周宇朦，孫洪浩，呂福軍

（遼寧波爾萊特農(nóng)牧實(shí)業(yè)有限公司，遼寧 沈陽 110122）

豆粕是大豆提取豆油后得到的一種副產(chǎn)物，因其氨基酸組成合理，適口性好，養(yǎng)分利用率高等特點(diǎn)，成為目前應(yīng)用最廣泛的植物性蛋白原料，約85%被用于家禽和豬的飼養(yǎng)[1]，需求量逐年遞增。但是豆粕中存在較多的抗?fàn)I養(yǎng)因子，如抗原蛋白、胰蛋白抑制劑、脲酶等[2]。其中抗原蛋白的危害最為嚴(yán)重，它會(huì)使仔豬發(fā)生過敏性腹瀉、腸黏膜細(xì)胞增生，甚至造成死亡，因此抗原蛋白含量高低被視為評(píng)判豆粕品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)[2-4]?？乖鞍字饕谴蠖骨虻鞍缀挺?伴球蛋白，大豆球蛋白是由6個(gè)酸性亞基和6個(gè)堿性亞基構(gòu)成，分子量為18～45 kD；β-伴球蛋白是由疏水作用相互締合的α'、α和β 3個(gè)亞基單位組成，分子量為42～83 kD[1]。

應(yīng)用發(fā)酵或體外酶解的方法可以提高豆粕的營養(yǎng)價(jià)值，從而替代或部分替代價(jià)格日益看漲的動(dòng)物性蛋白[5]。體外酶解豆粕能一定程度地降低或消除豆粕中的抗原蛋白，在酶解過程中將部分大分子蛋白降解成小分子蛋白，產(chǎn)生大量具有特殊營養(yǎng)功能的小分子蛋白，提高動(dòng)物對(duì)豆粕營養(yǎng)成分的吸收利用，緩解動(dòng)物性蛋白質(zhì)原料緊缺的同時(shí)提高了飼料的生物安全性[5]。

因此，本文使用8種不同酸堿性的蛋白酶對(duì)豆粕中抗原蛋白進(jìn)行降解，探究不同性質(zhì)的蛋白酶對(duì)抗原蛋白的影響，從而更準(zhǔn)確地使用相應(yīng)蛋白酶進(jìn)行降解工作，提高工作效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2021年5—7月在遼寧波爾萊特農(nóng)牧實(shí)業(yè)有限公司肽制劑研發(fā)中心進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料與試劑

豆粕（市售，粗蛋白質(zhì)含量43%）；8種蛋白酶，購自多個(gè)廠家，分別命名為A、B、C、D、E、F、G、H，其中酶A、B、C、D是堿性蛋白酶，酶E、F、G是中性蛋白酶，酶H是酸性蛋白酶。

1.3 試驗(yàn)儀器

CP2102電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；GSP-9080MBE隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；KDN-815全自動(dòng)凱氏定氮儀，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；Mini-PROTEAN? Tetra System電泳儀，美國BIO-RAD。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 酶解豆粕方法 預(yù)先將豆粕和蒸餾水進(jìn)行滅菌，根據(jù)飼料采樣GB/T 14699.1—2005對(duì)無菌豆粕進(jìn)行分裝采樣[6]。試驗(yàn)1：8個(gè)處理組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)呼吸袋中裝入200 g豆粕、0.2%蛋白酶、100 g水，將混合物攪拌均勻，置于50 ℃培養(yǎng)箱中酶解40 h。酶解結(jié)束后將樣品從呼吸袋中取出，置于托盤85 ℃烘干，粉碎測(cè)定抗原、小肽和粗蛋白質(zhì)。試驗(yàn)2：5個(gè)處理組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)呼吸袋中裝入200 g豆粕、0.2%堿性蛋白酶、0.2%果膠酶、100 g水，將混合物攪拌均勻，置于50 ℃培養(yǎng)箱中酶解40 h。酶解結(jié)束后將樣品從呼吸袋中取出，置于托盤85 ℃烘干，粉碎測(cè)定抗原。空白對(duì)照組中不添加酶制劑，進(jìn)行相同處理，每組做3次重復(fù)。

1.4.2 抗原蛋白的測(cè)定 采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法測(cè)定[5]。

1.4.3 小肽的測(cè)定 采用QBHHS JC006—2013三氯乙酸法測(cè)定[7]。

1.4.4 粗蛋白質(zhì)的測(cè)定 采用GB/T 6432—2018飼料中粗蛋白質(zhì)的測(cè)定—?jiǎng)P氏定氮法。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用 Microsoft Excel 進(jìn)行記錄和統(tǒng)計(jì)，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)的單因素方差分析，應(yīng)用Duncans法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶對(duì)豆粕抗原蛋白的影響

豆粕中分別添加酸堿性不同的8種蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，酶解試驗(yàn)結(jié)束后，烘干粉碎，取樣進(jìn)行抗原測(cè)定。結(jié)果如圖1所示，豆粕條帶有些瑕疵，但從樣品條帶可以看出，蛋白酶可以降解豆粕中的蛋白類抗?fàn)I養(yǎng)因子，β-伴球蛋白和大豆球蛋白減少或者完全消失。在相同的酶解參數(shù)下，各蛋白酶對(duì)豆粕中抗原蛋白的降解存在差異，酶A、B、C和G對(duì)β-伴球蛋白降解效果更明顯，酶E對(duì)大豆球蛋白降解效果最差，整體看來堿性蛋白酶的降解效果最好。

