任玉玲， 趙 艷， 趙成周， 李 萍*

( 1. 青海大學(xué) 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院， 西寧 810016； 2. 青海大學(xué) 藏醫(yī)學(xué)院/青海大學(xué)藏醫(yī)藥研究中心， 西寧 810016 )

WD40(WD40 domain-containing proteins)蛋白又被稱作為WD-repeat蛋白，此類蛋白的WD基序含有40～60個氨基酸殘基，一般由4～10個高度保守的串聯(lián)重復(fù)的WD組成，其N端是甘氨酸組氨酸二肽(Gly-His，GH)，C端是色氨酸天冬氨酸二肽(Trp-Asp，WD)，廣泛存在于真核生物中(Gachomo et al., 2014)。WD40家族蛋白可以參與調(diào)節(jié)眾多生物學(xué)過程，如細(xì)胞分裂、凋亡、分生組織、花的發(fā)育、細(xì)胞骨架組裝、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、染色體修飾和光的信號傳導(dǎo)等(Stirnimann et al., 2010; Mishra et al., 2014; Zhang & Zhang, 2015)。WD40蛋白的一個共同特征是作為支架蛋白介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)-DNA的相互作用，形成動態(tài)復(fù)合物(Xu & Min, 2011)，如在擬南芥()中發(fā)現(xiàn)WD40家族成員TTG1(transparent testa glabra1)可結(jié)合R2R3-MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子，形成MYB-bHLH-WD40(MBW)復(fù)合物，進(jìn)一步影響下游基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)毛狀體的起始、根毛的形成、類黃酮的生物合成等過程；此外，也可形成TTG1-TT2-GL2三元復(fù)合物對種子發(fā)育過程中脂肪酸、蛋白質(zhì)等貯藏物質(zhì)的積累起到負(fù)調(diào)作用(Zhang et al., 2003; Tsuchiya et al., 2004; Chen et al., 2015; Wei et al., 2019; Yang et al., 2021)。此前，已經(jīng)對擬南芥、棉花()、水稻()、小麥()、桃子()等多個物種的WD40蛋白家族進(jìn)行了全基因組的鑒定(Nocker & Ludwig, 2003; Ouyang et al., 2012; Hu et al., 2018; Salih et al., 2018; Feng et al., 2019)，但多刺綠絨蒿40基因家族還未被鑒定。

多刺綠絨蒿()屬于罌粟科，為一年生草本植物，分布于西藏、青海、甘肅等地。其花鮮艷，有較高的觀賞價值(楊永昌，1991)。此外，多刺綠絨蒿作為傳統(tǒng)藏藥材全草入藥，具有清熱、止痛、活血化瘀的功效，藏醫(yī)用于治療頭傷、骨折、胸背疼痛等(帝瑪爾·丹增彭措，2012)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究主要集中于抗癌、抗病毒、心臟保護(hù)等方面(郭志琴，2014)。植物的次生代謝物是抵抗外界不利環(huán)境的重要物質(zhì)，也是藥用活性成分的主要來源，因此，次生代謝物的積累與其生長環(huán)境條件緊密相關(guān)。青藏高原極其特殊的生長環(huán)境，包括高海拔、空氣稀薄、晝夜溫差大、紫外線強烈等導(dǎo)致多刺綠絨蒿富含生物堿、黃酮、萜類等次生代謝物，其中生物堿是其特征性成分(趙鳳等，2017)。雖然已有研究表明WD40轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)花青素、黃酮、丹參酮等次生代謝物的積累(Broun, 2005; Ramsay & Glover, 2005; Gutierrez & Torres, 2019; Li et al., 2019; 馬文，2019; Meng et al., 2019; Shan et al., 2019)，但是WD40轉(zhuǎn)錄因子在生物堿積累中的作用及其詳細(xì)機制還未見相關(guān)報道，因此，本研究對多刺綠絨蒿40基因家族進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組鑒定，并進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析，以期為多刺綠絨蒿40基因家族在其響應(yīng)逆境脅迫和其次生代謝物積累等方面的功能研究提供重要理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組測序

本實驗中所用開花期的多刺綠絨蒿整株樣品采摘于青海省湟中縣群加鄉(xiāng)(101°18′19.1″ E，36°11′4.89″ N，海拔4 553.3 m)，由青海大學(xué)趙成周副教授鑒定為多刺綠絨蒿，樣品用液氮保存送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序，后續(xù)分析基于此測序結(jié)果數(shù)據(jù)。

