朱曉筱，周蘭蘭

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室 安徽 合肥 230022;2.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)護學(xué)院，廣東 深圳 518055)

過敏性接觸性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)是由半抗原特異性T細胞依賴性反應(yīng)介導(dǎo)的皮膚或粘膜接觸某些外部刺激物或過敏原時發(fā)生的炎癥反應(yīng)[1-2]。當機體受到半抗原攻擊后，主要表現(xiàn)為炎性細胞浸潤和炎性因子的釋放，臨床癥狀主要是致敏皮膚周圍出現(xiàn)紅斑、糜爛、結(jié)痂、水腫、瘙癢等[3-5]。ACD反應(yīng)中的T細胞在移植排斥反應(yīng)、移植物抗宿主病、自身免疫和腫瘤免疫中起著關(guān)鍵作用。因此，研究對ACD的誘導(dǎo)和調(diào)控作用對于尋找新藥和闡明作用機制具有重要意義。

良好的實驗動物模型有助于人們更方便和更有效地了解人類疾病的發(fā)生及發(fā)展規(guī)律并有利于研究其預(yù)防措施。2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)誘導(dǎo)的ACD模型是炎癥或慢性瘙癢研究中最常用的動物模型之一[6-7]。一個好的動物模型必須具有可準確復(fù)制且與臨床發(fā)病機制相似的特點，這對疾病的發(fā)病機制和療效的研究具有關(guān)鍵作用。DNFB是一種半抗原，當與機體首次接觸后激活皮膚角質(zhì)形成細胞并產(chǎn)生細胞因子。而細胞因子與抗原呈遞細胞結(jié)合，轉(zhuǎn)移至局部淋巴結(jié)，激活抗原特異性的T細胞，使其產(chǎn)生記憶T細胞，該過程為敏化過程。在致敏4～7 d后，機體再次接觸半抗原DNFB后補充和激活記憶T細胞，通過輔助T細胞1(Th 1)和輔助T細胞2(Th 2)產(chǎn)生細胞因子，誘發(fā)局部接觸性過敏反應(yīng)[8]。該反應(yīng)一般在接觸半抗原后約18 h發(fā)生，并在24～48 h內(nèi)達到高峰。有文章應(yīng)用2周ACD模型研究Toll樣受體在慢性瘙癢癥中的作用，而也有文章通過使用5周ACD模型研究通過 BRAF信號通路影響感覺神經(jīng)元慢性瘙癢的發(fā)展[9]。所以有些研究人員考慮到2周的建模周期是否太短而無法產(chǎn)生明顯的癥狀和炎癥變化。為了在實際的實驗操作中明確和選擇更適合的動物模型而進行深步研究，本研究構(gòu)建并評價了DNFB致小鼠ACD反應(yīng)的不同建模方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)雄性SPF級 C57 BL/6小鼠，體質(zhì)量約(25±2)g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：(蘇)2016-0010，SCXK。飼養(yǎng)和實驗期間自由進食和飲水，環(huán)境溫度(20～25)℃，相對濕度40%～60%。本研究中描述的所有實驗方案均遵循安徽醫(yī)科大學(xué)動物護理委員會《實驗動物護理和使用指南》中概述的方案，符合美國國立衛(wèi)生研究院ARRIVE實驗動物護理和使用指南的指導(dǎo)方針。

1.2 主要藥品試劑及儀器2，4-二硝基氟苯：購自Sigma，BCCB1276。丙酮：合肥欣樂有限公司，190131。橄欖油：上海阿拉丁，K1922143。多聚甲醛：上海阿拉丁，HJ201403。生理鹽水：山東齊魯藥業(yè)有限公司，2B20012105。小鼠(Mouse)免疫球蛋白E(Ig E)ELISA試劑盒：南京建成生物工程研究所，210821M。相機和三腳架：日本尼康。ASP-300型自動脫水機：德國萊卡。HistoCoreArcadia組織包埋機：德國萊卡。RM2255全自動輪轉(zhuǎn)石蠟切片機：德國萊卡。DHG - 9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海三科學(xué)儀器有限公司。Pannoramic MIDI智能組織切片成像分析系統(tǒng)：3D HISTECH。

