梁 勇， 李良群， 王 麗， 周 浪， 楊小生*

( 1. 貴州醫(yī)科大學(xué)省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽 550002； 2. 貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽 550014； 3. 貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴陽 550025 )

刺梨()是一種薔薇科(Rosaceae)薔薇屬()多年生的落葉灌木植物，別名繅絲花、刺菠蘿和文先果等(代甜甜等，2015)，主要分布于我國西南地區(qū)，尤其以貴州省分布最為廣泛。刺梨的功效最早記載于1690年，《黔書》“味甘而微酸，食之可以已悶，亦可消滯積”。作為貴州民族藥材，先后收錄于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(1994版和2003版)中，具有消食健脾收斂止瀉的功效，主要用于治療積食腹脹、泄瀉、止痛等。刺梨的根莖具有治療急性細(xì)菌性痢疾和慢性胃潰瘍等作用(陳建中等，2001；陳云志和劉安英，2007)，它在貴州民間炎癥疾病均有廣泛應(yīng)用。在貴州荔波地區(qū)，瑤族老百姓常用刺梨根莖煎湯服用治療消化系統(tǒng)疾病和帶下病癥(余躍生等，2015；鄭志強(qiáng)等，2016)，以及治療豬、牛、羊等多種畜禽的痢疾泄瀉(羅茂川和白賢彩，2008)。刺梨根莖抗炎功效應(yīng)用在多個(gè)民族均有記載，如苗族用刺梨根治急性腸炎(邱德文和杜江，2005)。土家族用于治胃痛、中暑、食積腹脹、痢疾、腸炎等疾病(朱國豪，2006)。布依用刺梨根入藥，添加野蕎頭、魚鰍串適量水煎服以治胃痛(陸科閔，1992)。仡佬人民以刺梨根入藥，輔以石榴皮煎水服(日服 3 次)治上吐下瀉(潘爐臺(tái)等，2003)。

刺梨除了維生素C含量豐富之外，還含有豐富的多糖、黃酮、酚酸和三萜等活性成分(楊娟等，2006；張峻松等，2007)?，F(xiàn)代藥理研究表明，刺梨具有降血糖、抗菌、抗氧化和抗癌作用(汪磊，2019；梁夢(mèng)琳等，2019)。目前，有關(guān)刺梨根莖化學(xué)成分文獻(xiàn)報(bào)道不多，其化學(xué)成分的抗炎活性研究未見報(bào)道。基于刺梨根莖在貴州少數(shù)民族地區(qū)的實(shí)際應(yīng)用確切療效，為了進(jìn)一步闡明該民族藥的抗炎活性物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)開展刺梨根莖化學(xué)成分及其抗炎活性研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅為民族藥刺梨應(yīng)用提供科學(xué)根據(jù)，也為其后續(xù)刺梨活性成分的進(jìn)一步開發(fā)利用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

藥材：采自貴州省貴陽市白云區(qū)，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為薔薇科植物刺梨()的根莖，憑證標(biāo)本存于貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室功能中心(憑證標(biāo)本號(hào)：CL201901)。

細(xì)胞株：小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW 264.7)，購買于中喬新舟生物科技公司，在貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室功能中心凍存。

1.2 儀器

Hewiett Pakard110質(zhì)譜儀(美國惠普公司)，BrukerAM-600MHz核磁共振測(cè)試儀(美國布魯克公司)，倒置熒光顯微鏡(Nikon公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(ESCO公司)，-80 ℃超低溫冰箱(Thermo公司),多模式酶標(biāo)儀(PerkinElmer公司)。

1.3 試劑

柱色譜硅膠(60～100目，200～300目，300～400目，青島海洋化工廠)，Sephadex LH-20(美國GE公司)，二甲基亞砜(DMSO天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，PBS pH 7.4緩沖液、FBS胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(默克公司)，胰蛋白酶EDTA(生物工業(yè)以色列拜特海姆有限公司)，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)(默克公司)，地塞米松(dexamethasone)(默克公司)，NO 檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 提取與分離 新鮮刺梨根莖(40 kg)洗凈、切碎后，先用80%乙醇浸泡3 d，再用80%的乙醇熱回流提取3次，每次2 h，趁熱過濾，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，轉(zhuǎn)移到水浴鍋(60 ℃)濃縮為浸膏，浸膏0.65 kg。