1.2 WD40蛋白序列的獲取與鑒定

從多刺綠絨蒿轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中篩選出含有40基因的數(shù)據(jù)，利用在線預(yù)測網(wǎng)站ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)搜索獲取具有完整CDS的WD40轉(zhuǎn)錄因子序列。通過本地BLAST比對剔除無WD40結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。

1.3 多刺綠絨蒿WD40轉(zhuǎn)錄因子蛋白特征分析

利用ExPASy protparam tool分析WD40蛋白理化性質(zhì)，包括氨基酸數(shù)目、蛋白分子量、理論等電點、不穩(wěn)定系數(shù)、親水性平均系數(shù)；利用wolf-psort (https://www.genscript.com/wolf-psort.html)預(yù)測蛋白亞細(xì)胞定位；利用Prabi預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)，包括α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲。

1.4 多刺綠絨蒿WD40蛋白家族成員的基序分布及基因結(jié)構(gòu)

通過在線程序SMART對WD40蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析篩選；利用MEME對19個WD40蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，保守性基序的數(shù)目限制選擇10，其他參數(shù)均采用默認(rèn)值。

1.5 多刺綠絨蒿WD40蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI中下載罌粟()、博落回()、唐松草()、青蒿()、銀杏()、大豆()的WD40蛋白質(zhì)序列，利用MEGA 7軟件中的鄰接法(neighbor joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。其中，bootstrap設(shè)置參數(shù)1 000次重復(fù)，得到的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹數(shù)據(jù)在iTOL(https://itol.embl.de/)網(wǎng)站進(jìn)行可視化展示。

1.6 WD40基因啟動子順式作用元件分析

從40基因家族的全長序列中提取ATG上游1 000 bp的一段序列作為啟動子區(qū)域進(jìn)行匯總，利用PlantCARE (http://bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html/)對啟動子順式作用元件進(jìn)行在線分析，通過TBtools軟件進(jìn)行可視化展示。

1.7 WD40蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

將鑒定出的多刺綠絨蒿WD40蛋白序列上傳到SWISS-MODEL在線網(wǎng)站(https://swissmodel.ex-pasy.org/interactive)預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)。

1.8 WD40蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

將多刺綠絨蒿WD40蛋白質(zhì)序列添加至STRING數(shù)據(jù)庫并指定與擬南芥同源蛋白進(jìn)行比較，利用最高相似分?jǐn)?shù)的一組蛋白構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多刺綠絨蒿WD40蛋白基本信息及理化性質(zhì)分析

從多刺綠絨蒿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中得到24個候選WD40蛋白序列，經(jīng)過BLAST比對及SMART結(jié)構(gòu)域預(yù)測軟件共篩選出19條候選WD40序列。利用ExPASy protparam tool分析多刺綠絨蒿WD40蛋白的基本性質(zhì)，預(yù)測結(jié)果(表1)顯示：多刺綠絨蒿19個40基因編碼的蛋白氨基酸數(shù)目為109～758 aa，19個WD40蛋白的分子量介于11 830～84 130 Da之間；19個WD40蛋白中理論等電點(PI)最大值為9.56 (Mh_transcript_33640)，最小值為4.37 (Mh_transcript_11768)，平均PI為6.46。其中14個蛋白的PI小于7，說明多數(shù)多刺綠絨蒿WD40蛋白表現(xiàn)為酸性；亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)大多數(shù)(13個)WD40蛋白定位于細(xì)胞核中，其余定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞骨架及過氧化物酶體中，而Mh_transcript_12870蛋白是在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中共定位的；蛋白的親、疏水性分析發(fā)現(xiàn)，19個WD40蛋白的脂肪系數(shù)均小于100，為親水性蛋白；多刺綠絨蒿WD40轉(zhuǎn)錄因子家族中有15個WD40蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)大于40，表明多刺綠絨蒿WD40轉(zhuǎn)錄因子家族大多為不穩(wěn)定蛋白；預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)，α-螺旋占比20.03%，β-轉(zhuǎn)角占比7.56%，無規(guī)則卷曲和延伸鏈分別占比45.10%和27.32%，從結(jié)果來看，多刺綠絨蒿WD40蛋白以無規(guī)則卷曲和延伸鏈為主要結(jié)構(gòu)，α-螺旋及β-轉(zhuǎn)角為次要結(jié)構(gòu)。

