張?zhí)?，喬樂天，劉源，馬亞麗，王志遠(yuǎn)

（1.信陽市第五人民醫(yī)院藥學(xué)部，河南 信陽 464000；2.商丘市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，河南 商丘 476100；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046）

含量測定是中藥復(fù)方制劑質(zhì)量控制的核心，由于中藥成分繁雜、有效成分不明了、所含成分含量較低、含量測定指標(biāo)選擇困難、干擾成分較多，僅靠一到兩個成分的檢測指標(biāo)有一定的局限性，因而多指標(biāo)綜合評價模式仍是中藥質(zhì)量評價的主要研究方向。化學(xué)模式識別[1]主要包括主成分分析（PCA）、聚類分析（CA）、判別分析和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，是利用現(xiàn)代化分析技術(shù)分析中藥復(fù)雜化學(xué)數(shù)據(jù)，再用化學(xué)計量學(xué)方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行特征提取和處理分析。PCA和CA在中藥評價中應(yīng)用越來越多，PCA原理是通過某種高維到低維的模式變換對多變量數(shù)據(jù)分析處理，以達(dá)到對原始數(shù)據(jù)最大程度的保留；CA是對未知分類樣本在模式空間中尋找相互關(guān)聯(lián)的部分，根據(jù)相似度完成歸類，它和PCA都是模式識別中的常用數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法，兩者相輔相成。偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）是建立在偏最小二乘法（PLS）基礎(chǔ)上的一種監(jiān)督模式識別方法，分析結(jié)果直觀、清晰，具有較高的預(yù)測精度，已在中藥質(zhì)量評價和控制中廣泛運用[2]。

白百抗癆顆粒由白及、百部、浙貝母、薏苡仁、三七和紅大戟6味藥組成，具有斂肺止咳、養(yǎng)陰清熱之功效，臨床上用于肺癆引起的咳嗽、痰中帶血[3]，肺結(jié)核伴咳血患者應(yīng)用白百抗癆顆粒治療可有效促進(jìn)其病灶吸收，縮短其臨床癥狀改善時間，且不會增加不良反應(yīng)，安全性較高[4]。白百抗癆顆粒由6味中藥材按現(xiàn)代工藝加工而成，所含成分繁多，作用靶點較多，白百抗癆顆粒暫未收錄于中國藥典，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS-10894（ZD-0894）-2002僅以人參皂苷Rg1為指標(biāo)進(jìn)行了含量測定，未檢索到與檢驗分析相關(guān)的文獻(xiàn)。因此，建立一個科學(xué)、便捷、合理的質(zhì)量評價方法，對白百抗癆顆粒的質(zhì)量進(jìn)行全面準(zhǔn)確地評價具有重要的現(xiàn)實意義。本實驗以君藥白及和百部，臣藥三七，佐藥紅大戟為研究對象，分析這四個藥材中所含的主要活性成分或代表性成分，收集共12批產(chǎn)品，采用HPLC法同步測定白百抗癆顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、3-羥基巴戟醌、蘆西定、貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、氧化對葉百部堿、二脫氫對葉百部堿含量，首次通過多成分定量控制聯(lián)合CA、PCA及PLS-DA法對其進(jìn)行綜合質(zhì)量評價，以期為白百抗癆顆粒的整體質(zhì)量控制提供科學(xué)實驗數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

對照品3-羥基巴戟醌（批號111962-202102，含量97.2%）、蘆西定（批號111960-201301，含量97.2%）、三七皂苷R1（批號110745-201921，含量90.4%）、人參皂苷Rg1（批號110703-202034，含量94.0%）、人參皂苷Rb1（批號110704-202230，含量95.1%）源于中國食品藥品檢定研究院；貝母蘭寧（批號CFS201801，含量98.0%）、山藥素Ⅲ（批號CFN92689，含量95.0%）源于武漢天植生物技術(shù)有限公司；氧化對葉百部堿（批號CFS201701，含量98.0%）源于武漢天植生物技術(shù)有限公司；二去氫對葉百部堿（批號106861-40-9，含量98.0%）源于上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；乙腈和磷酸為色譜純級別，其余試劑為分析純；白百抗癆顆粒（批號210501、210503、210702、210801、210802、210804、191102、191103、191104、200603、200604、200607，編號S1-S12，規(guī)格：每袋裝15 g，購于通化衛(wèi)京藥業(yè)股份有限公司）。

