李毅鵬， 潘爭紅， 符毓夏， 寧德生*， 李連春， 海 洪

( 1. 桂林理工大學 化學與生物工程學院， 廣西 桂林 541006； 2. 廣西植物功能物質與資源持續(xù)利用重點實驗室， 廣西壯族自治區(qū)中國科學院 廣西植物研究所， 廣西 桂林 541006 )

貓須草()為唇形科腎茶屬多年生草本植物，因其雄蕊酷似貓須，又名“腎茶”“貓須公”，傣名“雅糯妙”，是傣族傳統(tǒng)的藥食兩用植物(國家中醫(yī)藥管理管《中華本草》編委會，2005)。貓須草含有豐富的黃酮、酚酸、萜類、木脂素等成分(張永怡等，2021)，而且藥理學研究顯示該植物具有清熱利水，排石通淋的功效，通常用于治療急慢性腎炎和痛風等疾病，表明貓須草對炎癥性疾病具有較好療效(劉少會等，2017；謝招虎等，2019；郭銀雪等，2020)。目前，有關貓須草的文獻報道多側重于提取物活性篩選及其提取工藝研究，抗炎活性物質基礎研究較少。為了闡明該藥用植物的抗炎活性成分，本實驗采用活性追蹤的方法，對貓須草抗炎活性部位進行化學成分研究。結果從活性部位中分離得到10個化合物(圖1)，其中化合物、、-為首次從該植物中分離得到，通過體外抗炎活性篩選，明確該植物抗炎作用的活性部位及其物質基礎。本研究結果可為貓須草的開發(fā)利用提供科學依據。

圖 1 化合物1-10結構式Fig. 1 Structures of compounds 1-10

1 材料與儀器

1.1 材料

貓須草采自廣東羅定市龍灣鎮(zhèn)，經廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所蔣運生研究員鑒定為唇形科腎茶屬植物貓須草()的全草。憑證樣品存放于廣西植物功能物質與資源持續(xù)利用重點實驗室。

細胞株：RAW 264.7細胞(中國典型培養(yǎng)物保藏中心)。

1.2 儀器

500 MHz超導核磁共振波譜儀(瑞士 布魯克公司)；LC-MS-IT-TOF液相色譜質譜聯用儀(日本島津公司)；安捷倫 1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；XS205型精密分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；倒置顯微鏡(舜宇光學科技有限公司)；無菌操作臺(蘇凈集團蘇州安泰有限公司)；全波長多功能酶標儀(Bio Tek公司)；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)。

1.3 試劑

DMEM營養(yǎng)液和胎牛血清(ThermoFisher Scietific公司)；NO試劑盒(RnD Systems公司)；LPS(Sigma公司)；柱色譜和薄層色譜所用硅膠(青島海洋化工有限公司)； MCI填料(日本三菱化學公司)；Sephadex LH-20凝膠(Amershan Biosciences 公司)；色譜純乙腈(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；甲醇、95%乙醇、石油醚等試劑均為分析純(西隴化工股份有限公司)。

2 實驗方法

2.1 提取和分離

貓須草全草，陰干粉碎，稱取15.0 kg粗粉，加入95%乙醇浸提3次(45 L×3)，每次提取24 h，過濾，合并3次浸提液，50 ℃減壓回收溶液，得到浸膏162.5 g。取150 g浸膏用適量純水超聲溶解， 分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得到相應的提取物。對不同極性提取物進行體外抗炎試驗。根據抗炎活性和TLC分析結果，將石油醚和乙酸乙酯部位合并，過MCI柱純化，依次用體積分數為20%、40%、60%、80%、95%的甲醇梯度洗脫，收集各流分，50 ℃減壓濃縮，得到5個組分：20%(11.4 g)、40%(8.8 g)、60%(19.7 g)、80%(21.4 g)、95%(15.3 g)。