對(duì)浸膏進(jìn)行硅膠柱層析分離，選用氯仿∶甲醇=(10∶1、5∶1、1∶1、0∶1)作洗脫劑，得到四個(gè)部分，分別為A部分11 g、B部分97 g、C部分69 g和D部分263 g。D部分采用氯仿甲醇=6∶1洗脫，得到D1和D2兩個(gè)亞流分。D1部分使用氯仿∶甲醇=8∶1洗脫，減壓濃縮甲醇重結(jié)晶得到化合物(40 mg)；對(duì)D2部分采用Sephadex LH-20凝膠色譜柱甲醇洗脫和硅膠柱氯仿∶甲醇=6∶1～4∶1洗脫，獲得化合物(200 mg)、化合物(25 mg)和化合物(18 mg)。C部分依次用氯仿∶甲醇=30∶1～20∶1～10∶1等度洗脫，得到C1、C2、C3三個(gè)亞流分。C1部分用氯仿∶甲醇=10∶1洗脫和甲醇重結(jié)晶得到化合物(65 mg)和(42 mg)；C3部分用氯仿∶甲醇=30∶1～20∶1梯度洗脫，重結(jié)晶得到化合物(16 mg)。B部分用氯仿∶甲醇=20∶1～10∶1梯度洗脫，重結(jié)晶得到化合物(35 mg)、(26 mg)、(15 mg)、(23 mg)、(15 mg)。A部分依次用石油醚∶乙酸乙酯=40∶1～30∶1～20∶1等度洗脫，得到化合物(15 mg)、化合物(25 mg)和化合物(18 mg)。其中，化合物-的結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖 1 化合物1-14結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of compounds 1-14

1.4.2 單體化合物對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響 采用MTT法(周晗等，2020)檢測(cè)單體化合物對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7活力的影響，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升2×10個(gè)，接種于96孔板中，每孔100 μL，在37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，加入不同濃度藥液作為給藥組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL的MTT(5 mg·mL)，4 h后吸取上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩10 min，在570 nm下檢測(cè)其吸光度值。

1.4.3 Griess法檢測(cè)RAW 264.7細(xì)胞NO釋放 采用LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7炎癥模型評(píng)價(jià)單體化合物抗炎活性，利用Griess試劑顯色法檢測(cè)NO釋放量(楊曉露等，2013)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升1×10個(gè)，接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，每孔加入不同濃度待測(cè)樣品，LPS的終濃度為1 μg·mL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)液上清，按NO試劑盒說明書操作，測(cè)定NO的釋放量。用酶標(biāo)儀在540 nm下測(cè)定吸光度值，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由GraphPad Prism 7生物統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算藥物對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7炎癥因子NO釋放的IC值。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物白色粉末。ESI-MS: 673.3 [M+Na], 分子式為CHO。H NMR (600 MHz,CDOD): 5.35 (1H, d,=12.0 Hz, glc-1), 5.32 (1H, br s, H-12), 2.52 (1H, s, H-18), 2.65 (1H, m, H-3), 1.35 (3H, s, CH-27), 1.20 (3H, s, CH-29), 0.98 (3H, d, CH-25), 0.97 (3H, d, CH-23), 0.92 (3H, d,=9.0Hz, CH-30), 0.84 (3H, s, CH-23), 0.75 (3H, s, CH-24) ;C NMR (150 MHz, CDOD): 42.5 (C-1), 67.3 (C-2), 80.1 (C-3), 39.6 (C-4), 49.2 (C-5), 22.6 (C-6), 34.2 (C-7), 41.5 (C-8), 48.5 (C-9), 39.4 (C-10), 24.5 (C-11), 129.5 (C-12), 139.5 (C-13), 42.8 (C-14), 29.5 (C-15), 26.5 (C-16), 48.5 (C-17), 55.2 (C-18), 73.5 (C-19), 43.0 (C-20), 27.3 (C-21) , 38.5 (C-22), 29.3 (C-23), 16.6 (C-24), 17.2 (C-25), 19.3 (C-26), 24.8 (C-27), 178.5 (C-28), 27.2 (C-29), 17.7 (C-30), 95.6 (C-1′), 73.5 (C-2′), 78.6 (C-3′), 71.3 (C-4′), 78.5 (C-5′), 62.5 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Yuan et al., 2019)基本一致，故鑒定化合物為刺梨苷。

