邢 陽 馮立新 徐 穎 王 戈 李芷萱

完美的根管充填材料應(yīng)該能夠?qū)Ω芟到y(tǒng)實現(xiàn)三維空間的、嚴密的充填，同時將根管與其周圍的根尖周組織交通隔斷。AH plus 根管封閉劑具有良好的物理性質(zhì)以及化學性質(zhì)，已作為“金標準”被廣泛應(yīng)用于熱牙膠充填的臨床應(yīng)用中[1]。iRoot SP 根管封閉劑是一種新型的硅酸鹽生物陶瓷類根管封閉劑，無鋁成分，其理化特性與無機三氧化聚合體(Mineral trioxide aggregate，MYA)相似，具有良好的X 線阻射性、生物相容性、抗菌抑菌性，不存在凝固收縮或者膨脹，粘接性及封閉性良好，已受到臨床廣泛的重視[2]，但由于其受熱后可能產(chǎn)生變性，因此目前對于其在高溫狀態(tài)下的根尖封閉性能及抗菌性尚存在爭議[3]。HiFlow 根管封閉劑是一種專門為熱牙膠垂直加壓充填法而設(shè)計的硅酸鈣基類預混合根管封閉劑，其主要化學成分與iRoot SP 根管封閉劑相似，僅粒度分布不同，有研究報道稱其具有良好的生物相容性、生物活性，易于滲透入牙本質(zhì)小管內(nèi)，從而提高其抑菌性能、粘接強度及封閉性能，此外HiFlow 根管封閉劑還具有低收縮性以及X 線阻射性[4]。因此，本實驗選擇AH plus 根管封閉劑與iRoot SP 根管封閉劑兩種經(jīng)典的根管封閉劑與HiFlow 根管封閉劑進行體外抗菌性能的比較，從而對HiFlow 根管封閉劑的體外抗菌性進行評價。

1.材料與方法

1.1 材料及器械 Endo Sequnce RC Sealer Hi Flow 根管封閉劑(Rrasseler USA，美國)；AH Plus根管封閉劑(Dentsply，瑞士)；iRoot SP 根管封閉劑(Innovative RioceramixInc，Vancouver，加拿大)；復合樹脂Z350(3M，美國)；Protaper Universial機用鎳鈦銼(登士柏，瑞士)；熱牙膠充填系統(tǒng)(SybronEndo，美國)；0.06 錐度牙膠尖(北京達雅鼎，中國)；垂直加壓器(SybronEndo，美國)；UV 1800 紫外可見分光光度儀(Shimadzu,日本)；糞腸球菌標準菌株AYCC29212(壇墨質(zhì)檢，中國)。

1.2 方法

1.2.1 直接接觸實驗(direct contact test,DCY)[5]將標準菌糞腸球菌(AYCC29212)制備成濃度為106CFU/ mL 的菌懸液。

取100 個1.5mL 的經(jīng)無菌處理的離心管，按照選擇的根管封閉劑材料的不同，將其共分為5 組，分別為AH Plus 組、iRoot SP 組、Hi Flow 組、陽性對照組、陰性對照組，各組20 個樣本。各組封閉劑的使用均嚴格按照說明書進行，將各組封閉劑分別注入離心管的底部，高度均約1cm，陽性對照組則注入同等高度的凡士林，陰性對照組為無菌空白管。將各組離心管均放置于37℃、相對濕度＞95%的恒溫箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

分別于根管封閉劑應(yīng)用后的20min、1d、7d、14d，每個時間點從各組樣本中取出5 個離心管樣本，各實驗組及陽性對照組的離心管內(nèi)均被注入10μL 的糞腸球菌菌液，陰性對照組內(nèi)加入10μL的無菌去離子水。待各組于37℃厭氧培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24h 后，將各組的所得細菌懸液進行濃度稀釋，將各濃度的菌液分別取50μL 接種于RHI 瓊脂培養(yǎng)基上，置于37℃厭氧培養(yǎng)箱中厭氧下培養(yǎng)24h 后，進行菌落計數(shù)，最終結(jié)果合算成每毫升CFU，計數(shù)結(jié)果取均值。