根據TLC分析結果，將60%和80%組分合并，過硅膠柱分離純化，用石油醚/乙酸乙酯(10∶1→0∶1，)洗脫，得到5個組分Fr.1～Fr.5。Fr.1 過硅膠柱純化，用石油醚/乙酸乙酯(5∶1→0∶1，)洗脫，經TLC檢視合并各流分，得到3個組分Fr.1-1～Fr.1-3。Fr.1-2 經硅膠、凝膠反復純化，得到化合物(8.3 mg)、(6.5 mg)、(5.3 mg)。Fr.2經凝膠柱分離(氯仿/甲醇=1∶1，)，得到4個組分Fr.2-1～Fr.2-4。Fr.2-2經高效液相色譜制備 [乙腈(A)/水(B)，25%～55% A，0～45 min]，得到化合物(9.2 mg)；Fr.2-3經硅膠反復純化(石油醚/乙酸乙酯=4∶1，)，得到化合物(9.5 mg)。Fr.3經凝膠柱分離(氯仿/甲醇=1∶1，)，得到5個組分Fr.3-1～Fr.3-5。Fr.3-4經硅膠柱色譜(石油醚/丙酮=5∶1→0∶1，)和半制備高效液相色譜純化 [乙腈(A)/水(B)，5%～40%～60% A，0～30～55 min]，得到化合物(10.7 mg)。

取40%組分8.8 g過C柱純化，依次使用體積分數為30%、50%、70%、95%的甲醇梯度洗脫，50 ℃減壓濃縮，得到4個組分Fr.6～Fr.9。Fr.9經凝膠柱分離純化(氯仿/甲醇=1∶1，)，得到4個組分Fr.9-1～Fr.9-4。Fr.9-2經高效液相色譜制備 [乙腈(A)/水(B), 32%～40%～60% A，0～30～45 min]，得到化合物(5.1 mg)、(9.5 mg)、(8.1 mg)、(6.8 mg)。

2.2 抗炎活性測試

抗炎活性測定參考文獻(王淑慧等，2019)并略作修改。

不同極性部位的抗炎活性測定：取對數生長期的RAW 264.7細胞，制成濃度為每毫升5×10～6×10個的單細胞懸液，接種于12孔板中，每孔1 mL，置于37 ℃、5% CO的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，分別設置空白對照組、LPS組、藥物組(95%乙醇提取物組、石油醚部位組、乙酸乙酯部位組、正丁醇部位組和水部位組)，其中藥物組(4個濃度)和LPS終濃度分別為12.5、25.0、50.0、100、0.20 μg·mL，每組設3個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取上清，Griess法測定NO含量，并應用 SPSS 16.0 軟件進行回歸計算 IC值。

化合物抗炎活性測定：實驗步驟同上，其中藥物組(化合物-)給藥終濃度分別為6.25、12.5、25.0、50.0 μmol·L。

3 化合物結構鑒定

化合物白色粉末。ESI-MS：371.3 [M+H]，分子式為CHO。H-NMR (500 MHz, CDCl),: 6.94 (1H, d，= 1.0 Hz, H-2′), 6.91 (1H, s, H-2), 6.85 (2H, m, H-6, 6′), 6.83 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.78 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5′), 5.98 (2H, s, -OCHO-), 5.96 (2H, s, -OCHO-), 4.84 (1H, d,= 4.5 Hz, H-7′), 4.81 (1H, s, H-7), 4.49 (1H, dd,= 8.0, 9.5 Hz, H-9′b), 4.03 (1H, d,= 9.5 Hz, H-9b), 3.90 (1H, d,= 9.5 Hz, H-9a), 3.81 (1H, dd,= 6.5, 9.5 Hz, H-9′a), 3.04 (1H, m, H-8′);C-NMR (125 MHz, CDCl),:129.4 (C-1), 107.6 (C-2), 148.1 (C-3), 148.3 (C-4), 108.7 (C-5), 120.3 (C-6), 87.6 (C-7), 91.8 (C-8), 75.0 (C-9), 134.8 (C-1′), 107.0 (C-2′),147.4 (C-3′), 148.2 (C-4′), 108.3 (C-5′), 119.9 (C-6′), 86.0 (C-7′), 60.6 (C-8′), 71.8 (C-9′), 101.3, 101.4 (2 × -OCHO-)。以上數據與文獻(馮薇和楊峻山，2010)基本一致，故鑒定為泡桐素(paulownin)。

化合物黃色粉末。ESI-MS：329.1 [M+H]，分子式為CHO。H-NMR (500 MHz, acetone-),: 12.93 (1H, s, 5-OH), 8.04 (2H, d,= 8.5 Hz, H-2′, H-6′), 7.13 (2H, d,= 8.5 Hz, H-3′, H-5′), 6.86 (1H, s, H-3), 6.72 (1H, s, H-8), 3.99 (3H, s, 6-OCH), 3.92 (3H, s, 7-OCH), 3.80 (3H, s, 4′-OCH);C-NMR (125 MHz, acetone-),: 165.0 (C-2), 104.4 (C-3), 183.5 (C-4), 163.8 (C-5), 133.6 (C-6), 154.0 (C-7), 92.0 (C-8), 154.1 (C-9), 106.6 (C-10), 124.4 (C-1′), 129.1 (C-2′, 6′), 115.5 (C-3′, 5′), 160.2(C-4′), 60.6 (6-OCH), 56.8 (7-OCH), 56.0 (4′-OCH)。以上數據與文獻(Shaheen et al., 2011)基本一致，故鑒定為鼠尾草素(salvigenin)。