化合物白色粉末。ESI-MS: 673.5 [M+Na], 分子式為CHO。H NMR (600 MHz, CDOD): 5.35 (1H, d,=12.0 Hz, glc-1), 5.32 (1H, br s, H-12), 2.50 (1H, s, H-18), 1.32 (3H, s, CH-27), 1.28 (3H, s, CH-29), 1.15 (3H, s, CH-25), 1.05 (3H, s, CH-23), 0.92 (3H, d,=7.5 Hz, CH-30), 0.80 (3H, s, CH-26), 0.75 (3H, s, CH-24);C NMR (150 MHz, CDOD): 48.2 (C-1), 69.5 (C-2), 84.2 (C-3), 39.2 (C-4), 56.5 (C-5), 19.7 (C-6), 34.0 (C-7), 41.5 (C-8), 48.6 (C-9), 40.6 (C-10), 24.8 (C-11), 129.5 (C-12), 139.7 (C-13), 42.8 (C-14), 29.5 (C-15), 26.5 (C-16), 48.5 (C-17), 55.0 (C-18), 73.5 (C-19), 43.0 (C-20), 27.3 (C-21), 36.9 (C-22), 29.3 (C-23), 17.6 (C-24), 16.5 (C-25), 17.5 (C-26), 24.9 (C-27), 178.5 (C-28), 28.6 (C-29), 25.2 (C-30), 95.8 (C-1′), 73.6 (C-2′), 78.2 (C-3′), 71.3 (C-4′), 78.5 (C-5′), 62.3 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(李曉強(qiáng)等，2008)基本一致，故鑒定化合物為野薔薇苷。

化合物白色粉末。ESI-MS: 511.2 [M+Na],分子式為CHO。H NMR (600 MHz, CDOD): 5.30 (1H, br s, H-12), 3.91 (1H, br d,=18.0 Hz, H-3), 3.31 (1H, overlop, H-2), 2.50 (1H, s, H-18), 1.35 (3H, s, CH-27), 1.28 (3H, s, CH-29), 1.18 (3H, s, CH-25), 0.98 (3H, s, CH-23), 0.92 (3H, d,=10.5 Hz, CH-30), 0.85 (3H, s, CH-26), 0.75 (3H, s, CH-24);C NMR (150 MHz, CDOD): 42.3 (C-1), 67.2 (C-2), 80.2 (C-3), 41.2 (C-4), 49.3 (C-5), 24.5 (C-6), 34.0 (C-7), 39.3 (C-8), 48.2 (C-9), 39.5 (C-10), 27.2 (C-11), 129.3 (C-12), 140.0 (C-13), 42.8 (C-14), 29.5 (C-15), 26.5 (C-16), 48.5 (C-17), 55.0 (C-18), 73.5 (C-19), 43.0 (C-20), 19.2 (C-21), 36.9 (C-22), 39.0 (C-23), 29.3 (C-24), 17.5 (C-25), 16.6 (C-26), 27.0 (C-27), 182.5 (C-28), 24.9 (C-29), 16.9 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(劉學(xué)貴等，2013)基本一致，故鑒定化合物為薔薇酸。