1.2.2 抑菌環(huán)實驗 取濃度為3×108CFU/ mL的糞腸球菌懸液50μL，以玻璃棒于培養(yǎng)皿上涂開，于37℃厭氧培養(yǎng)箱中厭氧下培養(yǎng)，觀察細菌當達到不完全融合生長時，取出培養(yǎng)皿，在同一培養(yǎng)皿上放置帶有3 個圓形鏤空的濾紙，鏤空直徑均為5mm，鏤空之間保持一定間隔。將3 個鏤空分別標記為A、R、C 三組，分別涂布AH Plus 根管封閉劑、iRoot SP 根管封閉劑、Hi Flow 根管封閉劑，另放置一個直徑5mm 含有蒸餾水的濾紙作為D 組，每組設(shè)置5 個RHI 培養(yǎng)皿。將各組培養(yǎng)皿置于37℃、100%濕度的厭氧培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，分別于1d、3d、7d 時取出培養(yǎng)皿，測量各組的抑菌環(huán)直徑，每組重復測量3 次，結(jié)果取均值記錄。

1.2.3 糞腸球菌感染根管模型實驗(infected root canal model，IRCM)

(1)離體牙的采集與處理：收集因牙周炎或正畸治療需要而拔除的單直根管恒牙140 顆，納入標準：①牙齒發(fā)育形態(tài)正常，牙根完好，根尖孔發(fā)育完全，無齲壞，未經(jīng)過牙髓治療，顯微鏡下觀察未見隱裂及外吸收；②X-ray 片顯示根管均為單根管恒牙，不存在根管內(nèi)吸收；③牙根長度正常，釉牙骨質(zhì)界距離根尖超過11mm；④根管通暢，無鈣化；⑤經(jīng)本院倫理委員會批準，且患者均知情同意。排除標準：①根尖孔不完整，已有吸收或破壞；②為多根管或根管系統(tǒng)存在解剖變異。將所拔除的牙齒流水沖洗干凈后，以齦下刮治器刮除牙根表面的牙周膜、肉芽及牙石，再以流水沖洗干凈后將離體牙置于0.9%生理鹽水中，4℃冰箱冷藏備用。

(2)根管預備：以金剛砂車針沿釉牙骨質(zhì)界將離體牙進行截冠。冠向下法進行根管預備，將預備好的離體牙樣本浸泡于去離子水中，進行高溫高壓滅菌后備用。

(3)糞腸球菌感染根管模型的建立：向制備好的根管模型內(nèi)注射濃度為108CFU/ mL 的糞腸球菌懸液并置于含有1ml 此懸液的1.5ml 離心管內(nèi)，于厭氧培養(yǎng)箱(37℃、100%濕度)中厭氧培養(yǎng)3w，感染根管模型建立完成，用于后續(xù)實驗。

(4)根管充填及分組：將根管預備完成的離體牙隨機分為7 組，每組20 個樣本。分別為A 組：AH Plus 根管封閉劑+熱牙膠組；R 組：AH Plus根管封閉劑單尖組；C 組：iRoot SP 根管封閉劑+熱牙膠組；D 組：iRoot SP 根管封閉劑單尖組；E組：Hi Flow 根管封閉劑+熱牙膠組；F 組：Hi Flow 根管封閉劑單尖組；G 組：熱牙膠對照組，為僅充填熱牙膠，未使用根管封閉劑。根管充填后，以樹脂封閉髓腔，全程均在無菌操作下進行。

(5)細菌計數(shù)：將根管充填后的樣本均置于無菌RHI 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔2d 更換一次新鮮培養(yǎng)液，分別于根管充填20min、1d、7d、14d 時，對各組樣本進行細菌計數(shù)。具體方法如下：將牙根截成根尖3mm、根中1/ 3、根冠1/ 3，應(yīng)用GG 鉆將根管內(nèi)根充材料磨除，將收集到的所有磨除的根充材料及牙本質(zhì)碎屑移入2ml 離心管內(nèi)，其內(nèi)加入2mlPRS 緩沖液，均勻震蕩1min 后，對細菌懸液進行濃度稀釋，方法同1.2.1 的細菌計數(shù)方法，全部取樣工作均在無菌操作下進行。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 統(tǒng)計軟件23.0版本對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以(均數(shù)±標準差)表示，各組間的菌落數(shù)、抑菌環(huán)直徑比較均采用ANOVA 分析。對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，方差齊者采用LSD-t 檢驗進行兩兩比較，方差不齊者采用塔姆黑尼Y2 檢驗進行兩兩比較，檢驗水準α=0.05，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結(jié)果