表 1 WD40蛋白理化性質(zhì)分析Table 1 Analysis of the physicochemical characteristics of WD40 protein

2.2 多刺綠絨蒿WD40轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域鑒定及基序分析

通過在線程序SMART對多刺綠絨蒿WD40轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析對比，結(jié)果如圖1所示，19個多刺綠絨蒿WD40蛋白具有共同的保守結(jié)構(gòu)域WD40， 且數(shù)量在1～7之間分布。此外，Mh_transcript_12870和Mh_transcript_16028轉(zhuǎn)錄因子還含有LisH結(jié)構(gòu)域和CTLH結(jié)構(gòu)域。

深綠色三角代表WD40保守結(jié)構(gòu)域，褐色菱形代表LisH結(jié)構(gòu)域，淺綠色方塊代表CTLH結(jié)構(gòu)域。The dark green triangle represents the conserved WD40 domain, the brown diamond represents the LisH domain, and the light green square represents the CTLH domain.圖 1 WD40蛋白家族結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig. 1 WD40 protein family domain prediction

為確定WD40蛋白的功能特征，利用在線軟件MEME (http://meme-suite.org/)搜索19個多刺綠絨蒿WD40蛋白共有的保守基序，共得到10個保守元件(圖2：A)，記作motif1～motif10；其中motif2存在于所有多刺綠絨蒿WD40蛋白中，是這10個基序中最保守的基序，其次是motif1。此外，通過分析10個基序分布規(guī)律發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Mh_transcript_19179所含的motif數(shù)量最多(8個)，而最少的只含有1個motif (Mh_transcript_16028)(圖2：B)。

A. 保守元件; B. 基因結(jié)構(gòu)。A. Conserved element; B. Gene structure.圖 2 多刺綠絨蒿WD40基因家族保守元件和基因結(jié)構(gòu)分析Fig. 2 Analysis of conserved elements and gene structures of Meconopsis horridula WD40 gene family

2.3 多刺綠絨蒿WD40蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI中通過BLAST比對查找罌粟、博落回、唐松草、青蒿、銀杏、大豆6個物種的WD40蛋白序列，利用MEGA 7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示，根據(jù)氨基酸序列相似性，進(jìn)化樹分析將WD40蛋白聚為I～X個分支，而多刺綠絨蒿WD40蛋白主要分布在分支I、II、III、IV中，并且與罌粟和博落回的親緣關(guān)系更近。

Mh. 多刺綠絨蒿; Ps. 罌粟; Mc. 博落回; Tt. 唐松草; Aa. 青蒿; Gb. 銀杏; Gm. 大豆。Mh. Meconopsis horridula; Ps. Papaver somniferum; Mc. Macleaya cordata; Tt. Thalictrum thalictroides; Aa. Artemisia annua; Gb. Ginkgo biloba; Gm. Glycine max.圖 3 WD40系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Fig. 3 Phylogenetic relationship of WD40

2.4 多刺綠絨蒿WD40啟動子順式作用元件

為明確40基因家族可能的生物學(xué)功能和響應(yīng)特性，利用PlantCARE對家族各成員啟動子序列中包含的順式作用元件進(jìn)行了分析。由圖4可知，該基因家族含有多種脅迫及植物激素相關(guān)的順式作用元件，主要包括應(yīng)激響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件、干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件、生長素響應(yīng)元件、茉莉酸響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件。不同成員所含元件的種類與數(shù)量存在差異，例如Mh_transcript_31169共含有10個作用元件，其中有5個是光響應(yīng)元件，而最少的只含有1個作用元件。

上方比例尺表示基因啟動子長度，左側(cè)是基因名稱，右側(cè)是相關(guān)的作用元件。 The top scale represents the length of the gene promoter, the left is the gene name, and the right is the associated action element.圖 4 WD40家族啟動子順式調(diào)控元件分析Fig. 4 Analysis of WD40 family promoter cis regulatory elements

2.5 多刺綠絨蒿WD40蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

運用SWISS-MODEL在線網(wǎng)站對多刺綠絨蒿WD40蛋白家族三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，由圖5可知，多刺綠絨蒿WD40蛋白包含α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲及延伸鏈等空間構(gòu)象。