化合物黃色油狀物。ESI-MS：391.3 [M+H]，分子式為CHO。H-NMR (500 MHz, acetone-),: 8.14 (4H, s, H-3, 4, 6, 7), 4.27 (4H, m, H-1′, 1″), 1.73 (2H, m, H-2′, 2″), 0.95 (6H, t,= 7.5 Hz, H-8′, 8″), 0.92 (6H, t,= 7.5 Hz, H-6′, 6″);C-NMR (125 MHz, acetone-),: 166.1 (C-1, 8), 135.2 (C-2, 5), 130.3 (C-3, 4, 6, 7), 68.0 (C-1′, 1″), 39.8 (C-2′, 2″), 31.3 (C-3′, 3″), 29.7 (C-4′, 4″), 23.6 (C-5′, 5″), 14.3 (C-6′, 6″), 24.7 (C-7′, 7″), 11.4 (C-8′, 8″)。以上數據與文獻(Dissanayake et al., 2016)基本一致，故鑒定為對苯二甲酸二辛酯 [bis-(2-ethylhexyl) terephthalate]。

化合物白色粉末。ESI-MS：403.2 [M+H]，分子式為CHNO。H-NMR (500 MHz, acetone-),: 7.82 (2H, d,= 7.0 Hz, H-3″, 7″), 7.52 (1H, t,= 7.5 Hz, H-5″), 7.42 (2H, t,= 8.0 Hz, H-4″, 6″), 4.84 (1H, m, NHCO), 4.08 (1H, m, NHCO), 3.21 (1H, dd,= 9.5, 13.5 Hz, H-3a), 3.03 (1H, dd,=9.5, 13.5 Hz, H-3b), 2.89 (1H, dd,= 7.5, 13.5 Hz, H-3′a), 2.75 (1H, dd,= 7.5, 13.5 Hz, H-3′b);C-NMR (125 MHz, acetone-),: 171.7 (C-1), 55.9 (C-2), 38.3 (C-3), 139.8 (C-4), 129.0 (C-5, 9), 130.2 (C-6, 8), 126.8 (C-7), 63.6 (C-1′), 53.9 (C-2′), 37.6 (C-3′), 138.9 (C-4′), 129.0 (C-5′, 9′), 130.2 (C-6′, 8′), 127.2 (C-7′), 167.4 (C-1″), 135.3 (C-2″), 128.2 (C-3″, 7″), 130.1 (C-4″, 6″), 132.2 (C-5″)。以上數據與文獻(Xu et al., 2009；李柏榆等，2018)基本一致，故鑒定為-(-苯甲酰基-L-苯丙?；?-L-苯基丙醇 [-(-benzoy-L-phenylalany)-L-phenylalanol]。

化合物淡黃色膠狀物。ESI-MS：405.2 [M+H]，分子式為CHO。H-NMR (500 MHz, CDCl),: 6.64 (4H, s, H-2, 6, 2′, 6′), 5.59 (2H, s, 4, 4′-OH), 4.47(2H, d,= 6.0 Hz, H-7, 7′), 3.84 (12H, s, 3, 5, 3′, 5′-OCH), 2.30 (2H, m, H-8, 8′), 1.02 (6H, d,= 6.5 Hz, H-9, 9′);C-NMR (125 MHz, CDCl),: 133.3 (C-1, 1′), 103.2 (C-2, 6, 2′, 6′), 147.0 (C-3, 5, 3′, 5′), 134.1 (C-4, 4′), 87.5 (C-7, 7′), 44.3 (C-8, 8′), 13.1 6(C-9, 9′), 56.3 (3, 5, 3′, 5′-OCH)。以上數據與文獻(季霄等，2014)基本一致，故鑒定為fragransin B。

