呂 燕, 郭立新, 段維軍*

(1. 寧波檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院, 寧波 315012; 2. 寧波中盛產(chǎn)品檢測有限公司, 寧波 315012;3. 寧波海關(guān), 寧波 315012)

可可花癭病菌Albonectriarigidiuscula(Berk. & Broome) Rossman & Samuels屬真菌界Fungi子囊菌門Ascomycota糞殼菌綱Sordariomycetes肉座菌目Hypocreales叢赤殼科Nectriaceae白殼屬Albonectria,其無性階段也被稱作多隔鐮刀菌FusariumdecemcellulareBrick。目前,該病菌主要分布在亞洲的印度、印度尼西亞、伊朗、馬來西亞、菲律賓、斯里蘭卡;非洲的喀麥隆、中非、剛果、科特迪瓦、加納、馬達加斯加、尼日利亞、塞拉利昂;北美洲的伯利茲、哥斯達黎加、古巴、多米尼克、多米尼加、格林納達、危地馬拉、洪都拉斯、牙買加、墨西哥、尼加拉瓜、巴拿馬、波多黎各(美)、特立尼達和多巴哥、美國;大洋洲的美屬薩摩亞、法屬波利尼西亞、密克羅尼西亞、新喀里多尼亞(法)、巴布亞新幾內(nèi)亞;南美洲的阿根廷、巴西、哥倫比亞、厄瓜多爾、圭亞那、秘魯、蘇里南、委內(nèi)瑞拉;我國局部地區(qū)有發(fā)生危害報道[1-2]?？煽苫ò`病菌寄主范圍十分廣泛,包括可可Theobromacacao、芒果Mangiferaindica、毛葉棗Ziziphusmauritiana、羅漢松Podocarpusmacrophyllus、番荔枝Annonasquamosa、腰果樹Anacardiumoccidentale、中?？Х菴offeacanephora等多種植物[1-9]?？煽苫ò`病菌可造成多種病害,如在印度該病菌危害可可,嚴(yán)重時造成可可絕收[9],在多米尼加該病菌能造成芒果樹癌腫,發(fā)病率可達到10%～50%[4],在我國四川省攀枝花市該病菌危害芒果樹,造成3個芒果園內(nèi)樹木枯死[10]。該病菌也是《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》中的一種檢疫性真菌[11]。

目前,口岸植物檢疫對可可花癭病菌的檢疫鑒定主要是按照出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《可可花癭病菌檢疫鑒定方法》(SN/T 3284-2012)進行[1],即通過對病健交界處進行組織分離培養(yǎng),觀察病原菌形態(tài)及培養(yǎng)性狀,并將病菌接種到寄主植物觀察致病性,整個過程費時費力,且難以區(qū)分近似種,無法滿足口岸快速檢測通關(guān)需要。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,國內(nèi)外已有大量應(yīng)用實時熒光PCR技術(shù)檢測植物病原真菌的報道[12-15],為準(zhǔn)確、快速檢測病原菌提供了重要參考。但是關(guān)于可可花癭病菌的分子檢測技術(shù)研究相對較少,段維軍等[8]通過rDNA ITS、28S、EF1α和TUB基因序列比對分析,發(fā)現(xiàn)可可花癭病菌及其近似種的ITS、28S序列差異較小,難以有效區(qū)分,而EF1α和TUB序列能夠進一步對該病菌進行有效劃分。迄今,尚未有利用TaqMan 實時熒光PCR方法對可可花癭病菌進行檢測的報道。本研究中,我們對可可花癭病菌及其近似種的EF1α基因序列進行了比較分析,設(shè)計了1對特異性引物和1條探針,建立了可可花癭病菌實時熒光PCR檢測方法,以期為口岸檢疫和該病菌防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究所用菌株共計34株,包括7株可可花癭病菌,其中5株由本實驗室從日本進境羅漢松上分離鑒定獲得[8],2株來源于福州海關(guān)技術(shù)中心實驗室,以及一些其他種屬植物真菌27株(表1)。以上菌株均保存于盛有無菌水的凍存管中(4℃)備用。