Fig 1 Protocol for 2-week and 5-week ACD model induction in mice

1.3 2周過敏性接觸性皮炎模型的構(gòu)建與分組DNFB溶解在丙酮：橄欖油(4 ∶1)的混合溶液中；雄性C57 BL/6小鼠隨機分為生理鹽水對照、溶媒組(丙酮：橄欖油)和DNFB模型組，每組6只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，剔除小鼠頸背部和腹部的毛發(fā)，剃毛面積約為2 cm × 2 cm。適應(yīng)2 d后，將0.5% DNFB-丙酮混合液50 μL均勻涂抹在腹部剃毛區(qū)，進行初次致敏，d 2重復(fù)該操作強化致敏。敏化5 d后，將0.15% DNFB 50 μL均勻涂抹在模型組小鼠頸背部剃毛區(qū)，對照組小鼠和溶媒組小鼠分別涂抹50 μL的生理鹽水和50 μL丙酮-橄欖油混合液。隔1 d給藥1次，重復(fù)4次，即在頸背部開始給藥的d 1，3，5，7均勻涂抹，且每次頸背部涂抹24 h后記錄行為學(xué)視頻60 min。見Fig 1 A。

1.4 5周過敏性接觸性皮炎模型的構(gòu)建與分組將C57 BL/6雄性小鼠隨機分為對照組、溶媒組(丙酮 ∶橄欖油4 ∶1組)和DNFB模型組，每組5只。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，小鼠腹部和頸背部剃毛，面積2 cm × 2 cm。小鼠剃毛后適應(yīng)兩天開始造模。滴加0.15% DNFB 100 μL于小鼠腹部剃毛處，均勻涂抹敏化。敏化1周后，在模型組小鼠頸背部剃毛區(qū)域涂抹0.15% DNFB 50 μL，每周給藥兩次，持續(xù)4周，共9次，每次頸背部處理24 h后記錄癢覺行為學(xué)視頻，連續(xù)記錄60 min。具體干預(yù)措施見Fig 1 B。

1.5 癢行為學(xué)檢測使用SONY數(shù)字視頻攝像機對癢行為測試進行錄像。在錄像記錄前，將小鼠放置在塑料場地(10 cm×10 cm×13 cm)中至少10 min使其習(xí)慣于記錄條件，塑料小盒上方有通氣孔，盒中放少許墊料，透明塑料盒之間用紙片隔開，避免小鼠相互影響；透明塑料盒使用前清洗并吹干，避免氣味殘留的影響。然后記錄小鼠60 min的自發(fā)性劃痕。視頻在計算機上播放以供觀察者評估，計數(shù)在60 min內(nèi)觀察到小鼠后肢向著頸背部涂抹區(qū)域的抓撓行為。劃痕定義為在小鼠抬起后爪抓撓到后爪回到地面或嘴巴記為1次。

1.6 皮膚病理組織學(xué)檢測造模結(jié)束后，取小鼠造模處皮膚，多聚甲醛固定后脫水包埋成蠟塊，切片機切成5 μm的薄片，分別進行蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining，HE)和甲苯胺藍染色(Toluidine blue staining，TB)后，鏡下觀察并拍片。ImageJ測量表皮厚度(Fig 4箭頭處)和肥大細胞數(shù)(Fig 5箭頭處)后分別進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.7 ELISA檢測小鼠血清中Ig-E水平造模結(jié)束后，眼球靜脈取血。離心機設(shè)置3 000 r·min離心30 min后取上清，接下來的具體操作步驟按ELISA試劑盒所附的說明書進行操作，檢測范圍為7.5～240 μg·L-1最后在450 nm波長處測定各孔的OD值，并拍照記錄后進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 兩種建模周期的小鼠癢行為學(xué)變化實驗結(jié)果如Fig 2所示，與空白對照組相比較，2周ACD模型組小鼠后肢抓撓次數(shù)明顯增多且呈上升趨勢(P<0.01)；溶媒組小鼠后肢抓撓次數(shù)無明顯增多趨勢。隨著時間的推移，2周模型的構(gòu)建周期結(jié)束時小鼠抓撓次數(shù)達到最高水平(P<0.01)。5周ACD模型的模型組小鼠后肢抓撓次數(shù)也增多明顯，在5周模型構(gòu)建期結(jié)束時，模型組的癢行為學(xué)顯著高于對照組和溶媒組(P<0.01)。

2.2 兩種建模周期的小鼠皮膚病損程度比較實驗結(jié)果如Fig 3所示，在兩種建模的過程中，對照組和溶媒組小鼠頸背部皮膚表面均無明顯變化，且小鼠活動性較好。隨著造模過程的進行，2周模型小鼠造模部位皮膚逐漸出現(xiàn)紅斑、水腫、潰爛、結(jié)痂。小鼠造模處皮膚在涂抹DNFBd 5已經(jīng)發(fā)生潰爛；頸背部涂抹DNFB d 7潰爛處皮膚結(jié)痂變硬；2周造模結(jié)束時皮膚呈現(xiàn)結(jié)痂狀態(tài)。

