楊雅迪，陳錦華，唐富天

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，遼寧 錦州 121000；2.鐵嶺衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，遼寧 鐵嶺 112008；3.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；4.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科、甘肅省消化系腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030)

辛伐他汀(simvastatin，Sim)為羥甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑類(lèi)降脂藥[13]，通過(guò)降血脂作用發(fā)揮對(duì)心血管疾病的保護(hù)作用。然而，研究發(fā)現(xiàn)在低于降脂作用的劑量下，Sim仍然對(duì)心血管、脂肪肝等疾病具有保護(hù)作用[14-15]，然而其作用機(jī)制還不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)將利用高脂飼料喂養(yǎng)的載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E knockout，ApoE KO)小鼠作為NAFLD模型，研究Sim對(duì)小鼠肝功能障礙的保護(hù)作用，同時(shí)觀察Calpain特異性抑制劑PD150606(PD)對(duì)肝功能的影響，并從氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和calpain活化等方面探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物 8周齡健康♂ApoE KO和C57小鼠，體質(zhì)量(20±2) g，由南京模式動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在給藥前適應(yīng)性飼養(yǎng)2周。

1.1.2試劑 高脂飼料購(gòu)自北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司。Sim購(gòu)自上海默克公司。從南京建成生物工程研究所購(gòu)買(mǎi)如下試劑盒：總膽固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)含量測(cè)定試劑盒，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)活性測(cè)定試劑盒，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測(cè)定試劑盒，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)含量測(cè)定試劑盒。PD150606和活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量測(cè)定試劑購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.3儀器 Elx-800型酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio-tek公司，紫外分光光度計(jì)購(gòu)自購(gòu)自Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組及干預(yù) 10只C57小鼠作為對(duì)照組(C57組)，30只8周齡雄性ApoE KO小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只即ApoE KO組，ApoE KO+Sim(5 mg·kg-1，p.o.)組，ApoE KO+PD(5 mg·kg-1，i.p.)組。每天1次，給藥干預(yù)時(shí)間為12周，并且均采用高脂飼料喂養(yǎng)。Sim以0.5%羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)制成混懸液，灌胃劑量為10 mL·kg-1。PD以0.1% DMSO溶解，注射劑量為10 mL·kg-1。Sim和PD的劑量選擇是基于我們之前發(fā)表的文章確定的[16-17]。

為保證模擬結(jié)果的可靠性，對(duì)光滑管從0.5～2.0m/s的入口流速進(jìn)行模擬，由于研究流體為無(wú)相變流體在光滑管管內(nèi)作強(qiáng)制流動(dòng)，可將模擬得到的摩擦系數(shù)fA與Blasius公式計(jì)算理論值對(duì)比[9]，從而判定模擬結(jié)果的可靠性。結(jié)果如表2所示。

1.2.2血清和肝臟中脂質(zhì)含量測(cè)定 將血樣和肝臟勻漿3 000 r·min-1離心10 min，留取上清，使用南京建成生物工程公司試劑盒測(cè)定其TC和TG含量。采用酶法生成的反應(yīng)物在490 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.3MDA含量和SOD活性測(cè)定 肝臟中MDA含量和SOD活性測(cè)定采用南京建成生物工程公司試劑盒進(jìn)行。MDA含量的測(cè)定原理和方法為：過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰。SOD活性的測(cè)定原理和方法為：通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)于550 nm處測(cè)其吸光度并計(jì)算活性。

1.2.4血清AST和ALT活性測(cè)定 應(yīng)用南京建成生物工程公司試劑盒測(cè)定血清AST和ALT活性。AST的測(cè)定原理和方法為：AST能使α-酮戊二酸和天門(mén)冬氨酸移換氨基和酮基，生成谷氨酸和草酰乙酸。草酰乙酸在反應(yīng)過(guò)程中可自行脫羧成丙酮酸。丙酮酸與2，4二硝基苯肼反應(yīng)生成2，4二硝基苯腙，在堿性溶液中顯紅棕色。用可見(jiàn)光分光光度計(jì)于510 nm處測(cè)其吸光度并計(jì)算活性。ALT的測(cè)定原理和方法為：ALT作用于丙氨酸及α-酮戊二酸組成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸，加入2，4-二硝基苯肼鹽酸溶液中止反應(yīng)后，于505nm處測(cè)其吸光度并計(jì)算活性。

1.2.5IL-6和TNF-α含量測(cè)定 應(yīng)用南京建成生物工程公司試劑盒測(cè)定肝臟中IL-6和TNF-α含量。測(cè)定原理和方法為：采用ELISA方法，反應(yīng)物于450 nm處測(cè)其吸光度。