2.1 直接接觸實驗各組根管封閉劑抑菌效果的比較 各組在與細菌混合培養(yǎng)不同時間后，除陽性對照組各時間點間菌落數(shù)無統(tǒng)計學差異外(P＞0.05)，其余各組隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落數(shù)均逐漸增多，各組不同時間點間菌落數(shù)均存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。

各組根管封閉劑在新鮮混合20min、1d 后，AH Plus 組、iRootSP 組、Hi Flow 組三組的菌落數(shù)均低于同時間點的陽性對照組(P＜0.05)，且20min、1d 兩個時間點的三組間菌落數(shù)無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。各實驗組根管封閉劑在混合7d 后，抗菌性均有所下降，以AH Plus 組下降最為明顯，但三組菌落數(shù)仍低于陽性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，iRootSP 組與Hi Flow 組的菌落數(shù)無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，均低于AH Plus 組(P＜0.05)。各實驗組根管封閉劑在混合14d 后，AH Plus 組的抗菌性進一步降低，與陽性對照組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。iRootSP 組與Hi Flow 組的抗菌性也在降低，但兩者間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，而與陽性對照組及AH Plus 組的菌落數(shù)均存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。具體見表1，圖1。

圖1 各組根管封閉劑混合1d 后菌落數(shù)比較

表1 各組根管封閉劑混合不同時間后菌落計數(shù)的比較(Log10 CFU/ mL，)

注：相同字母表示在同一時間點組間不存在統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

2.2 三組根管封閉劑抑菌環(huán)直徑的比較 三組根管封閉劑作用于糞腸球菌1d、3d、7d 后，各組的抑菌環(huán)直徑遞減，各組三個時間點間除1d 與3d間的抑菌環(huán)直徑無統(tǒng)計學差異外(P＞0.05)，其余時間點間比較均存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。根管封閉劑作用于糞腸球菌1d 時，三組間的抑菌環(huán)直徑iRootSP 根管封閉劑組最大，AH Plus 根管封閉劑組最小，但三組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。3d 時，各組抑菌環(huán)直徑均略有縮小，抑菌作用在減弱，但三組間仍無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。7d 時，各組抑菌環(huán)直徑縮小明顯，iRootSP 根管封閉劑組與Hi Flow 根管封閉劑組抑菌環(huán)直徑無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，且均高于AH Plus 根管封閉劑組(P＜0.05)。對照組蒸餾水作用于細菌后，任何時間均無抑菌環(huán)形成。具體見表2，圖2。

表2 各組根管封閉劑抑菌環(huán)直徑的比較(mm，)

表2 各組根管封閉劑抑菌環(huán)直徑的比較(mm，)