A. Mh_transcript_12870; B. Mh_transcript_16028; C. Mh_transcript_24103; D. Mh_transcript_31169; E. Mh_transcript_5116; F. Mh_transcript_11768; G. Mh_transcript_12787; H. Mh_transcript_18983; I. Mh_transcript_10891; J. Mh_transcript_12816; K. Mh_transcript_7218; L. Mh_transcript_33640; M. Mh_transcript_18156; N. Mh_transcript_18539; O. Mh_transcript_19179; P. Mh_transcript_27212; Q. Mh_transcript_7031; R. Mh_transcript_27838; S. Mh_transcript_4112.圖 5 WD40家族蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 5 Prediction of tertiary structure of WD40 family proteins

2.6 多刺綠絨蒿WD40蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

蛋白之間的互作對轉(zhuǎn)錄因子的活性及作用機制十分重要，本研究通過STRING在線網(wǎng)站，基于擬南芥同源蛋白互作數(shù)據(jù)構(gòu)建了多刺綠絨蒿WD40蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)，以便系統(tǒng)分析WD40的作用機制。本研究預(yù)測發(fā)現(xiàn)與多刺綠絨蒿WD40蛋白相互作用的蛋白有ASG2、SMU1、ATAN11、PWP2、RRP4等(圖6)，蛋白AT4G28450可能作為其互作的中心。

圖中彩色圓球分別表示不同的蛋白，彩色圓球內(nèi)部是該蛋白所對應(yīng)的三級結(jié)構(gòu)。不同蛋白之間的連線所代表的含義具體如下： 天藍(lán)色線. 從精選數(shù)據(jù)庫獲得; 紫色線. 實驗確定; 綠色線. 基因鄰域; 深藍(lán)色線. 基因共現(xiàn); 鵝黃色線. 文本數(shù)據(jù)挖掘; 黑色線. 共表達(dá); 淺藍(lán)色線. 蛋白同源。The colored sphere in the figure represents different proteins, and inside the colored sphere is the tertiary structure corresponding to the protein. The connecting wires between different proteins represent specifically as follows: Sky blue wire. From curated databases; Purple wire. Experimentally determined; Green wire. Gene neighborhood; Dark blue wire. Gene co-occurrence; Light yellow wire. Text mining; Black wire. Co-expression; Light blue wire. Protein homology.圖 6 WD40家族蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig. 6 The WD40 family protein-protein interaction (PPI) network

3 討論與結(jié)論

WD40蛋白家族能夠參與植物多個特定生物學(xué)過程，比如細(xì)胞骨架動態(tài)、配子發(fā)生、色素積累、毛狀體和根毛形成以及種子發(fā)育(Zeng et al., 2009; Gao et al., 2012; Zhao et al., 2013; Gachomo et al., 2014; Pattanaik et al., 2014)。此外，這些蛋白通常也響應(yīng)植物激素途徑和不同的環(huán)境脅迫(Zhu et al., 2008; Shi et al., 2011; Jiang et al., 2012)。因此，對該蛋白家族的鑒定可為后續(xù)深入研究這些蛋白在多刺綠絨蒿適應(yīng)極端環(huán)境、刺的形成和特色成分異喹啉生物堿積累等方面提供前期基礎(chǔ)，這些系列研究進(jìn)一步拓展WD40蛋白功能，并進(jìn)一步揭示其發(fā)揮特定生物學(xué)功能的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制，從而廣泛理解WD40蛋白家族在植物生長、發(fā)育以及環(huán)境適應(yīng)等方面的生物學(xué)功能。