1.2 儀器

Shimadzu LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SQP型電子分析天平（德國賽多利斯公司），HU10300/40B型超聲波清洗儀（上海楚定分析儀器有限公司，頻率40 kHz，功率300 W）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Gemini-NX C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）色譜柱，柱溫30℃；檢測波長：0～22 min為203 nm（檢測三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1）[5-12]，22～42 min為280 nm（檢測3-羥基巴戟醌、蘆西定、貝母蘭寧和山藥素Ⅲ）[13-17]，42～65 min為237 nm（檢測氧化對葉百部堿和二脫氫對葉百部堿）[18-21]；流動相選用乙腈（A）-0.5%磷酸（B），流速維持1.0 mL/min進(jìn) 行 梯 度 洗 脫（0～11 min，15.0%A；11～22 min，15.0%→24.0%A；22～42 min，24.0%→48.0%A；42～52 min，48.0%→55.0%A；52～65 min，55.0%→15.0%A），進(jìn)樣量10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、3-羥基巴戟醌、蘆西定、貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、氧化對葉百部堿、二脫氫對葉百部堿對照品適量，用70%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.512、0.430、0.384、0.096、0.074、0.580、1.134、0.658、0.492 mg/mL的混合對照品儲備液，再將儲備液用70%甲醇稀釋20倍得混合對照品溶液（上述9種對照品質(zhì)量濃度分別為75.60、21.50、19.20、4.80、3.70、29.00、56.70、32.90、24.60 μg/mL）。

2.2.2 供試品溶液的制備取白百抗癆顆粒，精密稱定2.0 g，置25 mL量瓶中，加70%甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，70%甲醇定容，搖勻，過濾，即得。因待測成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1為三七藥效成分，3-羥基巴戟醌和蘆西定為紅大戟特征成分，貝母蘭寧和山藥素Ⅲ為白及主要成分，氧化對葉百部堿和二脫氫對葉百部堿為百部代表性成分，故按照白百抗癆顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS-10894（ZD-0894）-2002中的處方比例，分別稱取缺三七的其他藥味、缺紅大戟的其他藥味、缺白及的其他藥味，缺百部的其他藥味，按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的制法分別制成缺三七陰性供試品、缺紅大戟陰性供試品、缺白及陰性供試品、缺百部陰性供試品，再按照上述方法分別制得4種陰性供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗取混合對照品溶液及供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣檢測，記錄色譜曲線圖（圖1）。圖譜顯示白百抗癆顆粒供試品溶液中9種成分與相鄰色譜峰分離良好（分離度均≥1.5），供試品溶液的色譜圖中，在與對照品溶液色譜圖相應(yīng)保留時間處有相同的色譜峰；理論板數(shù)按各成分計均不低于6 500。

圖1 混合對照品（A）、白百抗癆顆粒（B）、缺三七陰性樣品（C）、缺紅大戟參陰性樣品（D）、缺白及陰性樣品（E）和缺百部陰性樣品（F）的HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances（A），Baibaikanglao granules（B），sample without Notoginseng Radix et Rhizoma（C），sample without Knoxiae Radix（D），sample without Bletillae Rhizoma（E），and sample without Stemonae Radix（F）

2.3.2 線性關(guān)系考察取2.2.1項下混合對照品儲備液，精密吸取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、2.5 mL，分別用70%甲醇定容至20 mL，搖勻制得系列線性工作溶液，按“2.1”項色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄色譜曲線圖，以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、3-羥基巴戟醌、蘆西定、貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、氧化對葉百部堿、二脫氫對葉百部堿對照品質(zhì)量濃度為橫軸（X，μg/mL），峰面積為縱軸（Y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 白百抗癆顆粒中各成分的線性關(guān)系Table 1 Linear regression relationships of the constituents in Baibaikanglao granules