1.2.6DHE染色法測(cè)定肝臟組織中ROS含量 肝臟組織用冰凍切片機(jī)切片后加入DHE溶液(避光)，恒溫水浴反應(yīng)30 min后(避光)，用熒光顯微鏡采集圖片，采用紅色熒光的強(qiáng)度來(lái)判斷細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

1.2.7Calpain活性檢測(cè) 肝臟組織進(jìn)行勻漿后，離心取上清，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)calpain活性。激發(fā)波長(zhǎng)為380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為460 nm。

2 結(jié)果

2.1 Sim和PD對(duì)小鼠血清AST和ALT活性的影響與C57小鼠相比，ApoE KO小鼠血清AST(Fig 1A)和ALT(Fig 1B)活性分別增加了87.0%和85.2%。與ApoE KO小鼠相比，給予Sim和PD的小鼠血清AST活性分別降低了37.4%和48.8%，ALT活性分別降低了31.9%和38.7%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，Sim和PD對(duì)肝臟功能損傷具有保護(hù)作用。

2.2 Sim和PD對(duì)小鼠體質(zhì)量、血清和肝臟脂質(zhì)含量的影響各組小鼠體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)前(Fig 2A)和實(shí)驗(yàn)后(Fig 2B)沒(méi)有顯著性差別。與C57小鼠相比，ApoE KO小鼠血清TC(Fig 2C)和TG(Fig 2D)分別增加了2.5倍和1.4倍，表明ApoE KO小鼠形成了明顯的高脂血癥。與ApoE KO小鼠相比，Sim和PD對(duì)小鼠血清TC和TG含量沒(méi)有明顯影響。另外，與C57小鼠相比，ApoE KO小鼠肝臟TC(Fig 2E)和TG(Fig 2F)含量分別增加了1.2和1.0倍，表明ApoE KO小鼠形成了明顯的脂肪肝。與ApoE KO小鼠相比，給予Sim和PD的小鼠肝臟TC和TG含量沒(méi)有明顯的變化。上述結(jié)果表明，Sim和PD對(duì)肝臟損傷的保護(hù)作用與血脂和肝臟脂質(zhì)含量無(wú)關(guān)。

Fig 1 Effect of Sim and PD on AST (A) and ALT (B) activity in serum**P<0.01 vs C57 group;##P<0.01 vs ApoE KO group.

Fig 2 Effect of Sim and PD on weight (A and B)，serum TC (C) and TG (D) contents，liver TC (E) and TG (F) content1:C57；2：ApoE KO;3:ApoE KO+Sim;4:ApoE KO+PD.**P<0.01 vs C57 group

Fig 3 Effect of Sim and PD on MDA (A) content and SOD activity (B) and ROS content (C) in liver
1:C57；2：ApoE KO;3:ApoE KO+Sim;4:ApoE KO+PD.**P<0.01vsC57 group;##P<0.01vsApoE KO group.

2.3 Sim和PD對(duì)小鼠肝臟MDA含量、SOD活性和ROS的影響與C57小鼠相比，ApoE KO小鼠肝臟MDA(Fig 3A)含量增加了1.5倍，而SOD活性(Fig 3B)降低了63.0%。與ApoE KO小鼠相比，給予Sim和PD的小鼠肝臟MDA含量分別降低了33.5%和43.1%，而SOD活性分別增加了62.1%和112.7%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，與C57小鼠相比，ApoE KO小鼠肝臟ROS(Fig 3C，3D)含量增加了5.4倍。與ApoE KO小鼠相比，給予Sim和PD的小鼠肝臟ROS含量分別降低了50.0%和51.8%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，Sim和PD降低肝臟氧化水平，增加肝臟抗氧化能力可能是保護(hù)肝臟功能的一個(gè)重要機(jī)制。

2.4 Sim和PD對(duì)小鼠肝臟TNF-α和IL-6含量的影響與C57小鼠相比，ApoE KO小鼠肝臟TNF-α(Fig 4A)和IL-6(Fig 4B)含量分別增加了2.0倍和2.2倍。與ApoE KO小鼠相比，給予Sim和PD的小鼠肝臟TNF-α含量分別減少了35.1%和42.8%，IL-6含量分別減少了29.9%和32.7%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，抗炎作用是Sim和PD保護(hù)肝臟功能的另一個(gè)重要機(jī)制。

Fig 4 Effect of Sim and PD on TNF-α (A) and IL-6 (B) in liver1:C57；2：ApoE KO;3:ApoE KO+Sim;4:ApoE KO+PD.**P<0.01 vs C57 group;##P<0.01 vs ApoE KO group.