豆粕中分別添加5種堿性蛋白酶和果膠酶的混合物進(jìn)行酶解反應(yīng)，酶解試驗(yàn)結(jié)束后，烘干粉碎，取樣進(jìn)行抗原測(cè)定。結(jié)果如圖2所示，β-伴球蛋白的α、α'和β亞基幾乎被完全降解，這可能是因?yàn)榈鞍酌竷?yōu)先酶解7S組分[8]。大豆球蛋白中的酸性亞基大部分被降解，剩余堿性亞基，這是由于酸性亞基處于蛋白外部，堿性亞基位于蛋白內(nèi)部[9]，蛋白酶復(fù)合果膠酶對(duì)抗原蛋白的降解效果并沒有顯著優(yōu)于單獨(dú)使用蛋白酶。

2.2 不同蛋白酶對(duì)豆粕小肽含量的影響

豆粕中分別添加酸堿性不同的蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，酶解試驗(yàn)結(jié)束后，烘干粉碎，取樣進(jìn)行小肽含量測(cè)定。結(jié)果如表1所示，豆粕原料的小肽含量為8.12%，被酸堿性不同的蛋白酶酶解40 h后，小肽含量均增加，依次增加20.95、20.65、15.95、15.44、11.79、10.35、15.52和8.2個(gè)百分點(diǎn)。酶解后小肽含量從多到少依次是A＞B＞C＞G＞D＞E＞F＞H，整體看來堿性蛋白酶＞中性蛋白酶＞酸性蛋白酶。

表1 不同蛋白酶對(duì)豆粕小肽含量的影響

2.3 不同蛋白酶對(duì)豆粕粗蛋白質(zhì)含量的影響

豆粕中分別添加酸堿性不同的蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，酶解試驗(yàn)結(jié)束后，烘干粉碎，取樣進(jìn)行粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定。結(jié)果如表2所示，豆粕原料的粗蛋白質(zhì)含量為43.31%，被酸堿性不同的蛋白酶酶解40 h后，含量變化不明顯，酶A～酶H依次增加1.31個(gè)百分點(diǎn)、0.15個(gè)百分點(diǎn)、0.8個(gè)百分點(diǎn)，減少1.94個(gè)百分點(diǎn)、3.2個(gè)百分點(diǎn)，增加0.61個(gè)百分點(diǎn)、0.94個(gè)百分點(diǎn)，減少1.57個(gè)百分點(diǎn)。

表2 不同蛋白酶對(duì)豆粕粗蛋白質(zhì)含量的影響

3 討論

豆粕是畜牧行業(yè)中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源之一，存在不易消化利用等問題，需要借助酶制劑解決。本試驗(yàn)使用8種酸堿性不同的蛋白酶分別對(duì)豆粕進(jìn)行酶解試驗(yàn)，研究不同蛋白酶的酶解效果。龔阿瓊等[6]的試驗(yàn)表明，使用蛋白酶可有效降解抗原蛋白，提高豆粕中蛋白質(zhì)消化利用率。王之盛等[10]認(rèn)為，還需要考慮不同酸堿性條件對(duì)酶解能力的影響。本試驗(yàn)使用8種酸堿性不同的蛋白酶進(jìn)行試驗(yàn)，通過抗原檢測(cè)結(jié)果得出，酶解參數(shù)一致時(shí)，堿性蛋白酶去除抗原蛋白更有效?？赡苁且?yàn)槎蛊稍诿附膺^程中產(chǎn)生胺類等堿性物質(zhì)[11]，使酶體系pH更適合堿性蛋白酶作用。抗原蛋白是以復(fù)雜方式連接的復(fù)合體，推測(cè)單一酶制劑難以充分破壞其結(jié)構(gòu)[6]，因此多種酶制劑的協(xié)同效果可能更好。在本試驗(yàn)中，使用堿性蛋白酶和果膠酶復(fù)合處理豆粕中的抗原蛋白，效果并沒有明顯好于單獨(dú)使用蛋白酶，但這只是在本試驗(yàn)條件下的結(jié)果，不能推翻多種酶制劑的協(xié)同效果可能更好的猜測(cè)。宋士良等[12]用中性蛋白酶降解豆粕，小肽含量由3.38%上升到18.34%。Hong等[13]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后豆粕中的大分子蛋白有一部分降解為小于20 kDa的小分子肽類。本試驗(yàn)小肽含量增多，主要是由于發(fā)酵時(shí)蛋白酶將豆粕中大分子蛋白質(zhì)降解成活性小分子肽、有機(jī)酸等小分子物質(zhì)[14-15]，小肽增多更有利于動(dòng)物消化吸收，提高豆粕利用率，減少有害微生物的繁殖[1]。毛銀等[16]采用菌酶協(xié)同方法發(fā)酵豆粕，經(jīng)乳酸菌和中性蛋白酶37 ℃發(fā)酵48 h后，肽含量提高了223%，粗蛋白質(zhì)含量提高了6.23%。理論上酶解不會(huì)影響粗蛋白質(zhì)含量，粗蛋白質(zhì)的波動(dòng)是由水分的不同造成的，水分高蛋白質(zhì)含量低，水分低蛋白質(zhì)含量高。本試驗(yàn)小肽含量提高有限，粗蛋白質(zhì)含量幾乎無變化，酶解條件有很大的優(yōu)化空間。

4 結(jié)論

綜上所述，采用蛋白酶酶解豆粕時(shí)，堿性蛋白酶效果最好，能將大分子蛋白降解成小分子肽，清除β-伴球蛋白和酸性亞基。酶解效果除受酶本身的影響外，還受酶添加量、酶解條件等多種因素的影響，因此如何有效降低或者完全去除豆粕中的抗原蛋白，可以在使用堿性蛋白酶的基礎(chǔ)上繼續(xù)深入研究。