王丹 林志強(qiáng) 阮永春 周宜慶 李明暉

(浙江大學(xué)紹興醫(yī)院 紹興市人民醫(yī)院，紹興 312000)

腸球菌是一類廣泛存在于土壤、植物以及人類和動(dòng)物胃腸道中的革蘭陽(yáng)性球菌，它是人類及動(dòng)物腸道微生物組的核心成員，維持著機(jī)體微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定。從醫(yī)院獲得性感染患者中分離到的常見(jiàn)微生物中，腸球菌排名基本在第2～3位[1]。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，由于腸球菌對(duì)抗生素的敏感性下降，導(dǎo)致了耐藥菌的大量出現(xiàn)，其引起疾病挑戰(zhàn)日益加劇。耐萬(wàn)古霉素腸球菌(vancomycin resistantEnterococcus,VRE)自20世紀(jì)80年代中期被發(fā)現(xiàn)后，隨即在全球蔓延，甚至在一些醫(yī)院發(fā)現(xiàn)多達(dá)80%的屎腸球菌分離株對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥[2]。耐藥腸球菌的產(chǎn)生不僅加大了臨床抗感染工作的難度，而且導(dǎo)致大量社會(huì)醫(yī)療資源被占用、耗損，促使其成為了一個(gè)需迫切解決的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。

為了解本院腸球菌的耐藥現(xiàn)狀以及近年來(lái)細(xì)菌耐藥性的動(dòng)態(tài)變化，本研究收集2015年1月—2020年12月本院住院患者臨床分離的腸球菌實(shí)驗(yàn)室資料及相關(guān)的臨床信息，進(jìn)行回顧性分析，通過(guò)對(duì)本院腸球菌的感染情況、耐藥菌的臨床分布特點(diǎn)及耐藥趨勢(shì)變遷分析，為臨床合理使用抗感染藥物提供有力依據(jù)，有效減少耐藥菌的產(chǎn)生。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

收集2015年1月—2020年12月我院各類臨床標(biāo)本中檢出的所有腸球菌屬菌株，標(biāo)本均由我院臨檢中心微生物室參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)推薦的藥敏試驗(yàn)要求檢出并審核，且所有的標(biāo)本采集符合我院臨床檢驗(yàn)標(biāo)本采集規(guī)范，同一患者同一部位檢出的重復(fù)株以第1次計(jì)算。

1.2 儀器

藥敏紙片由Oxoid公司提供；E試驗(yàn)條由Bio-Merieux公司提供；BioMerieux全自動(dòng)微生物鑒定儀Vitek 2 Compact。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

運(yùn)用法國(guó)Bio- Merieux全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行菌株鑒定以及最低抑菌濃度檢測(cè)，采用紙片法或自動(dòng)化儀器法進(jìn)行抗菌藥物耐藥性檢測(cè)，質(zhì)控菌株：糞腸球菌ATCC29212。藥敏試驗(yàn)參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)推薦的藥敏試驗(yàn)方法進(jìn)行并判讀結(jié)果，其中替加環(huán)素的判斷標(biāo)準(zhǔn)按美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局文件標(biāo)準(zhǔn)。用MH培養(yǎng)基進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，涂布完成后將接種好的平板在15 min內(nèi)放置35℃孵育18～24 h。四環(huán)素、替考拉寧、氨芐西林、高濃度慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、紅霉素和萬(wàn)古霉素常規(guī)采用K-B法藥敏試驗(yàn)。對(duì)萬(wàn)古霉素、利奈唑胺、替考拉寧的紙片或自動(dòng)化檢測(cè)為不敏感菌株時(shí)，則采用萬(wàn)古霉素、利奈唑胺、替考拉寧E試驗(yàn)條測(cè)試MIC值確認(rèn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 21軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸球菌屬菌種分布

2015年1月—2020年12月我院共檢出腸球菌2396株，包括糞腸球菌(E.faecalis)11204株，屎腸球菌874株(E.faccium)，鶉雞腸球菌(E.gallinarum)123株，鳥(niǎo)腸球菌(E.avium)70株，鉛黃腸球菌(E.casselifavus)76株，海氏腸球菌(E.hirae)17株；棉子糖腸球菌(E.raffinosus)16株；耐久腸球菌(E.durans)15株；哥倫比亞腸球菌(E.columbae)1株；分布以糞腸球菌和屎腸球菌為主，糞腸球菌占50.25%，屎腸球菌占36.48%，鶉雞腸球菌占5.13%，而海氏腸球菌、棉子糖腸球菌、耐久腸球菌 以及哥倫比亞腸球菌占比均不足1%，見(jiàn)表1。