化合物黃色晶體。ESI-MS：343.1 [M+H]，分子式為CHO。H-NMR (500 MHz, CDCl),: 7.82 (2H, d,= 8.5 Hz, H-2′, 6′), 7.00 (2H, d,= 8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.81 (1H, s, H-5), 6.60 (1H, s, H-3), 3.99 (6H, s, 6, 8-OCH), 3.92 (3H, s, 7-OCH), 3.89 (3H, s, 4′-OCH);C-NMR (125 MHz, CDCl),: 161.3 (C-2), 107.0 (C-3), 177.4 (C-4), 96.3 (C-5), 157.7 (C-6), 140.4 (C-7), 152.6 (C-8), 154.6 (C-9), 112.8 (C-10), 123.8 (C-1′), 127.7 (C-2′, 6′), 114.4 (C-3′, 5′), 162.2 (C-4′), 56.4 (6-OCH), 61.6 (7-OCH), 62.3 (8-OCH), 55.6 (4′-OCH)。以上數據與文獻(Shin et al., 2012)基本一致，故鑒定為6,7,8,4′-四甲氧基黃酮(6,7,8,4′-tetramethoxyflavone)。

化合物淺黃色油狀。ESI-MS: 314.1 [M+H]，分子式為CHNO。H-NMR (500 MHz, CDOD),: 7.42 (1H, d,= 16.0 Hz, H-7), 7.07 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 7.03 (2H, d,= 8.0 Hz, H-2′, 6′), 7.00 (1H, dd,= 2.0, 8.0 Hz, H-6), 6.78 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.71 (2H, d,= 8.0 Hz, H-3′, 5′), 6.93 (1H, d,= 16.0 Hz, H-8), 3.83 (3H, s, 3-OCH), 3.44 (2H, t,= 7.5 Hz, H-8′), 2.72 (2H, t,= 7.5 Hz, H-7′);C-NMR (125 MHz, CDOD),: 128.1 (C-1), 111.5 (C-2), 149.9 (C-3), 149.3 (C-4), 116.5 (C-5), 123.2 (C-6), 142.1 (C-7), 118.7 (C-8), 169.2 (C-9), 131.3 (C-1′), 130.7 (C-2′, 6′), 116.3 (C-3′, 5′), 156.8 (C-4′), 35.7 (C-7′), 42.5 (C-8′), 56.4 (3-OCH)。以上數據與文獻(Darwish et al., 2003；楊洋等，2016)基本一致，故鑒定為-反式-阿魏酰酪胺(--feruloyltyramine)。

化合物淺黃色油狀。ESI-MS/：314.1 [M+H]，分子式為CHNO。H-NMR (500 MHz, CDOD),: 7.36 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 6.99 (2H, d,= 8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.92 (1H, dd,= 2.0, 8.0 Hz, H-6), 6.73 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.68 (2H, d,= 8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.60 (1H, d,= 12.5 Hz, H-7), 5.80 (1H, d,= 12.5 Hz, H-8), 3.83 (3H, s, 3-OCH), 3.38 (2H, t,= 7.5 Hz, H-8′), 2.68 (2H, t,= 7.5 Hz, H-7′);C-NMR (125 MHz, CDOD),: 131.2 (C-1), 114.0 (C-2), 148.6 (C-3), 148.6 (C-4), 115.9 (C-5), 124.9 (C-6), 138.4 (C-7), 121.6 (C-8), 170.3 (C-9), 128.5 (C-1′), 130.7 (C-2′, 6′), 116.3 (C-3′, 5′), 156.9 (C-4′), 35.6 (C-7′), 42.4 (C-8′), 56.4 (3-OCH)。以上數據與文獻(Hwang et al., 2016)基本一致，故鑒定為-順式-阿魏酰酪胺(--feruloyltyramine)。

化合物白色粉末。ESI-MS：290 [M+Na]，分子式為CHNO。H-NMR (500 MHz, CDOD),: 7.54 (2H, m, H-2, 6), 7.53 (1H, d,= 16.0 Hz, H-7), 7.37 (3H, m, H-3, 4, 5), 7.05 (2H, d,= 8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.71 (2H, d,=8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.56 (1H, d,= 16.0 Hz, H-8), 3.46 (2H, t,= 7.5 Hz, H-8′), 2.74 (2H, t,= 7.5 Hz, H-7′);C-NMR (125 MHz, CDOD),: 136.3 (C-1), 128.8 (C-2, 6), 129.9 (C-3, 5), 130.7 (C-4), 141.6 (C-7), 121.9 (C-8), 168.6 (C-9), 131.3 (C-1′), 130.8 (C-2′, 6′), 116.3 (C-3′, 5′), 35.8 (C-7′), 42.6 (C-8′)。以上數據與文獻(馮文明等，2018)基本一致，故鑒定為--cinnamoyltyramine。