圖2 不同根管封閉劑不同時間的抑菌環(huán)效果

2.3 建立感染根管模型各組根管封閉劑抑菌效果的比較 各組根管封閉劑作用于感染根管20min后，AH Plus 根管封閉劑+熱牙膠組、iRoot SP 根管封閉劑+熱牙膠組、Hi Flow 根管封閉劑+熱牙膠組三組的菌落數(shù)均低于熱牙膠對照組(P＜0.05)，三組之間菌落數(shù)無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。其余各組菌落數(shù)與熱牙膠對照組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。各組根管封閉劑作用于感染根管1d 后，AH Plus 根管封閉劑+熱牙膠組、iRoot SP 根管封閉劑+熱牙膠組、iRoot SP 單尖組、Hi Flow 根管封閉劑+熱牙膠組四組的菌落數(shù)均低于熱牙膠對照組(P＜0.05)，四組之間菌落數(shù)無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。其余各組菌落數(shù)與熱牙膠對照組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。各組根管封閉劑作用于感染根管7d 后，各實驗組的抗菌性仍存在，菌落數(shù)均低于熱牙膠對照組(P＜0.05)。iRoot SP 根管封閉劑單尖組、Hi Flow 根管封閉劑+熱牙膠組，與其1d 時相比，菌落數(shù)更少，抗菌性更強(P＜0.05)。iRoot SP 根管封閉劑+熱牙膠組與其1d 時相比，菌落數(shù)增加，抗菌性減弱(P＜0.05)。各組根管封閉劑作用于感染根管14d 后，AH Plus 根管封閉劑+熱牙膠組、iRoot SP 根管封閉劑單尖組、Hi Flow 根管封閉劑+熱牙膠組三組的抗菌性仍良好，均優(yōu)于其余各組(P＜0.05)，且iRoot SP 根管封閉劑單尖組與Hi Flow 根管封閉劑+熱牙膠組的菌落數(shù)無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，均優(yōu)于AH Plus 根管封閉劑+熱牙膠組(P＜0.05)。具體見表3。

表3 建立感染根管模型各組根管封閉劑抑菌效果的比較(Log10 CFU/ mL，)

表3 建立感染根管模型各組根管封閉劑抑菌效果的比較(Log10 CFU/ mL，)

3.討論

根管是一個比較復雜的結(jié)構(gòu)，它存在很多根管預備器械很難到達的結(jié)構(gòu)，比如根管的峽部、側(cè)支根管以及根尖分歧、根尖分叉等部位。同樣的，在根管充填時，單純依靠牙膠尖等核材料也無法實現(xiàn)對這些部位的嚴密充填，對于根尖部位的充填不嚴密，往往會導致根尖微滲漏出現(xiàn)的幾率增加。因此，根管充填若要保持一個長期且穩(wěn)定的嚴密封閉效果，則必須有根管封閉劑的加入，根管封閉劑可進入這些復雜結(jié)構(gòu)內(nèi)，以保證根尖部位的封閉效果，從而能夠更好地降低根管內(nèi)再感染的風險。AH Plus 作為樹脂類根管封閉劑中的代表，它能夠通過固化反應(yīng)時分解的雙酚a-二縮水甘油醚以及甲醛從而達到抗菌的目的，其中的甲醛含量揮發(fā)極少，降低了細胞毒性，同時又兼具抗菌抑菌性，根尖封閉效果好，但AH Plus 對于根尖周組織有少量的刺激性作用[6-7]。大量實驗研究證實，與其它各類的根管封閉劑相比，硅酸鹽生物陶瓷類材料無論在生物活性、理化性能以及提高根尖密合性等方面表現(xiàn)更出色一些[8-9]。iRoot SP 根管封閉劑作為其中的代表，可以促進骨組織的再生以及根尖孔的閉合，同時凝固時不產(chǎn)生收縮，充填完成后降低了根尖再感染的發(fā)生[10]。HiFlow 根管封閉劑屬于硅酸鈣基類根管封閉劑的一種，與iRoot SP 的化學成分相似，其預混合而成，不需要調(diào)拌，直接注入根管內(nèi)即可，表現(xiàn)出較理想的生物相容性，很小的遺傳毒性，致癌性小，術(shù)后疼痛反應(yīng)輕，生物活性亦較好，可促進成骨分化及礦化，根尖組織耐受，可與牙本質(zhì)形成良好的化學粘接力[11-12]，同時可用于高溫下熱牙膠的根管內(nèi)充填，現(xiàn)已逐漸受到口腔臨床工作者的關(guān)注。