表1 2015—2020年分離腸球菌屬菌種基本情況Tab.1 Basic information of Enterococcus strains isolated from 2015 to 2020

2.2 腸球菌屬臨床標(biāo)本分布情況

2396株腸球菌臨床分離標(biāo)本中尿液共1070 株(占44.65%)，膽汁747株(占31.17%)，引流液263株(占10.97%)，血液97株(占4.05%)，分泌物67株(占2.79%)，膿液54株(占2.25%)，腹水27株(占1.13%)；而導(dǎo)管、痰液、胸水、腦脊液、前列腺液、關(guān)節(jié)液等檢出菌株少，占比不足0.5%。尿液標(biāo)本所占比例逐年下降，膿液、膽汁、引流液標(biāo)本所占比例上升。分離腸球菌屬臨床科室以外科為主，共1662株(占69.36%)，內(nèi)科462株(占19.28%)，ICU、急診183株(占7.64%)，兒科及婦科占比不足5%，見(jiàn)表2。

表2 2015—2020年腸球菌屬臨床標(biāo)本及科室分布Tab.2 Clinical specimens and department distribution of Enterococcus from 2015 to 2020

2.3 腸球菌對(duì)不同抗生素的藥敏情況

2015年1月—2020年12月屎腸球菌對(duì)左氧氟沙星耐藥率高于75%，對(duì)氨芐西林、紅霉素的耐藥率高于80%，對(duì)利奈唑胺、喹努普汀/達(dá)福普汀耐藥率低于10%，對(duì)替加環(huán)素、替考拉寧、萬(wàn)古霉素耐藥率低于5%。6年來(lái)屎腸球菌中共檢出VRE 9株，利奈唑胺耐藥株35株，替加環(huán)素耐藥株6株，替考拉寧耐藥株16株，高濃度鏈霉素耐藥率由59.2%下降至28.7%，呈現(xiàn)逐年下降趨勢(shì)(P＜0.001)，高濃度慶大霉素耐藥率從61.2%下降至28.8%(P＜0.001)，但呋喃妥因耐藥率由46.6%上升至61.5%(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

2015—2020年糞腸球菌對(duì)喹努普汀/達(dá)福普汀耐藥率均高于70%，對(duì)四環(huán)素耐藥率高于48%，對(duì)高濃度慶大霉素耐藥率高于20%，而環(huán)丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星、氨芐西林和青霉素G耐藥率則低于25%，呋喃妥因、替加環(huán)素和萬(wàn)古霉素耐藥率均低于4%。所有糞腸球菌中共檢出耐萬(wàn)古霉素菌株5株，替加環(huán)素耐藥株4株，見(jiàn)表3。縱觀6年整體耐藥率顯示屎腸球菌對(duì)高濃度鏈霉素、喹諾酮類、氨芐西林、青霉素G、呋喃妥因、紅霉素耐藥率明顯高于糞腸球菌(P＜0.001)，而糞腸球菌對(duì)四環(huán)素、喹努普汀/達(dá)福普汀的6年整體耐藥率高于屎腸球菌(P＜0.001)。

表3 屎腸球菌和糞腸球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率Tab.3 Drug resistance rate of E.faecium and E.faecalis to antibiotics

2015—2020年鉛黃腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥率達(dá)98%以上，紅霉素耐藥率高于90%，而對(duì)四環(huán)素、利奈唑胺耐藥率均低于15%，環(huán)丙沙星、莫西沙星、氨芐西林、呋喃妥因耐藥率均低于5%，所有菌株中未檢出替加環(huán)素以及高濃度慶大霉素耐藥株；鶉雞腸球菌對(duì)紅霉素、萬(wàn)古霉素耐藥率高于80%，對(duì)喹努普汀/達(dá)福普汀耐藥率高于50%，而對(duì)高濃度慶大霉素、莫西沙星、環(huán)丙沙星、氨芐西林、高濃度鏈霉素、呋喃妥因耐藥率均低于30%，對(duì)利奈唑胺耐藥率則低于10%，菌株中亦未檢出替加環(huán)素耐藥株；鳥(niǎo)腸球菌對(duì)四環(huán)素、氨芐西林耐藥率高于50%，對(duì)利奈唑胺、莫西沙星、環(huán)丙沙星、替加環(huán)素和萬(wàn)古霉素耐藥率低于10%，所有檢出鳥(niǎo)腸球菌菌株中發(fā)現(xiàn)耐替加環(huán)素菌株1株，見(jiàn)圖1。其他腸球菌屬分離出菌株數(shù)少，6年來(lái)不足20株，無(wú)明顯代表意義，故對(duì)其藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)不作統(tǒng)計(jì)和分析。