然而，5周模型小鼠的皮膚表面明顯出現(xiàn)紅斑、水腫、潰爛、結(jié)痂、脫痂、再反復(fù)潰爛后結(jié)痂的現(xiàn)象。在小鼠頸背部涂抹DNFB d 8造模處皮膚發(fā)生潰爛；d 11給藥前皮膚已結(jié)痂；d 15給藥前，皮膚結(jié)痂已褪去，暴露痂下皮膚，呈干燥狀；d 18給藥前，造模處皮膚潰爛加重；d 22給藥前，皮膚開始結(jié)痂，且給藥區(qū)域周圍皮膚開始翻起；d 25給藥前，小鼠給藥區(qū)域周圍翻起皮膚開始褪去，且皮膚潰爛；5周模型造模結(jié)束取材時，頸背部痂脫落暴露出皮膚。

Fig 2 Comparison of scratching behavior changes in two ACD models A：2-week last scratch count;B：2-week itch behavioral trends;C：5-week last scratch count，D：5-week itch behavioral trends.**P<0.01 vs NS group

2.3 HE染色觀察比較皮膚表皮增厚程度如Fig 4所示，2周模型和5周模型的溶媒組和對照組小鼠造模處皮膚表皮均無明顯增厚，且邊緣清晰。2周模型組小鼠與對照組小鼠相比，造模處皮膚表皮層明顯增厚(P<0.01)，且炎性浸潤、海綿狀變性和真皮毛細血管擴張；與2周模型結(jié)果相似，5周模型小鼠造模部位皮膚也表現(xiàn)出表皮增厚(P<0.01)、角化過度、海綿樣變性和真皮毛細血管擴張。

2.4 TB染色觀察比較炎性肥大細胞浸潤程度實驗結(jié)果如Fig 5所示，與對照組和溶媒組小鼠相比，2周模型組小鼠造模部位皮膚真皮層出現(xiàn)散在的炎癥細胞浸潤，且肥大細胞浸潤明顯(P<0.01)。同樣，5周模型的結(jié)果與2周模型的結(jié)果相似，造模部位皮膚表皮炎癥浸潤明顯(P<0.01)，但浸潤程度更為嚴重。5周造模部位皮膚肥大細胞呈圓形或橢圓形，細胞核小，染色淺，位于細胞中心成堆或單獨分布，且細胞質(zhì)內(nèi)充滿相同大小的藍紫色顆粒，均勻分布在細胞核周圍。

2.5 ELISA檢測比較血清中Ig-E水平實驗結(jié)果如Fig 6所示，與對照組和溶媒組小鼠相比，2周模型組小鼠血清中Ig-E水平明顯升高(P<0.01)。同樣，5周模型的結(jié)果與2周模型的結(jié)果相似，模型組小鼠血清中Ig-E水平較對照組明顯升高(P<0.01)。

Fig 4 Comparison of epidermal thickness variationin two ACD models A：2-week NS group;B：2-week vehicle group;C：2-week DNFB group;D：5-week NS group;E：5-week vehicle group;F：5-week DNFB group;G：Statistical analysis of the degree of skin epidermal thickening.**P<0.01 vs NS group

Fig 5 Comparison of inflammatory mast cell changes A：2-week NS group;B：2-week vehicle group;C：2-week DNFB group;D：5-week NS group;E：5-week vehicle group;F：5-week DNFB group;G：Statistical analysis of the mast cell counts results.**P<0.01 vs NS group

Fig 6 Comparison of Ig-E levels in serum in two A：2-week IgE levels in serum;B：5-week Ig-E levels in serum.**P<0.01 vs NS group

3 討論

ACD是一種具有復(fù)發(fā)性、瘙癢性和炎癥性的慢性皮膚病，其發(fā)病率在全世界逐年升高。外源性過敏原的局部致敏是誘發(fā)ACD免疫炎癥的重要基礎(chǔ)，而免疫炎癥反應(yīng)主要以Th 2細胞分泌IL-4為基礎(chǔ)[4]。通過表皮中的蛋白質(zhì)連接才能構(gòu)成一個新的抗原決定簇，引起免疫系統(tǒng)激活。DNFB建立的ACD模型是最常用模型之一，DNFB是小分子物質(zhì)半抗原，易與皮膚組織蛋白相結(jié)合，且不顯著改變組織蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，其誘導(dǎo)的ACD模型作為一種免疫和瘙癢模型，在T細胞炎癥相關(guān)及瘙癢研究中有重要作用[7，10]。然而，ACD不同的建模周期模型往往會給研究人員帶來選擇上的麻煩，而且其時間跨度也大不相同。因此，以便更好地選擇合適的動物模型，進一步研究和明確不同建模周期的病變特征變得十分重要，特別是對于藥物治療效果的評價。研究采用腹部致敏后頸背激發(fā)的方法建立不同造模周期的小鼠ACD模型，通過檢測動物的瘙癢行為變化，并進一步檢查了皮膚組織病理學(xué)變化情況和血清中IgE水平等，以評估慢性瘙癢和免疫炎癥反應(yīng)的程度。