目前公認的根管治療理論表明，根管充填不應(yīng)單單只為了達到密閉根管的效果，更應(yīng)通過根管內(nèi)的充填材料(核材料以及根管封閉劑)對根管進行穩(wěn)定長久地殺菌抑菌作用，控制甚至完全清除根管內(nèi)的殘余細菌，促使根尖周組織加速痊愈[13]。HiFlow根管封閉劑屬于新型硅酸鈣基類封閉劑，可耐高溫，與iRoot SP 均屬于預合成的親水性生物陶瓷類封閉劑。區(qū)別在于，HiFlow 根管封閉劑在150℃～220℃的高溫下，仍能保持高流動性及粘接性，高溫下理化性質(zhì)穩(wěn)定，而iRoot SP 根管封閉劑在140℃時已發(fā)生了變性，因此不適用于熱牙膠的充填[14]。DCY 是檢測藥物抑菌性能的幾種方法之一。有實驗人員將DCY 改進后，證實i Root SP 根管封閉劑、AH Plus 根管封閉劑及HiFlow 根管封閉劑三種根管封閉劑對糞腸球菌均有一定地抑菌性，但材料的抑菌性能隨著固化時間的延長逐漸衰弱[15]。本實驗也證實，各組根管封閉劑在新鮮混合20min、1d 后，AH Plus 組、iRootSP 組、Hi Flow 組均有抗菌性，菌落數(shù)均低于陽性對照組，但三組間抗菌性無統(tǒng)計學差異。各組根管封閉劑在混合7d 后，各組仍有抗菌性，且iRootSP 組與Hi Flow 組的抗菌性優(yōu)于AH Plus 組。各組根管封閉劑在混合14d 后，AH Plus 組抗菌性極低，而iRootSP 組與Hi Flow 組仍能保持抗菌性。抑菌環(huán)實驗也發(fā)現(xiàn)，三組根管封閉劑作用于糞腸球菌1d、3d、7d 后，各組的抑菌環(huán)直徑遞減，說明隨著時間的延長，抑菌作用都逐漸在減弱。此外，本實驗還建立了感染根管模型，研究了各組根管封閉劑在常溫下及熱牙膠充填時的高溫作用后的抗菌性。結(jié)果表明，各組根管封閉劑表現(xiàn)出了良好的抗菌抑菌性，在根管充填14 天后，iRootSP 根管封閉劑+熱牙膠組，因高溫使其理化性質(zhì)有所改變，抗菌性降低，但其單尖充填后的抗菌性與Hi Flow 根管封閉劑的抗菌效果優(yōu)于AH Plus 根管封閉劑，與直接接觸實驗結(jié)果一致。以上均說明，三組封閉劑對糞腸球菌均有抗菌效果，且其抗菌性能與其固化狀態(tài)、時間有關(guān)，但Hi Flow 根管封閉劑與iRootSP 根管封閉劑的抗菌效果在實驗中未見差異，分析其原因：iRootSP 根管封閉劑與Hi Flow 根管封閉劑的主要化學成分基本相同，均含有硅酸鈣、氧化鋯、磷酸鈣、氫氧化鈣，其中后兩者反應(yīng)產(chǎn)生堿式磷酸鈣(Hydroxyapatite，HAP)及水后，水促進硅酸鈣發(fā)生水化，又生成氫氧化鈣及水化硅酸鈣(Hydrate calcium silicate，C-S-H)，從而水化反應(yīng)循環(huán)發(fā)生，使根管內(nèi)呈強堿性環(huán)境[16]，致使細菌的細胞膜或DNA 受損，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，因而iRootSP 根管封閉劑與Hi Flow 根管封閉劑均能夠發(fā)揮其抑菌抗菌性，細菌很難生存。此外，iRootSP 根管封閉劑與Hi Flow 根管封閉劑的區(qū)別在于兩者的顆粒分布不同，后者在高熱狀態(tài)下表現(xiàn)出更好的低粘性、高流動性。本實驗結(jié)果也說明Hi Flow 根管封閉劑在高溫狀態(tài)下，其抗菌效果未發(fā)生改變，而AH Plus 根管封閉劑因其釋出具有抑菌成分的甲醛量較低，因而其抑菌性低于前兩者[17-18]。

綜上所述，Hi Flow 根管封閉劑其抑菌性與iRootSP 根管封閉劑相似，值得臨床推廣。但由于本實驗所設(shè)置的觀察時間尚短，而且是體外研究實驗，不能完全模擬出口腔內(nèi)的真實環(huán)境，因此根管封閉劑的抗菌性仍需長時間結(jié)合大量的臨床病例進一步的研究。