表1 供試菌株信息1)

續(xù)表1 Table 1(Continued)

1.2 試劑和儀器

TaqMan?Universal PCR Master Mix 購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司、TANbead?Plant DNA Auto Kit購自臺灣奈米技術(shù)開發(fā)有限公司、全自動核酸提取儀Kingfisher mL(美國Thermo Fisher)、實時熒光PCR儀ABI Prism 7900(美國ABI)、超微量分光光度計NanoDrop 2000C(美國Thermo Fisher)、生化培養(yǎng)箱Friocell 222(德國3M公司)。

1.3 DNA提取

用滅菌槍頭刮取在PDA平板上培養(yǎng)2周左右的菌絲,按照TANBead?Plant DNA Auto Kit說明書提取DNA,DNA經(jīng)過濃度檢測后保存于-20℃冰箱備用。

1.4 引物和探針的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank公布的可可花癭病菌EF1α基因(登錄號:KJ648617)的保守區(qū)域,利用BioEdit軟件進行序列比對分析,應(yīng)用軟件 Primer Express 3.0設(shè)計正向引物NR-F(5′-GAGCGACGTTGGCACAATG-3′),反向引物NR-R(5′-GGTTCGGAACACGTGACGAT-3′),探針NR-P(5′-CCTGGCCCCTGCAC-3′),擴增目的片段大小為 78 bp(圖1)。探針5′端標(biāo)記FAM熒光報告基團,3′端標(biāo)記非熒光猝滅基團和MGB。上述引物和探針由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

圖1 可可花癭病菌及其近似種EF1α序列比對Fig.1 EF1α sequence comparison among Albonectria rigidiuscula and closely related species

1.5 特異性試驗

以表1中供試菌株DNA為模板,無菌水為空白對照,進行實時熒光PCR反應(yīng),在20 μL反應(yīng)體系中加入10 μL 2×TaqMan?Universal PCR Master Mix,0.5 μL引物NR-F(10 μmol/L),0.5 μL引物NR-R(10 μmol/L),0.5 μL探針NR-P(10 μmol/L),1 μL DNA,ddH2O補足至20 μL。反應(yīng)條件為:50℃ 2 min;95℃ 10 min;然后95℃ 15 s,60℃ 1 min,共40個循環(huán)。

1.6 實時熒光PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

1.6.1引物濃度優(yōu)化

以AR1 菌株DNA為模板,參照1.5中反應(yīng)體系,其他成分保持不變,將NR-F/NR-R正反向引物濃度設(shè)置為0.1 μmol/L至1.0 μmol/L,以0.1 μmol/L遞增。

1.6.2探針濃度優(yōu)化

以AR1 菌株DNA為模板,參照1.5中反應(yīng)體系,其他成分保持不變,選用1.6.1中優(yōu)化后的NR-F/NR-R引物濃度,將NR-P探針濃度設(shè)置為0.1 μmol/L 至1.0 μmol/L,以0.1 μmol/L遞增。

1.7 靈敏度試驗

為確定可可花癭病菌實時熒光PCR的檢測限度,將AR1 菌株的DNA用無菌水進行10倍梯度稀釋,共7個梯度,每個梯度做3次重復(fù)。在20 μL反應(yīng)體系中,DNA含量分別為0.01 pg、0.1 pg、1 pg、10 pg、100 pg、1 ng、10 ng,利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系進行實時熒光PCR反應(yīng),測定靈敏度并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 重復(fù)性試驗

以AR1 菌株DNA為模板進行重復(fù)性試驗,在同一個試驗中,每個濃度重復(fù)3次,分析組內(nèi)差異;在不同時間段進行3次獨立試驗,進行組間差異分析。根據(jù)獲得的Ct值計算平均Ct值、標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation, SD)和變異系數(shù)(coefficient of variation, CV),來評價該方法的重復(fù)性。

