狀卷柏和夏枯草高活性部位按1∶3組合時，α-葡萄糖苷酶抑制活性最高，為最佳組合。不同藥用植物提取物活性部位聯(lián)合用藥為糖尿病的預防或治療提供新的思路。