化合物淺黃色粉末。ESI-MS：324.2 [M+H]，分子式為CHNO。H-NMR (500 MHz, CDOD),: 7.42 (1H, d,= 8.0 Hz, H-7), 7.24 (1H, d,= 8.0 Hz, H-4), 7.21 (1H, s, H-8), 7.11 (1H, m, H-6), 7.07 (1H, m, H-5), 6.08 (1H, dd,= 11.0, 17.5 Hz, H-17), 5.10 (1H, d,= 10.5 Hz, H-18a), 5.08 (1H, d,= 17.5 Hz, H-18b), 4.22 (1H, q,= 7.0 Hz, H-12), 1.55 (3H, s, H-19), 1.54 (3H, s, H-20), 1.52 (3H, d,= 7.0 Hz, H-15);C-NMR (125 MHz, CDOD),: 146.0 (C-2), 104.3 (C-3), 127.3 (C-3a), 119.8 (C-4), 121.2 (C-5), 122.6 (C-6), 112.7 (C-7), 136.9 (C-7a), 114.3 (C-8), 124.8 (C-9), 162.2 (C-10), 52.6 (C-12), 168.7 (C-13), 20.7 (C-15), 40.5 (C-16), 146.2 (C-17), 112.6 (C-18), 28.1 (C-19), 28.2 (C-20)。以上數據與文獻(范翠梅等，2016)基本一致，故鑒定為新海膽靈A(neoechinulin A)。

4 抗炎測試結果

4.1 貓須草不同極性部位抗炎結果

由表1可知，除水部位外，其余部位均顯示出抑制NO生成活性，中低極性的石油醚、乙酸乙酯部位抗炎活性最強，表明這兩個部位是貓須草抗炎作用的主要部位。

表 1 不同極性部位對RAW 264.7細胞生成NO的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of different polarity fractions on NO production in RAW 264.7 cells

4.2 化合物抗炎活性結果

通過對從活性部位中得到的10個化合物進行抗炎活性篩選，由表2可知，化合物-表現出一定的抗炎活性，結構類型涉及黃酮、木脂素和酰胺類，其中獲得的酰胺類成分(-)均顯示出一定的NO生成抑制活性，表明該類成分是貓須草抗炎作用的主要成分之一。

表 2 化合物1-10對RAW 264.7細胞生成NO的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of compounds 1-10 on NO production in RAW 264.7 cells

5 討論與結論

一氧化氮(NO)是一種高活性的含氮自由基，它既具有第二信使和神經遞質的功能，又可以作為效應分子對動脈粥樣硬化、關節(jié)炎、 痛風、 癌癥等多種炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展過程起到重要調節(jié)作用(Bansal et al., 2016)，這種作用與其參與NF-κB、MAPK、JAK/STAT等多種信號通路密切相關，NO常作為判斷炎癥反應及抗炎藥物篩選的重要指標。

本實驗利用NO炎癥模型對貓須草提取物及其化學成分進行抗炎活性評價，結果發(fā)現大部分化合物具有較好的NO生成抑制活性。多項研究也證實，-反式-阿魏酰酪胺()和-順式-阿魏酰酪胺()在Hep3B細胞模型中能夠抑制IL-6介導的STAT3激活(Hwang et al., 2016)。--cinnamoyltyramine()對環(huán)氧化酶Ⅰ/Ⅱ顯出一定的抑制作用(Park, 2007)。在高劑量(0.45 g·kg)下，泡桐素()能夠明顯抑制二甲苯致小鼠耳腫脹和減少醋酸致小鼠扭體次數(李燕婧等，2007)。鼠尾草素()對脾細胞分泌IL-4和IFN-γ具有調節(jié)作用(Noori et al., 2013)。fragransin B()在體外能夠抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8的產生，在體內耳腫脹炎癥模型中，fragransin B的抗炎作用優(yōu)于阿司匹林(Chen et al., 2020)。新海膽靈A()在高劑量下(100 μmol·L)才顯示出較好的NO生成抑制作用，還能夠抑制TNF-α、IL-1β分泌(Kim et al., 2013)。研究結果表明這些成分能夠有效抑制炎癥因子分泌，緩解炎癥反應，以達到抗炎作用，是潛在的抗炎分子。從抗炎成分的結構類型來看，這些成分涉及黃酮、木脂素、含氮化合物等，表明貓須草抗炎作用是多類型成分共同作用的結果。本研究不僅闡明貓須草抗炎活性部位及其物質基礎，還為其進一步在抗炎方面的開發(fā)利用提供理論依據。