化合物黃色半固體。ESI-MS: 840.6 [M-H], 分子式為CHO。H NMR (600 MHz, CDOD): 4.45 (d, H-1a), 3.96 (dd, H-2a), 3.48 (m, H-3a), 3.83 (m, H-4a), 3.95 (m, H-5a), 3.15(d, H-6a), 5.08 (d, H-1b), 4.03 (dd, H-2b), 3.45 (m, H-3b), 3.85 (m, H-4b), 3.22 (d, H-5b), 4.63 (d, H-1c), 3.94 (m, H-2c), 3.46 (m, H-3c), 3.75 (m, H-4c), 3.25 (d, H-5c), 4.85 (br s, H-1d), 4.05 (dd, H-2d), 3.43 (m, H-3d), 3.73 (m, H-4d), 3.35 (d, H-5d), 4.83 (br s, H-1e), 4.05 (dd, H-2e), 3.46 (m, H-3e), 3.73 (m, H-4e), 3.30 (br s, H-5e), 4.50 (d, H-1f), 3.92 (dd, H-2f), 3.56 (m, H-3f), 3.60 (m, H-4f), 3.35 (d,H-5f);C NMR(150 MHz, CDOD): 99.5 (C-1a), 84.2 (C-2a), 69.8 (C-3a), 69.5 (C-4a), 76.5 (C-5a), 60.5 (C-6a), 94.2 (C-1b), 83.1 (C-2b), 76.3 (C-3b), 66.0 (C-4b), 62.5 (C-5b), 91.3 (C-1c), 83.1 (C-2c), 74.6 (C-3c), 64.9 (C-4c), 62.6 (C-5c), 98.5 (C-1d), 78.4 (C-2d), 73.8 (C-3d), 65.0 (C-4d), 62.6 (C-5d), 103.5 (C-1e), 78.1 (C-2e), 73.1 (C-3e), 72.0 (C-4e), 64.5 (C-5e), 105.5 (C-1f), 77.3 (C-2f), 71.2 (C-3f), 63.8 (C-4f), 63.5 (C-5f)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Ill et al., 2014)基本一致，故鑒定為化合物為-D-glucopyranosyl-(2a→1b)-2a---L-arabinopyranosyl-(2b→1c)-2b---L-arabinopyranosyl-(2c→1d)-2c---L-arabinopyranosyl- (2d→1e)-2d---L-arabinopyrano-syl-(2e→1f)-2e---L-arabinopyranoside。

化合物黃色粉末。ESI-MS: 289.2 [M-H], 分子式為CHO。H NMR (600 MHz, CDOD): 8.03 (4H, s, OH×4), 4.55 (1H, d,=10.5 Hz, H-2), 5.95 (1H, d,=2.25 Hz, H-6), 6.01 (1H, d,=2.25 Hz, H-8), 6.91 (1H, br s, H-2′), 6.75 (1H, br d,=12Hz, H-5′), 6.81 (1H, d,=12 Hz, H-6′), 4.05 (1H, br s, OH×3);C NMR (150 MHz, CDOD): 82.5 (C-2), 68.2 (C-3), 28.5 (C-4) , 157.3 (C-5), 95.6 (C-6), 157.2 (C-7), 95.2 (C-8), 157.0 (C-9), 99.8 (C-10), 132.0 (C-1′), 115.5 (C-2′), 145.4 (C-3′), 145.3 (C-4′), 115.3 (C-5′), 119.3 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(楊秀偉等，2020)基本一致，故鑒定化合物為兒茶素。

化合物黃色針晶。ESI-MS: 919.5 [2M+Na], 分子式為CHO。H NMR (600 MHz, DMSO-): 7.55 (1H, s, H-5), 7.72 (1H, s, H-5′), 3.95 (3H, s, -OCH), 5.00 (1H, d,=14 Hz, H-1");C NMR(150 MHz, DMSO-): 113.2 (C-1), 141.5 (C-2), 140.1 (C-3), 152.4 (C-4), 111.3 (C-5), 111.3 (C-6), 158.7 (C-7), 114.1 (C-1′), 141.7 (C-2′), 135.5 (C-3′), 146.5 (C-4′), 107.3 (C-5′), 111.4 (C-6′), 158.5 (C-7′), 60.9 (C-OCH), 102.5 (C-1"), 72.5 (C-2"), 75.3 (C-3"), 69.2 (C-4"), 65.1 (C-5")。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(孔令義等，2009)基本一致，故鑒定化合物為3--methylellagic acid-4′---D-xylopyranoside。