瘙癢為一種十分不愉快的感覺，會引起機體強烈的抓撓欲望[7，11]。通常瘙癢與皮膚疾病有關(guān)，然而它也可能伴隨著各種全身性疾病，包括腎、肝、神經(jīng)、腫瘤或心理源性疾病等[12-13]。因此，合適的瘙癢模型以及增加對慢性瘙癢神經(jīng)生物學(xué)的了解可能有助于提供新的治療策略。實驗結(jié)果顯示，兩種ACD模型造模周期的小鼠整個建模過程都伴隨后肢刮擦反應(yīng)。隨著造模的進行，瘙癢抓撓次數(shù)均逐漸增多，這表明兩種建模周期都會引起癢行為發(fā)生顯著變化，且瘙癢發(fā)生迅速。因此，從瘙癢行為的角度來看，建模時間的長短可能影響不夠明顯。

在臨床上，特應(yīng)性皮炎患者常有一些特征性的表現(xiàn)，如皮膚干燥、魚鱗病和各種濕疹等。急性濕疹的特點是紅斑丘疹和水皰，瘙癢劇烈，且伴有滲出和結(jié)痂；而亞急性或慢性濕疹為干燥、鱗狀或剝落性紅斑丘疹[14]。我們的研究結(jié)果顯示小鼠瘙癢癥狀為小鼠開始時抓撓，然后皮炎再造成損害進一步加重。即先產(chǎn)生瘙癢，然后再引起皮損，這與ACD的臨床特點是一致的。瘙癢是DNFB誘發(fā)的ACD模型的基本特征，而不是先出疹后再產(chǎn)生瘙癢。且隨著時間的推移，可能會出現(xiàn)表皮增厚(苔蘚樣變)和長期搔抓而引起的皮膚裂痕。ACD小鼠在造模部位的典型癥狀是瘙癢、紅腫、鱗屑和結(jié)痂破損等，尤其是5周模型小鼠反復(fù)出現(xiàn)該癥狀，因此其更嚴重。這表明兩個造模周期的皮損均具有典型性，且也符合臨床疾病的特點，因此我們認為其均可作為瘙癢和皮炎研究的動物模型。

ACD通常被認為是由于活化的Th 2、嗜酸性粒細胞和肥大細胞之間復(fù)雜的相互作用而引起的炎癥性皮膚病，其主要機制為炎性細胞的浸潤[15]。該研究發(fā)現(xiàn)兩種造模周期的小鼠造模皮膚組織病理學(xué)表現(xiàn)為表皮增厚、炎性浸潤、海綿樣變性、真皮毛細血管擴張和角化過度。結(jié)果表明兩種造模周期都是可行的，但五周模型炎癥損傷更加劇烈。肥大細胞是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)細胞，在炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，尤其是在Th 2和Ig E介導(dǎo)的急性過敏反應(yīng)中[16-17]。Meixiong等[18]研究表明，肥大細胞通過Mas相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體b 2受體激活導(dǎo)致ACD相關(guān)的炎癥和瘙癢。本實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，兩種建模周期小鼠造模皮膚均出現(xiàn)明顯的肥大細胞浸潤。與瘙癢行為和皮膚損傷結(jié)果相同，5周模型小鼠造模皮膚的肥大細胞數(shù)量明顯高于2周模型小鼠。結(jié)果表明，這兩種建模周期都是可行的，但在5周建模結(jié)束后，炎癥損傷程度和免疫反應(yīng)更加強烈。

綜上所述，DNFB引起ACD模型非常穩(wěn)定，且兩種建模周期都是可行的。2周模型雖然造模周期較短，但癢行為學(xué)、皮膚損傷和免疫炎癥反應(yīng)均出現(xiàn)。而5周模型可能有更典型的癥狀、皮膚受損程度更嚴重和更強烈的免疫反應(yīng)，且有足夠的時間進行藥物觀察研究。本研究為瘙癢和炎癥相關(guān)藥物的研究選擇合適的動物模型提供了實驗依據(jù)。