2.3.3 精密度試驗取白百抗癆顆粒（編號：S1）一份供試品溶液，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、3-羥基巴戟醌、蘆西定、貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、氧化對葉百部堿、二脫氫對葉百部堿色譜曲線及峰面積，得峰面積的RSD值依次為0.56%、1.16%、1.38%、1.65%、1.51%、1.13%、0.69%、1.02%和0.90%，表明精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗取一份白百抗癆顆粒（編號：S1）供試品溶液，于制備后0、2、4、6、10、16、24 h進(jìn)樣，記錄三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、3-羥基巴戟醌、蘆西定、貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、氧化對葉百部堿、二脫氫對葉百部堿色譜曲線及峰面積，得峰面積的RSD值依次為0.53%、1.13%、1.43%、1.62%、1.49%、1.16%、0.67%、1.06%和1.02%，表明白百抗癆顆粒供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗取一份白百抗癆顆粒（編號：S1）適量，按“2.2.2項”下方法制備白百抗癆顆粒供試品溶液6份，在上述色譜條件下檢測分析，記錄色譜曲線及峰面積，用外標(biāo)法計算三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、3-羥基巴戟醌、蘆西定、貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、氧化對葉百部堿、二脫氫對葉百部堿的含量，結(jié)果各成分的平均含量分別為1.131 、0.310、0.278、0.073、0.044、0.436、0.952、0.531、0.362 mg/g，RSD依次為0.97%、1.49%、1.64%、1.77%、1.89%、1.56%、1.01%、1.29%和1.38%，表明重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗取已知各成分含量的白百抗癆顆粒（編號：S1），按照各成分含量精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、3-羥基巴戟醌、蘆西定、貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、氧化對葉百部堿、二脫氫對葉百部堿對照品各適量，用70%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.135、0.309、0.271、0.074、0.039、0.434、0.952、0.531、0.354 mg/mL的加樣混合對照品溶液。精密稱取白百抗癆顆粒1.0 g，共9份，分別精密加入上述加樣混合對照品溶液0.8、1.0、1.2 mL各3份，再按“2.2.2”項方法制得加樣供試品溶液，在上述色譜條件下檢測，得9種成分的平均加樣回收率分別為100.03%、98.58%、97.66%、97.05%、96.95%、99.86%、100.15%、99.24%和99.54%，RSD分別為0.72%、1.01%、1.24%、1.52%、1.18%、0.63%、0.80%、0.95%和1.52%。

2.4 含量測定

取白百抗癆顆粒12批（編號：S1～S12），按照“2.2.2”項下方法制備白百抗癆顆粒供試品溶液，再依法進(jìn)樣分析，應(yīng)用外標(biāo)法（ESM法）計算白百抗癆顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、3-羥基巴戟醌、蘆西定、貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、氧化對葉百部堿、二脫氫對葉百部堿的含量（表2），并計算12批次間各成分含量的RSD值。結(jié)果顯示各待測成分均存在一定的批間差異，表明建立白百抗癆顆粒多指標(biāo)成分控制模式對穩(wěn)定其整體質(zhì)量具有重要意義。

3 白百抗癆顆粒的化學(xué)計量學(xué)質(zhì)量評價

3.1 數(shù)據(jù)歸一化處理

對表2中12批白百抗癆顆粒三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、3-羥基巴戟醌、蘆西定、貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、氧化對葉百部堿、二脫氫對葉百部堿的含量檢測結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化處理（表3）。

表2 含量測定結(jié)果Table 2 Results of content determination（n=3） w/（mg·g-1）

3.2 聚類分析（cluster analysis，CA）

將表3中白百抗癆顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、3-羥基巴戟醌、蘆西定、貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、氧化對葉百部堿、二脫氫對葉百部堿含量歸一化后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 26.0軟件，采用平均聯(lián)接法，以Euclidean距離為測度，運行系統(tǒng)聚類程序進(jìn)行CA，得圖2。結(jié)果顯示，當(dāng)類間距離為10時，12批白百抗癆顆粒聚為3類，S4、S5、S6、S3、S2和S1聚為第Ⅰ類，S8、S9和S7聚為第Ⅱ類，S10、S11和S12聚為第Ⅲ類。