化合物黃色針晶。ESI-MS: 461.2 [M-H], 分子式為CHO。H NMR (600 MHz, DMSO-): 7.48 (1H, s, H-5), 7.60 (1H, s, H-5′), 3.95 (3H, s, -OCH), 5.42 (1H, s, H-1");C NMR (150 MHz, DMSO-): 107.3 (C-1), 140.1 (C-2), 136.2 (C-3), 146.5 (C-4), 111.3 (C-5), 111.5 (C-6), 158.7 (C-7), 114.1 (C-1′), 141.7 (C-2′), 141.6 (C-3′), 152.6 (C-4′), 111.6 (C-5′), 113.0 (C-6′), 158.5 (C-7′), 60.9 (C-OCH), 100.3 (C-1"), 70.2 (C-2"), 70.5 (C-3"), 71.5 (C-4"), 69.8 (C-5"), 17.8 (C-6")。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Guan et al., 2007)基本一致，故鑒定化合物為3--methylellagic acid-4′---L-rhamnopyranoside。

化合物白色粉末。ESI-MS: 511.3 [M+Na], 分子式為CHO。H NMR (600 MHz, CDOD): 5.20 (1H, br s, H-12), 4.38 (1H, m, H-2), 3.41 (1H, overlop, H-3), 2.48 (1H, s, H-18), 1.28 (3H, s, CH-27), 1.06 (3H, s, CH-29), 0.92 (3H, s, CH-25), 0.88 (3H, s, CH-23), 0.68 (3H, s, CH-26) ,0.82(3H, d,=10.5 Hz, CH-30), 0.65 (3H, s, CH-24);C NMR (150 MHz, CDOD): 47.5 (C-1), 67.2 (C-2), 82.5 (C-3), 38.9 (C-4), 55.2 (C-5), 18.4 (C-6), 32.4 (C-7), 40.0 (C-8), 46.8 (C-9), 38.7 (C-10), 23.5 (C-11), 127.0 (C-12), 138.9, (C-13), 41.5 (C-14), 28.3 (C-15), 25.6 (C-16), 47.3 (C-17), 53.5 (C-18), 71.8 (C-19), 41.6 (C-20), 26.1 (C-21), 37.5 (C-22), 29.2 (C-23), 16.5 (C-24), 16.4 (C-25), 18.4 (C-26), 24.2 (C-27), 179.2 (C-28), 26.7 (C-29), 17.4 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(楊秀偉和趙靜，2003)基本一致，故鑒定化合物為委陵菜酸。

化合物白色粉末。ESI-MS: 479.4 [M+Na], 分子式為CHO。H NMR (600 MHz, CDCl): 4.65 (1H, br s, H-29a), 4.52 (1H, s, H-29b), 3.10 (1H, dd,=11.2Hz, H-3), 1.65 (3H, s, H-30), 0.95 (3H, s, H-23), 0.86 (3H, s, H-26), 0.78 (3H, s, H-25), 0.68 (3H, s, H-24);C NMR (150 MHz, CDCl): 38.5 (C-1), 27.2 (C-2), 79.3 (C-3), 38.5 (C-4), 55.2 (C-5), 17.9 (C-6), 34.5 (C-7), 40.5 (C-8), 50.3 (C-9), 37.2 (C-10), 22.5 (C-11), 25.7 (C-12), 37.3 (C-13), 43.0 (C-14), 27.2 (C-15), 32.2 (C-16), 57.8 (C-17), 45.5 (C-18), 49.6 (C-19), 149.7 (C-20), 29.0 (C-21), 37.5 (C-22), 27.5 (C-23), 15.2 (C-24), 16.0 (C-25), 16.2 (C-26), 15.2 (C-27), 181.2 (C-28), 109.2 (C-29), 19.5 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Simin et al., 2007)基本一致，故鑒定化合物為樺木酸。