本研究共鑒定到多刺綠絨蒿19個40基因，與紅花()(40個)(王剛等，2020)、黑果枸杞()(38個)、蓖麻()(182個)、桃(219個)、大豆(471個)等物種中鑒定的40基因數(shù)差異較大，這可能是由于多刺綠絨蒿屬于罌粟科植物，與上述植物分類上距離較遠(yuǎn)，特定的生長環(huán)境、次生代謝物和不同的形態(tài)特征都顯示多刺綠絨蒿和這些植物在進(jìn)化上發(fā)生了較大差異，而這些蛋白隨著植物的長期進(jìn)化也發(fā)生了不同程度的改變(Bian et al., 2017; Feng et al., 2019; 嚴(yán)莉等，2019; 茍亞夫等，2022)。而且發(fā)現(xiàn)多刺綠絨蒿WD40蛋白的氨基酸數(shù)量、等電點以及蛋白的高級結(jié)構(gòu)均存在差異，這與在許多植物中鑒定到的WD40蛋白一樣。由于WD40蛋白的功能涉及生長發(fā)育、次生代謝物積累和環(huán)境適應(yīng)等多種生物學(xué)過程，而且不同的生物學(xué)過程可能相互作用的蛋白也不相同，因此，多刺綠絨蒿不同的WD40蛋白可能是為執(zhí)行不同的生物學(xué)功能進(jìn)化形成的(盧成達(dá)等，2021)。不同WD40蛋白質(zhì)所含WD40基序數(shù)目也不同，而且部分蛋白質(zhì)同時含有其他的重要結(jié)構(gòu)域，這種現(xiàn)象在谷子WD40蛋白中也有發(fā)現(xiàn)，225個谷子WD40蛋白中有79個蛋白包含其他結(jié)構(gòu)域(Mishra et al., 2014)，這些其他結(jié)構(gòu)域的存在使WD40蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能更加多樣化，從而適應(yīng)更多的生物學(xué)過程或?qū)δ骋簧飳W(xué)過程進(jìn)行更加精準(zhǔn)的調(diào)節(jié)。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明多刺綠絨蒿WD40蛋白質(zhì)主要分布于細(xì)胞核中，這可能是核定位信號將其定位于細(xì)胞核中，從而對某些靶基因的轉(zhuǎn)錄起到激活或抑制作用。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，多刺綠絨蒿WD40與大豆、銀杏、青蒿、唐松草等的WD40的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而和同是罌粟科的罌粟、博落回相似度更高，這可能與進(jìn)化關(guān)系相近的植物存在相似的功能有關(guān)系，有研究表明罌粟、博落回和多刺綠絨蒿三種植物都具有特征性次生代謝物異喹啉生物堿(Fan et al., 2015; Guo et al., 2016; 趙鳳等，2017)，這些相關(guān)性以及這些植物是否還存在其他相近的功能還需要進(jìn)一步的實驗探索。

啟動子響應(yīng)元件預(yù)測分析可以初步了解特定基因?qū)υS多因素的響應(yīng)機制，是研究植物基因功能的最主要手段之一。啟動子順式調(diào)控元件分析表明多刺綠絨蒿40基因家族可以響應(yīng)應(yīng)激、厭氧、干旱、光等非生物脅迫以及生長素、赤霉素、茉莉酸等激素信號。海南龍血樹(，Dc)40-1基因的啟動子區(qū)域具有典型真核生物啟動子結(jié)構(gòu)特征，包含多個能夠響應(yīng)激素和脅迫的作用元件，如CMRs、ABRE、TGA-box、TCA-element、ARE、HSE和LTR等，表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)40-1的表達(dá)受到茉莉酸甲酯、細(xì)胞分裂素、油菜素內(nèi)酯和UV-B的顯著影響(朱家紅等，2020)。此外，WD40蛋白通過復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)廣泛參與植物次生代謝調(diào)控、形態(tài)發(fā)育等過程(Feyissa et al., 2019; Meng et al., 2019; 王剛等，2019; Yuan et al., 2019)。如在黃酮及類黃酮化合物的生物合成過程中WD40轉(zhuǎn)錄因子與MYB和bHLH互作后起調(diào)控作用(Broun, 2005; Ramsay & Glover, 2005; Shan et al., 2019)；miR156/SPL13和WD40-1相互作用調(diào)節(jié)紫花苜蓿()的耐旱性(Feyissa et al., 2019)；MtWD40-1和WHITEPETAL1、MtTT8結(jié)合可以對類胡蘿卜素衍生以及花色素積累過程進(jìn)行調(diào)控(Meng et al., 2019)；丹參40-170基因可以調(diào)節(jié)丹參中迷迭香酸、丹酚酸B、丹參酮IIA和隱丹參酮的含量(馬文，2019)。

總之，多刺綠絨蒿其生長環(huán)境特殊，外形有肉眼可見的毛狀刺，以及含有特征性成分異喹啉生物堿，這些生物學(xué)過程通常是由植物激素、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等因素形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)而決定最終的發(fā)生。對多刺綠絨蒿40基因家族的鑒定可為以后詳細(xì)研究這些基因在上述生物學(xué)過程中的作用及其詳細(xì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供前期基礎(chǔ)和后續(xù)研究方向。