圖2 12批樣品CA圖Figure 2 Dendrogram for CA for 12 batches of samples

表3 各成分歸一化處理結(jié)果Table 3 Results of normalization treatment for each component

3.3 主成分分析（principal component analysis，PCA）

將表3中含量歸一化后數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行降維分析，得各主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率（表4）及成分矩陣表（表5）。由表4可知前2個主成分特征值為6.529和1.618（均大于1），對方差的貢獻(xiàn)率分別為72.547%和17.980%，累計方差貢獻(xiàn)率為90.527%（大于85%），表明選取前2個主成分即可代表白百抗癆顆粒90.527%的信息量。表5主成分矩陣可以看出第一主成分的信息來自三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、蘆西定、貝母蘭寧、山藥素Ⅲ和二脫氫對葉百部堿，第二主成分的信息來自3-羥基巴戟醌和氧化對葉百部堿。同時應(yīng)用多元變量統(tǒng)計軟件SIMCA 14.1建立PCA模型得PCA得分圖（圖3），共提取出2個主成分R2X為0.905，大于0.5，所建立的模型穩(wěn)定性較高，進(jìn)一步說明2個主成分可以代表白百抗癆顆粒的整體質(zhì)量情況。從圖3可以看出，S1～S6、S7～S9以及S10～S12分別呈現(xiàn)一定關(guān)聯(lián)性。為進(jìn)一步分析引起質(zhì)量差異的主要成分，進(jìn)行了PLS-DA。

圖3 PCA得分圖Figure 3 Score plot of PCA

表4 白百抗癆顆粒中主成分方差分析Table 4 Principal component analysis of variance in Baibaikanglao granules

表5 白百抗癆顆粒中9種成分的成分矩陣表Table 5 Composition matrix of 9 ingredients in Baibaikanglao granules

3.4 偏最小二乘法-判別分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）

偏最小二乘法-判別分析通過對數(shù)據(jù)的分析，能夠查找出引起產(chǎn)品質(zhì)量差異的特征成分，將各成分含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1統(tǒng)計軟件，運行PLS-DA程序，得圖4，結(jié)果累積解釋能力參數(shù)（R2X、R2Y）分別為0.905和0.901（大于0.5），預(yù)測能力參數(shù)Q2為0.816，所建立的模型穩(wěn)定可靠、預(yù)測能力強，3組樣品聚類良好，分離更加顯著，與CA、PCA結(jié)果一致。

圖4 12批白百抗癆顆粒樣品的PLS-DA模型得分圖Figure 4 Score plot of PLS-DA of 12 batches of BaibaiKanglao granules samples

對建立的PLS-DA模型進(jìn)行200次置換檢驗，結(jié)果顯示R2擬合直線Y軸截距為0.156，小于0.3，表明所建立的PLS-DA模型結(jié)果可靠；Q2擬合直線Y軸截距為-0.237（小于0），表明所構(gòu)建的PLS-DA模型不存在過度擬合，預(yù)測能力好，可有效判別分析12批白百抗癆顆粒的質(zhì)量差異（圖5）。結(jié)合變量重要性投影（VIP）法篩選影響白百抗癆顆粒化學(xué)成分差異的標(biāo)志性成分（圖6），以VIP＞1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選到3個成分具有統(tǒng)計學(xué)意義，即成分8（氧化對葉百部堿，VIP=1.889）＞成分1（三七皂苷R1，VIP=1.167）＞成分7（山藥素Ⅲ，VIP=1.097），可能是影響白百抗癆顆粒產(chǎn)品質(zhì)量的主要潛在標(biāo)志物。

圖5 PLS-DA置換檢測結(jié)果圖Figure 5 Permutation plot of PLS-DA

圖6 12批白百抗癆顆粒樣品的VIP圖Figure 6 VIP values of samples of 12 batches of BaibaiKanglao granules samples