化合物白色粉末。ESI-MS: 495.3 [M+Na], 分子式為CHO。H NMR (600 MHz, CDOD): 5.33 (1H, br s, H-12), 3.15 (1H, overlop, H-3), 3.10(1H, s, H-18), 1.28 (3H, s, CH-27), 1.06 (3H, s, CH-29), 0.92 (3H, s, CH-25), 1.02 (3H, s, CH-23), 0.98 (3H, s, CH-30), 0.78 (3H, s, CH-26), 0.82 (3H, s, CH-24);C NMR (150 MHz, CDOD): 38.5 (C-1), 26.8 (C-2), 78.6 (C-3), 38.5 (C-4), 55.5 (C-5), 18.4 (C-6), 32.8 (C-7), 39.5 (C-8), 47.6 (C-9), 37.2 (C-10), 23.9 (C-11), 123.5 (C-12), 143.5 (C-13), 41.5 (C-14), 28.3 (C-15), 27.5 (C-16), 45.5 (C-17), 44.2 (C-18), 81.3 (C-19), 34.9 (C-20), 28.5 (C-21), 32.8 (C-22), 27.6 (C-23), 15.1 (C-24), 14.5 (C-25), 16.6 (C-26), 24.2 (C-27), 181.2 (C-28), 27.5 (C-29), 24(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Xiao et al., 2011)基本一致，故鑒定化合物為spinosic acid。

化合物白色粉末。ESI-MS: 511.1 [M+Na], 分子式為CHO。H NMR (600 MHz, CDOD): 5.30 (1H, br s, H-12), 3.95 (1H, br d,=16.5 Hz, H-3), 3.63 (1H, m, H-2), 2.48 (1H, s, H-18), 1.28 (3H, s, CH-27), 1.15 (3H, s, CH-29), 1.01 (3H, s, CH-25), 0.96 (3H, s, CH-23), 0.92 (3H, d,=10.5 Hz, CH-30), 0.78 (3H, s, CH-26), 0.76 (3H, s, CH-24);C NMR (150 MHz, CDOD): 47.5 (C-1), 69.5 (C-2), 84.2 (C-3), 40.5 (C-4), 56.5 (C-5), 19.3 (C-6), 33.8 (C-7), 40.5 (C-8), 48.1 (C-9), 39.0 (C-10), 23.9 (C-11), 124.5 (C-12), 140.1 (C-13), 42.5 (C-14), 29.2 (C-15), 29.4 (C-16), 46.1 (C-17), 45.3 (C-18), 82.4 (C-19), 34.0 (C-20), 29.2 (C-21), 36. (C-22), 28.7 (C-23), 17.6 (C-24), 16.8 (C-25), 17.4 (C-26), 24.9 (C-27), 182.4 (C-28), 28.5 (C-29), 24.6(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(張永紅等，2005)基本一致，故鑒定化合物為arjunic acid。

化合物白色針晶。ESI-MS: 437.5 [M+Na], 分子式為CHO。H NMR (600 MHz, CDCl): 5.15 (1H, s, 6-H), 6.81 (1H, d,=12.0 Hz, H-3), 0.85 (7H, d,=6.9 Hz, H-2, H-26, H-9), 0.75 (1H, d,=6.4 Hz, H-27);C NMR (150 MHz, CDCl): 37.4 (C-1), 29.8 (C-2), 71.5 (C-3), 42.2 (C-4), 141.1 (C-5), 121.7 (C-6), 31.3 (C-7), 32.5 (C-8), 50.3 (C-9), 36.5 (C-10), 21.3 (C-11), 39.5 (C-12), 42.5 (C-13), 56.6 (C-14), 24.4 (C-15), 28.5 (C-16), 56.2 (C-17), 12.1 (C-18), 19.5 (C-19), 36.3 (C-20), 18.5 (C-21), 34.1 (C-22), 26.2 (C-23), 46.0 (C-24), 29.2 (C-25), 19.6 (C-26), 19.1 (C-27), 23.2 (C-28), 11.8 (C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(黃綠等，2020)基本一致，故鑒定化合物為-谷甾醇。