圖1 2015-2020年其他腸球菌屬對(duì)不同抗菌藥物的耐藥率Fig.1 Different antibiotic resistance rates of other Enterococcus genera

3 討論

腸球菌是革蘭陽(yáng)性、兼性厭氧球菌，可在10℃～45℃環(huán)境生長(zhǎng)，亦能在pH4.4～9.6范圍內(nèi)生長(zhǎng)，在6.5% NaCl的高鹽介質(zhì)中也能生長(zhǎng)[3]。腸球菌是人類和動(dòng)物的共生菌群，以前被認(rèn)為是臨床影響最小的微生物，現(xiàn)在已成為人類常見(jiàn)的機(jī)會(huì)致病菌[1]。作為最常見(jiàn)的院內(nèi)病原體之一，腸球菌可引起嚴(yán)重的感染和疾病，如心內(nèi)膜炎、菌血癥、泌尿系統(tǒng)、腹腔和盆腔感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等。縱觀中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)腸球菌檢出率呈逐年增加趨勢(shì)，從2015年檢出腸球菌共7876株，2016年檢出12759株腸球菌，2017年檢出16043株，到2018年檢出腸球菌株數(shù)高達(dá)18717株[4-7]。另一項(xiàng)研究關(guān)于2014—2018年加拿大70所醫(yī)院100萬(wàn)住院治療的患者回顧性分析結(jié)果表明，腸球菌檢出率顯著增加，其中VRE感染增加了148%[8]。這些結(jié)果的出現(xiàn)與近年抗菌藥物的不合理應(yīng)用、侵入性操作的大量開(kāi)展以及免疫抑制人群增多等諸多因素息息相關(guān)。中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)顯示逐年增多的腸球菌屬檢出均以屎腸球菌為主[4-7]，2015年檢出腸球菌菌株中糞腸球菌、屎腸球菌分別占42.7%和50.1%，兩者比例相當(dāng)，2018年檢出糞腸球菌、屎腸球菌分別占腸球菌株39.5%和52.8%，屎腸球菌檢出比例顯著上升。然而在我院連續(xù)6年檢出的2396株腸球菌中糞腸球菌占50.25%，屎腸球菌占36.48%，構(gòu)成比雖與全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)相近，但結(jié)果仍以糞腸球菌為主，考慮可能與我院腸球菌屬檢出標(biāo)本大部分來(lái)源于外科(占69.36%)，患者診治的疾病迥異以及對(duì)抗生素需求不同等因素有關(guān)。隨著導(dǎo)管、支架等侵入性治療在臨床被越來(lái)越多的應(yīng)用，腸球菌屬仍是引起尿路感染的第2大病原菌[3]。在本研究中，2396株腸球菌有1070株分離自臨床尿液標(biāo)本，占比44.65%，分析原因首先考慮腸球菌是泌尿道的定植菌，其次尿路感染的診斷絕大部分來(lái)自于中段尿培養(yǎng)提供的微生物證據(jù)，因此在尿路感染中腸球菌屬仍是重要的病原菌。但針對(duì)尿路感染患者的經(jīng)驗(yàn)性抗生素治療時(shí)，仍應(yīng)綜合評(píng)估患者情況決定是否覆蓋腸球菌。臨床上呼吸系統(tǒng)、腦脊液、前列腺和骨關(guān)節(jié)等不是腸球菌的常見(jiàn)定植部位，故上述部位檢出腸球菌菌株少，本研究檢出菌株分布結(jié)果也與之相符。