4 討論

4.1 流動相的優(yōu)化篩選

本試驗在篩選流動相時，首先采用乙腈-水梯度洗脫，結(jié)果基線嚴(yán)重漂移，色譜峰不能正常積分，遂加入酸類加以調(diào)節(jié)，試驗中比較了加入磷酸、冰醋酸以及甲酸的分離效果，最后發(fā)現(xiàn)乙腈-0.5%磷酸效果最佳，達(dá)到基線分離且峰形較好，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、3-羥基巴戟醌、蘆西定、貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、氧化對葉百部堿、二脫氫對葉百部堿響應(yīng)值最高，最終采用乙腈-0.5%磷酸作為流動相進(jìn)行檢測。

4.2 供試品溶液制備

本試驗在考察供試品溶液制備方式時，首先采用不同濃度的甲醇和乙醇為提取溶劑，對比超聲和加熱回流提取方式，結(jié)果70%甲醇超聲提取30 min時，9種成分的提取率最高，雜質(zhì)干擾最少，方法簡單實用，有良好的重現(xiàn)性。

4.3 化學(xué)計量學(xué)結(jié)果評價

化學(xué)計量學(xué)是集數(shù)學(xué)、統(tǒng)計學(xué)、計算機(jī)科學(xué)等學(xué)科于一身，通過解析實驗檢測數(shù)據(jù)，發(fā)掘眾多變量復(fù)雜數(shù)據(jù)中存在的互相內(nèi)在關(guān)系，無監(jiān)督統(tǒng)計方法的CA、PCA、非線性映射等及有監(jiān)督統(tǒng)計方法的PLS、PLS-DA、OPLS-DA等近年來越來越多地應(yīng)用于中藥及其制劑的研究中。CA根據(jù)同類樣品的相似度大在多維空間中距離較小的原理，對未知樣本進(jìn)行分類。本試驗對12批白百抗癆顆粒含量測定的數(shù)據(jù)歸一化后進(jìn)行CA，結(jié)果當(dāng)間距為10時12批樣品聚為3類，說明白百抗癆顆粒具有明顯分類趨勢，S1～S6聚為一類；S7～S9聚為一類；S10～S12聚為一類。PCA是將具有一定相關(guān)性的變量，通過數(shù)據(jù)降維排除相互重疊的信息，在保存大量信息的同時降低了變量個數(shù)，對成分復(fù)雜的中藥制劑研究具有重要意義。本試驗PCA結(jié)果顯示選取2個主成分即可代表白百抗癆顆粒中9種成分90.527%的信息，具有較好的代表性，同時12批樣品的分類與聚類分析結(jié)果一致。PLS-DA分析通過模式識別發(fā)掘引起產(chǎn)品質(zhì)量差異的特征成分。本試驗在對12批白百抗癆顆粒中9種成分含量檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行PLSDA分析，將PLS-DA模型進(jìn)行200次置換檢驗，結(jié)果顯示所構(gòu)建的PLS-DA模型未過度擬合，預(yù)測能力好，可有效判別分析12批白百抗癆顆粒的質(zhì)量差異，篩選出3個成分（氧化對葉百部堿、三七皂苷R1和山藥素Ⅲ）的VIP值大于1，可能是影響產(chǎn)品質(zhì)量差異的標(biāo)志性化學(xué)成分，同時提示藥企在生產(chǎn)白百抗癆顆粒時，應(yīng)集中關(guān)注這些成分對應(yīng)的中藥材質(zhì)量，從而提高產(chǎn)品質(zhì)量和用藥的有效性。

本試驗采用HPLC多成分定量控制聯(lián)合多維模式識別法對同一廠家不同批次的白百抗癆顆粒進(jìn)行了綜合質(zhì)量評價，建立了白百抗癆顆粒9種指標(biāo)成分定量質(zhì)控模式，建立的方法穩(wěn)定可行，簡單快捷，不僅有助于為其制定更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實驗基礎(chǔ)，也對后期該產(chǎn)品質(zhì)量的提升具有一定的指導(dǎo)意義。