1.9 接種試驗及接種樣品的檢測

選用健康的羅漢松幼苗,參照段維軍等[8]的方法進行接種試驗。取PDA平板上培養(yǎng)好的AR1菌株的菌絲塊接種到幼苗傷口上,共接種3個幼芽,分別編號為S1、S2、S3,作為試驗組;取無菌的PDA培養(yǎng)基塊接種1個幼芽,編號為S0,作為對照組。接種后的幼苗在25℃條件下進行隔離培養(yǎng),2周后提取試驗組和對照組幼芽處DNA進行檢測,以AR1菌株DNA為陽性對照,DP1菌株DNA為陰性對照,H2O為空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性分析

對表1所列34個供試菌株進行實時熒光PCR檢測,結(jié)果顯示,7株可可花癭病菌均為陽性,有明顯的擴增曲線生成,而其他27個供試菌株均為陰性,表明本研究設(shè)計的NR-F/NR-R引物和NR-P探針具有較強的特異性(圖2)。

圖2 可可花癭病菌實時熒光PCR的特異性擴增試驗Fig.2 Specific amplification of the real-time fluorescence PCR assay for Albonectria rigidiuscula

2.2 實時熒光PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

2.2.1引物濃度優(yōu)化

由圖3可知,當(dāng)引物濃度為0.2 μmol/L時,ΔRn值最大、Ct值最小。經(jīng)過3次重復(fù)試驗后,最終確定0.2 μmol/L為最佳引物濃度。

圖3 NR-F/NR-R引物濃度的優(yōu)化Fig.3 Optimization of NR-F/NR-R primer concentration

2.2.2探針濃度優(yōu)化

由圖4可知,當(dāng)探針濃度為0.6 μmol/L時,ΔRn值最大、Ct值最小。經(jīng)過3次重復(fù)試驗后,最終確定0.6 μmol/L為最佳探針濃度。

圖4 NR-R探針濃度的優(yōu)化Fig.4 Optimization of NR-R probe concentration

2.2.3優(yōu)化后的反應(yīng)體系

通過引物濃度和探針濃度優(yōu)化試驗,確定實時熒光PCR的最佳反應(yīng)體系,即20 μL反應(yīng)體系中加入10 μL 2×TaqMan?Universal PCR Master Mix,0.4 μL NR-F引物(10 μmol/L),0.4 μL NR-R引物(10 μmol/L),1.2 μL NR-P探針(10 μmol/L),1 μL DNA,ddH2O補足至20 μL。

2.3 靈敏度試驗及標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

對不同濃度DNA進行實時熒光PCR檢測,結(jié)果顯示當(dāng)可可花癭病菌DNA含量為1 pg時,3次重復(fù)試驗中只有一條擴增曲線,且熒光信號很弱,Ct值大于36;而DNA含量為10 pg時,有明顯的擴增曲線,說明本研究所建立的可可花癭病菌實時熒光PCR方法的最低檢測限是10 pg(圖5)。

圖5 可可花癭病菌實時熒光PCR的靈敏度檢測Fig.5 Relative sensitivity of the real-time fluorescence PCR assays for Albonectria rigidiuscula

通過對已知濃度的DNA進行實時熒光PCR檢測發(fā)現(xiàn),DNA含量越高,Ct值越小,即DNA含量與可檢測到的熒光信號的循環(huán)數(shù)呈負(fù)相關(guān),標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.99x+23.97(R2=0.993 4)(圖6)。

圖6 可可花癭病菌實時熒光PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of the real-time fluorescence PCR assays for Albonectria rigidiuscula

2.4 重復(fù)性分析

以AR1菌株4個濃度的DNA(0.01、0.1、1、10 ng)進行3次組內(nèi)及3次組間重復(fù)測定。從表2可知,組內(nèi)重復(fù)CV值在0.35%～0.83%之間,組間重復(fù)CV值在0.21%～0.90%之間,二者的CV值均小于1%,說明本研究所建立的可可花癭病菌TaqMan MGB熒光PCR檢測方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。