2.5 Sim和PD對(duì)小鼠肝臟Calpain活性的影響與C57小鼠相比，ApoE KO小鼠肝臟中calpain活性增加了3.9倍(Fig 5)。與ApoE KO小鼠相比，給予Sim和PD的小鼠肝臟calpain活性分別降低了47.1%和63.1%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，Sim和PD降低calpain活性可能是保護(hù)肝臟功能的重要機(jī)制。

Fig 5 Effect of Sim and PD on calpain activity in liver1:C57；2：ApoE KO;3:ApoE KO+Sim;4:ApoE KO+PD.**P<0.01 vs C57 group;##P<0.01 vs ApoE KO group.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，Sim能夠減輕脂肪肝所致的肝功能損傷，但對(duì)血清和肝臟脂質(zhì)含量沒(méi)有明顯影響。Sim還能夠降低肝臟MDA和ROS含量、提高SOD活性，降低肝臟TNF-α和IL-6水平以及calpain活性。研究還發(fā)現(xiàn)，calpain抑制劑PD和Sim有相似的作用。這一發(fā)現(xiàn)揭示了Sim保護(hù)肝功能損傷的新機(jī)制。

血清AST和ALT活性是反映肝臟功能的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，Sim能夠明顯降低ApoE KO小鼠血清AST和ALT活性，表明Sim對(duì)脂肪肝誘導(dǎo)的肝臟功能損傷有明顯的保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn)[14-15]，Sim對(duì)醋氨酚和膽汁淤積性小鼠肝損傷也有明顯的保護(hù)作用。上述研究結(jié)果表明，Sim對(duì)多種因素造成的肝功能損傷有保護(hù)作用，然而其保護(hù)作用機(jī)制還不十分清楚。

研究發(fā)現(xiàn)[18]，20%～80%的NAFLD患者伴有高脂血癥，表明高脂血癥是NAFLD的重要危險(xiǎn)因素，而通過(guò)調(diào)節(jié)高脂血癥就能夠有效抑制NAFLD。然而，本研究結(jié)果表明，Sim對(duì)小鼠血清和肝臟中TC和TG含量沒(méi)有明顯的影響，說(shuō)明Sim對(duì)肝臟損傷的保護(hù)作用并不是通過(guò)降低脂質(zhì)含量實(shí)現(xiàn)的，而是存在其他的作用機(jī)制。我們之前研究發(fā)現(xiàn)[16]，Sim在對(duì)血脂水平?jīng)]有影響的劑量下，能夠明顯抑制ApoE KO小鼠動(dòng)脈粥樣硬化，其機(jī)制與調(diào)節(jié)calpain-1表達(dá)、抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。為此，我們進(jìn)一步探討了這些機(jī)制在Sim保護(hù)肝功能損傷中的意義。

氧化應(yīng)激與肝功能損傷關(guān)系密切，MDA水平是反映肝臟脂質(zhì)氧化的重要指標(biāo)，SOD是重要的抗氧化酶[14]。肝臟SOD活性下降導(dǎo)致ROS增加。本研究發(fā)現(xiàn)[7，15]，Sim能夠降低ApoE KO小鼠肝臟MDA和ROS含量，升高SOD活性，表明降低肝臟氧化水平，增加抗氧化能力是Sim保護(hù)肝臟功能的重要機(jī)制。另外，炎癥反應(yīng)在肝臟功能紊亂中也具有重要作用，TNF-α和IL-6是重要的炎性因子。本研究發(fā)現(xiàn)，Sim能夠減少ApoE KO小鼠肝臟TNF-α和IL-6含量，表明抗炎作用與Sim保護(hù)肝臟功能密切相關(guān)。有臨床研究報(bào)到，TNF-α和IL-6可能參與促進(jìn)肝臟損傷和NAFLD發(fā)展[7]。除了抗氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的作用外[16-17]，Sim還能夠抑制醋氨酚誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的細(xì)胞凋亡[14]。

Calpain活化在肝功能損傷中具有重要意義[11-12]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，calpain-1基因敲除通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和炎癥保護(hù)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝功能障礙[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，Sim能夠降低ApoE KO小鼠肝臟中calpain活性，說(shuō)明抑制calpain活性與Sim降低氧化應(yīng)激和炎癥水平，進(jìn)而改善肝功能有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證抑制calpain活性和上述作用的關(guān)系，本研究還發(fā)現(xiàn)，calpain特異性抑制劑PD在抑制ApoE KO小鼠肝臟中calpain活性的同時(shí)，還能夠降低氧化應(yīng)激和炎癥水平，進(jìn)而改善肝功能。和Sim作用一致，PD對(duì)血脂和肝臟脂質(zhì)水平也沒(méi)有明顯的影響，其肝功能保護(hù)作用與降低氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥水平有關(guān)。

總之，該研究表明Sim和PD都能夠改善ApoE KO小鼠肝功能損傷，其機(jī)制可能與抑制calpain活性，進(jìn)而提高機(jī)體抗氧化能力，降低炎癥反應(yīng)有關(guān)。