化合物白色粉末。ESI-MS: 599.7 [M+Na], 分子式為CHO。H NMR (600 MHz, DMSO-): 5.35 (1H, br s, H-6), 4.56 (1H ,d,=15 Hz ,H-1′);C NMR (150 MHz, DMSO-): 37.6 (C-1), 30.3 (C-2), 78.3 (C-3), 39.2 (C-4), 141.1 (C-5), 122.2 (C-6), 32.3 (C-7), 32.1 (C-8), 50.3 (C-9), 36.5 (C-10), 21.3 (C-11), 39.5 (C-12), 42.6 (C-13), 56.5 (C-14), 24.6 (C-17), 12.3 (C-18), 19.2 (C-19), 36.5 (C-20), 19.0 (C-21), 34.3 (C-22), 26.3 (C-23), 46.3 (C-24), 29.5 (C-25), 19.6 (C-26), 19.6 (C-27), 23.5 (C-28), 12.3 (C-29), 102.5 (C-1′), 75.3 (C-2′), 78.6 (C-3′), 71.8 (C-4′), 78.2 (C-5′), 62.5(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(詹慶豐和夏增華，2005)基本一致，故化合物鑒定為-胡蘿卜苷。

化合物油狀液體。ESI-MS: 429.3 [M-H], 分子式為CHO。H NMR (600 MHz, CDCl): 2.58 (2H, t,=10.2 Hz, H-4), 2.12 (3H, s, H-7a), 2.06 (6H, s, H-5a, H-8a), 1.73 (2H, m, H-3), 1.25 (3H, s, H-2a), 0.86 (3H, d,=10.2 Hz, H-12′a), 0.86 (3H, d,=10.2Hz, H-13′), 0.83 (3H, d,=9.6 Hz, H-4′a), 0.82 (3H, d,=9.6 Hz, H-8′a);C NMR (150 MHz, CDCl)：145.6 (C-9), 144.5 (C-6), 122.5 (C-8), 121.2 (C-7), 118.5 (C-5), 117.3 (C-10), 74.5 (C-2), 39.6 (C-1′), 39.4(C-11′), 37.5(C-3′), 37.4(C-5′), 37.4(C-7′), 37.3(C-9′), 32.6(C-4′), 32.6(C-8′), 31.5(C-3), 27.9 (C-12′), 24.5 (C-10′), 24.4 (C-6′), 23.8 (C-2a), 22.5 (C-12′a), 22.6 (C-13′), 21.2 (C-2′), 20.5 (C-4), 19.7 (C-4′a), 19.6 (C-8′a), 12.3 (C-7a), 11.5 (C-8a), 11.2 (C-5a)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Kyeong et al., 2013)基本一致，故化合物鑒定為-tocopherol。

化合物油狀液體。ESI-MS: 389.4 [M+Na], 分子式為CH。H NMR (600 MHz, CDCl): 1.25 (54H, m, H-2～25), 0.88 (6H, t,=8.4Hz, H-1, 26);C NMR (150 MHz, CDCl): 14.1 (C-1, 6), 22.7 (C-2, 25), 29.5 (C-5, 22), 29.5 (C-6～C-21), 31.9 (C-3, 4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(葉鳳梅等，2015)基本一致，故化合物鑒定為正二十六烷。

2.2 單體化合物對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力影響

由圖2可知，與空白對(duì)照組相比，化合物≤50 μmol·L時(shí)，細(xì)胞活力均大于90%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)單體化合物濃度≤50 μmol·L時(shí)，對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞無明顯毒性，因此，我們選用藥物的最高濃度為50 μmol·L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A-G表示化合物1-7。下同。與空白組相比，*P<0.05， **P<0.01，***P<0.001。A-G indicate compounds 1-7. The same below. Compared with the blank group, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. 圖 2 各化合物對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響Fig. 2 Effects of compounds on cell viabilities of RAW 264.7