2.5 接種樣品檢測結(jié)果

對試驗組和對照組樣品DNA進行實時熒光PCR檢測,結(jié)果顯示試驗組樣品S1、S2、S3 及陽性對照AR1的DNA擴增后有明顯的擴增曲線生成,而對照組樣品S0、陰性對照DP1及空白對照H2O均無擴增(圖7)。以上結(jié)果表明該方法能快速、準(zhǔn)確檢出可可花癭病菌。

表2 可可花癭病菌實時熒光PCR的重復(fù)性試驗

圖7 接種樣品的可可花癭病菌實時熒光PCR檢測結(jié)果Fig.7 Detection of Albonectria rigidiuscula by real-time fluorescence PCR assays from inoculated samples

3 討論

可可花癭病菌是一種重要的檢疫性真菌,該病菌寄主種類較多,能夠引起植物花序枯萎和維管束壞死,在花芽、莖基和枝條等侵染部位可形成癌腫,造成植物萎蔫、畸形或頂枯[5, 7, 16]。種苗、水果、糧谷等植物產(chǎn)品是植物病害遠距離傳播的重要載體,是病害初次侵染的重要來源。目前,全球范圍內(nèi)由可可花癭病菌在不同地理區(qū)域不同寄主上造成的植物病害種類在不斷增加,為避免該病菌在我國傳播擴散,亟須建立特異、準(zhǔn)確的檢測方法,以滿足口岸快速檢測的需求,防止攜帶該病菌的植物產(chǎn)品的傳入。

目前,我國口岸已多次截獲可可花癭病菌,2013年寧波口岸首次從日本進境羅漢松種苗上截獲該病菌[8];2017年重慶口岸從越南的番荔枝上截獲該病菌;2021年福建口岸從臺灣的番荔枝上也截獲該病菌[17]。其截獲率不高的原因可能在于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法檢測效率較低、靈敏度不夠等。國內(nèi)外現(xiàn)有關(guān)于可可花癭病菌的研究主要集中在新病害發(fā)現(xiàn)報道、檢疫鑒定和防控等方面[5-7, 10, 16, 18],但未有該病菌的快速檢測技術(shù)研究的相關(guān)報道。結(jié)合早期研究我們發(fā)現(xiàn),EF1α基因序列能夠準(zhǔn)確鑒定可可花癭病菌[5, 8, 10, 19]。本研究在收集了可可花癭病菌及其近似種的基礎(chǔ)上,根據(jù)它們的EF1α序列差異設(shè)計特異性引物和探針,建立了該病菌的實時熒光PCR檢測方法。研究結(jié)果表明,該方法能有效地擴增可可花癭病菌目的基因(EF1α)片段,具有良好的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性;同時該方法具有實用性,可用于疑似攜帶可可花癭病菌樣品的檢測與初篩。另外,根據(jù)靈敏度試驗結(jié)果,確定了在20 μL反應(yīng)體系中,該方法能夠檢測到可可花癭病菌的最低DNA含量為10 pg。段麗君等[20]建立了杜鵑花枯萎病菌的實時熒光PCR檢測方法,10 μL反應(yīng)體系中能夠檢出該病菌的最低DNA含量為0.25 pg;段維軍等[21]建立了向日葵黑莖病菌的實時熒光PCR檢測方法,20 μL反應(yīng)體系中能夠檢出該病菌的最低DNA含量為0.1 pg,以上2種檢測方法的靈敏度均較高,原因在于它們的特異性引物和探針是根據(jù)ITS基因序列設(shè)計的,而ITS基因在整個基因組DNA中串聯(lián)重復(fù),含量較高。本文建立的檢測方法靈敏度相對較低,可能原因是EF1α基因在基因組中含量較低所致。盡管本文所建立的可可花癭病菌實時熒光PCR檢測方法靈敏度較低,但在實際檢測工作中可滿足使用需求。可可花癭病菌已在口岸多次檢出[8, 17],該方法能夠解決可可花癭病菌以往檢測方法中存在的不足之處,縮短檢測周期,建議盡快修訂《可可花癭病菌檢疫鑒定方法》(SN/T 3284-2012)標(biāo)準(zhǔn),增加分子生物學(xué)檢測方法,以提高該病菌檢出率。