我院臨床分離的腸球菌對(duì)替加環(huán)素、替考拉寧、利奈唑胺和萬(wàn)古霉素普遍敏感，但鉛黃腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥率達(dá)98%，鶉雞腸球菌耐藥率高達(dá)85%，分析與這兩種菌屬都攜帶相同染色體基因簇，參與了vanC和vanT基因編碼合成的肽聚糖前體有關(guān)[9]，因此在治療這兩種細(xì)菌引起的疾病時(shí)應(yīng)避免使用萬(wàn)古霉素，通過(guò)合理選擇抗生素以積極遏制耐藥菌播散。另鉛黃腸球菌對(duì)呋喃妥因耐藥率低于5%，這與張娜等[10]的研究結(jié)果一致，呋喃妥因在尿液中藥物濃度較高，細(xì)菌耐藥率低，故可作為上述細(xì)菌引起尿路感染的經(jīng)驗(yàn)治療。鳥(niǎo)腸球菌對(duì)莫西沙星、環(huán)丙沙星、利奈唑胺、替加環(huán)素和萬(wàn)古霉素耐藥率低，但也已檢出替加環(huán)素、萬(wàn)古霉素耐藥株，臨床應(yīng)引起高度重視。耐萬(wàn)古霉素屎腸球菌、糞腸球菌株經(jīng)耐藥表型檢測(cè)或PCR檢測(cè)出常見(jiàn)的耐藥基因?yàn)関anA、vanB、vanM型，而其中vanA介導(dǎo)的耐藥性通常高于其他類型，并可引起細(xì)菌對(duì)替考拉寧的交叉耐藥。目前研究者已發(fā)現(xiàn)vanA基因簇可跨越種屬轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子播散至其他菌種，包括耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)的臨床分離株等，這些發(fā)現(xiàn)都強(qiáng)烈顯示耐萬(wàn)古霉素的基因簇可以跨越菌種屏障傳播，更深刻地提醒我們需積極阻止抗菌藥物的濫用，限制抗生素的選擇[11-12]。屎腸球菌被發(fā)現(xiàn)對(duì)多種抗生素有耐藥性，這一特點(diǎn)使其能在敏感微生物被抗生素清除時(shí)仍繼續(xù)存活并增殖，同時(shí)也是屎腸球菌能在院內(nèi)感染中獲得一席之地的重要原因。在本研究中，我院檢出的屎腸球菌對(duì)喹諾酮類、氨芐西林、紅霉素、呋喃妥因、高濃度鏈霉素和高濃度慶大霉素的耐藥率6年來(lái)持續(xù)處于高水平，但有逐年下降趨勢(shì)，提示近年臨床抗菌藥物使用合理，但基于總體的高水平耐藥率以及對(duì)多種抗生素耐藥的特點(diǎn)仍建議抗感染治療屎腸球菌時(shí)避免使用上述藥物。新型鏈陽(yáng)菌素喹努普汀/達(dá)福普汀對(duì)其耐藥率6年來(lái)均低于10%，提示臨床該藥可用于治療屎腸球菌引起的感染性疾病，但仍需注意藥物不良反應(yīng)。我院檢測(cè)出的糞腸球菌對(duì)喹諾酮類、青霉素G、氨芐西林和呋喃妥因總體耐藥率低，仍可作為治療糞腸球菌感染的首選藥物。雖然對(duì)高濃度鏈霉素、高濃度慶大霉素耐藥率高于20%，但值得慶幸的是，糞腸球菌對(duì)兩者的耐藥率呈逐年下降的變化，如臨床需要，亦可考慮氨芐西林聯(lián)合慶大霉素治療該菌，但方案應(yīng)結(jié)合感染部位進(jìn)行綜合選擇。越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)腸球菌可通過(guò)接合的方式，從質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、大片斷的染色體DNA等途徑獲取新的耐藥基因[13]，使定植菌群獲得更強(qiáng)的耐藥性，基于此希望在工作中盡可能根據(jù)藥敏情況合理選擇抗生素，避免細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)。從我院連續(xù)6年的耐藥率分析，除四環(huán)素、喹努普汀/達(dá)福普汀外，糞腸球菌整體耐藥率低于屎腸球菌，而對(duì)于利奈唑胺、替加環(huán)素及萬(wàn)古霉素兩者整體耐藥率無(wú)明顯變化。不同腸球菌屬細(xì)菌對(duì)不同抗生素耐藥率不同，即便同一種抗生素對(duì)不同的腸球菌屬細(xì)菌耐藥率也存在明顯差異，在臨床治療過(guò)程中，應(yīng)根據(jù)細(xì)菌臨床分布特點(diǎn)以及本院的耐藥性變遷合理選擇抗生素，防止耐藥菌的進(jìn)一步增長(zhǎng)。