2.3 單體化合物對(duì)RAW 264.7細(xì)胞NO釋放的影響

本實(shí)驗(yàn)利用LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞構(gòu)建體外炎癥模型，采用Griess法檢測(cè)細(xì)胞上清中NO的釋放量。實(shí)驗(yàn)需確保藥物濃度對(duì)細(xì)胞無明顯毒性情況下進(jìn)行，否則會(huì)造成假陽性的結(jié)果，當(dāng)RAW 264.7細(xì)胞受到LPS刺激后，會(huì)出現(xiàn)“炎癥小瀑布”，大量釋放炎癥因子NO。由圖3可知，LPS刺激后NO釋放顯著高于空白組(<0.001)，表明造模成功。與LPS組相比，化合物-在濃度3.125、6.25、12.5、25、50 μmol·L和地塞米松在濃度0.39、1.56、6.25、25、100 μmol·L條件下均可降低NO釋放量，且呈劑量依賴關(guān)系。通過計(jì)算化合物-和地塞米松在相應(yīng)濃度下的IC值可知，其對(duì)應(yīng)的IC值分別為25.07、24.56、17.65、9.87、16.67、40.83、34.98、22.46 μmol·L，由此可說明化合物、、有較好的體外抗炎活性，略優(yōu)于地塞米松，化合物、、、表現(xiàn)出一定抗炎活性。

H表示地塞米松，LPS終濃度為1 μg·mL-1。與空白組相比，###P<0.001; 與模型組相比，*P<0.05， **P<0.01， ***P<0.001。H indicates dexamethasone, and the final concentration of LPS is 1 μg·mL-1. Compared with the blank group, ###P<0.001; Compared with the model group, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.圖 3 單體化合物對(duì)RAW 264.7細(xì)胞NO釋放影響Fig. 3 Effects of monomeric compounds on NO production in RAW 264.7 cells

3 討論與結(jié)論

本研究從刺梨根莖部位分離鑒定15個(gè)化合物，包括五環(huán)三萜類(7個(gè))、鞣花酸類(2個(gè))、甾醇類(2個(gè))、黃酮類(1個(gè))、寡糖(1個(gè))、多酚(1個(gè))和脂肪烴(1個(gè))。其中，化合物、、為首次從刺梨中分離得到。在刺梨根莖化學(xué)成分中，刺梨苷和野薔薇苷(化合物、)的含量最高，2個(gè)三萜化合物在新鮮藥材中含量達(dá)0.075%。

民族藥在預(yù)防和治療炎癥性疾病中發(fā)揮著重要作用，具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同調(diào)控作用。民族藥刺梨在貴州省資源最為豐富且在民間有著廣泛應(yīng)用歷史。從化合物、、的抗炎活性可以看出，刺梨三萜苷元抗炎活性優(yōu)于三萜皂苷，進(jìn)一步證實(shí)刺梨五環(huán)三萜28位游離羧酸活性較好，該發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)道一致(薛永，2018)?；衔?對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞NO釋放均有比較明顯的抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系。其中，化合物、、有較好的體外抗炎活性，略優(yōu)于地塞米松，化合物、、、表現(xiàn)出一定抗炎活性。證實(shí)了刺梨與薔薇科屬植物金櫻子有相似的抗炎作用，而其機(jī)理有待于進(jìn)一步深入。刺梨三萜作為刺梨根莖主要活性成分，并在增強(qiáng)免疫力、延緩衰老、抗動(dòng)脈粥樣硬化、健胃消食等方面均具有較好的活性。刺梨根莖的鞣花酸類化合物、的IC值分別為40.83、34.98 μmol·L，抗炎效果相對(duì)于刺梨三萜較差，其抗炎機(jī)制可能是下調(diào)炎癥相關(guān)因子的基因表達(dá)，抑制促炎細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的分泌，從而發(fā)揮抗炎作用。鞣花酸類化合物是一種天然的多酚類物質(zhì)，能滋養(yǎng)肌膚(高新鵬和張立華，2020)，因此該物質(zhì)在化妝品的研發(fā)中值得重視。本研究顯示出三萜類、鞣花酸類、黃酮類和寡糖類化合物是刺梨根莖發(fā)揮抗炎作用的主要有效成分，同時(shí)驗(yàn)證了刺梨根莖在貴州少數(shù)民族區(qū)域的民間抗炎功效。因此，對(duì)刺梨化學(xué)成分及其藥理活性進(jìn)一步研究，為刺梨開發(fā)成為抗腸道炎癥及獸藥奠定基礎(chǔ)。

感謝中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室核磁室提供的數(shù)據(jù)，同時(shí)感謝課題組研究助理對(duì)實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)，由衷感謝他們對(duì)本次實(shí)驗(yàn)的幫助。