丁 戈, 熊 潔, 陳倫林, 李書宇, 宋來強(qiáng)

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所, 國家油料改良中心南昌分中心, 江西省油料作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中下游作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南昌 330200)

乙草胺(acetochlor, 分子式C14H20ClNO2)登記產(chǎn)品可安全用于油菜Brassicanapus[1]、玉米Zeamays[2]、大豆Glycinemax[3]、棉花Gossypiumspp.[4]、馬鈴薯Solanumtuberosum[5]、花生Arachishypogaea[6]等作物田中一年生禾本科雜草占優(yōu)勢的旱地土壤封閉除草。土壤濕度對乙草胺的安全性影響較大,在乙草胺過量施用時(shí),高濕(含水量30%以上)和干旱(含水量10%～15%)都會(huì)加重作物的藥害[7]。我國冬油菜優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)長江中下游地區(qū)自1951年來秋季干旱趨勢加重,極端降雨頻率顯著升高[8],在這類極端氣候條件下使用乙草胺容易在油菜上產(chǎn)生藥害。干旱氣候條件會(huì)導(dǎo)致除草效果差,而種植戶由于缺乏科學(xué)施藥技術(shù)普遍選擇加大施藥劑量,結(jié)果導(dǎo)致作物藥害加重[9]?？赏ㄟ^增施有機(jī)肥減弱作物對土壤中農(nóng)藥的吸收并提供作物恢復(fù)生長的養(yǎng)分,或選擇安全劑、拌種劑、解毒劑等產(chǎn)品以提高敏感作物或品種的解毒酶谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase, GST)活性來緩解乙草胺藥害。例如,二氯丙烯胺、苯叉酰胺等二氯乙酰氨類化合物作為安全劑與乙草胺混合后進(jìn)行土壤噴霧,可提高玉米幼苗GST活性[10]。采用內(nèi)生真菌印度梨形孢Piriformosporaindica菌絲拌種可提高油菜幼苗地上部GST活性[11]。微生物菌劑枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis拌種可提高油菜葉片中GST活性[12]。出苗期噴施解毒劑蕓苔素內(nèi)酯可提高油菜葉片中GST活性[13]。近年來,國內(nèi)非轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜新種質(zhì)創(chuàng)制和抗性油菜品種選育取得豐碩成果[14],育成了我國第1個(gè)非轉(zhuǎn)基因抗磺酰脲類除草劑油菜新品種‘寧R101’[15]。抗除草劑性狀在油菜雜交制種的應(yīng)用有利于提高化學(xué)殺雄制種過程中父本安全性,擴(kuò)大制種規(guī)模,提升雜交種F1純度?？钩輨┯筒诵缕贩N的推廣,有利于推動(dòng)我國油菜全程機(jī)械化生產(chǎn)。目前關(guān)于乙草胺脅迫下不同油菜品種萌發(fā)期幼苗生長及生理的研究較少,本研究對乙草胺處理下的不同耐藥性油菜品種幼苗的生物、生理性狀進(jìn)行了較系統(tǒng)的比較分析,以期深入揭示不同油菜品種對乙草胺耐藥性差異機(jī)理,為非轉(zhuǎn)基因耐乙草胺的油菜新種質(zhì)選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)油菜品種:前期篩選的120份甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。以油菜萌發(fā)期的直立表型幼苗數(shù)作為乙草胺耐藥性主要測定指標(biāo),篩選獲得的乙草胺耐藥品種‘Norin 41’和敏感品種‘Dong Hae 1’作為試驗(yàn)品種。

供試除草劑:50%乙草胺乳油由山東勝邦綠野化學(xué)有限公司生產(chǎn),在油菜田的制劑用藥量為1 050～1 500 mL/hm2,兌水600～900 L/hm2,土壤噴霧的有效成分含量為0.052%～0.125% (V/V)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

選取正常籽粒,均勻放置在鋪有一層發(fā)芽紙的帶蓋透明發(fā)芽盒內(nèi)(外徑規(guī)格：長12 cm×寬12 cm×高5 cm)。發(fā)芽盒置于人工氣候室,培養(yǎng)溫度為(20±2)℃,光周期為L∥D=16 h∥8 h。從雜草控制的角度設(shè)定乙草胺處理劑量(有效成分含量，下同),以0.03% (V/V)為低濃度處理組,油菜田噴霧下限含量0.06% (V/V)為中等濃度處理組,0.08%(V/V)為高濃度處理組,每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)為50粒種子/發(fā)芽盒,對照組為水處理。模擬農(nóng)田播種后當(dāng)天用藥,在第1天滴加5 mL乙草胺處理液(0, 0.03%, 0.06%, 0.08%)濕潤發(fā)芽紙,第2天至第8天培養(yǎng)期間,每天添加適量的水(1～2 mL)以保持發(fā)芽紙濕潤。第8天拍照、性狀調(diào)查、數(shù)據(jù)記錄和取樣。樣品液氮速凍后-70℃保存待測。

1.3 調(diào)查和分析方法

每天統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)數(shù),第8天測定發(fā)芽率并統(tǒng)計(jì)直立表型幼苗數(shù)。試驗(yàn)組每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抽取10株幼苗,濾紙吸干表面水分,刻度尺測定胚根(根)和下胚軸(莖)長度,精密電子天平稱量幼苗總鮮重。酶活性分析參照臧麗麗等[16]的方法,采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司檢測試劑盒并按照說明書操作。試驗(yàn)組每個(gè)重復(fù)稱取0.1 g整株鮮樣,加入預(yù)冷的1 mL提取液于冰浴研磨勻漿,8 000 r/min,4℃離心10 min,取上清液為樣品提取液,置冰上待測。WST-8法(貨號(hào)SOD-1-W)測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性,以在25℃,黃嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系抑制百分率為50%時(shí),每克鮮樣在每毫升反應(yīng)體系中的SOD活性力定義為1個(gè)酶活力單位。過氧化氫消耗法(貨號(hào)CAT-1-Y)測定過氧化氫酶(catalase, CAT)活性,以在25℃,每克鮮樣每分鐘催化1 nmol H2O2降解定義為1個(gè)酶活力單位。愈創(chuàng)木酚氧化法(貨號(hào)POD-1-Y)測定過氧化物酶(peroxidase, POD)活性,以在25℃,每克鮮樣在每毫升反應(yīng)體系中每分鐘的OD470變化0.5為1個(gè)酶活力單位。CDNB法(貨號(hào)GST-1-W)測定GST活性,以在25℃,每克鮮樣每分鐘催化1 nmol CDNB與GSH結(jié)合為1個(gè)酶活單位。DTNB 法(貨號(hào)GSH-1-W)測定還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量。2-VP法(貨號(hào)GSSG-1-W)測定氧化型谷胱甘肽(glutathione disulfide, GSSG)含量。硫代巴比妥酸法(貨號(hào)MDA-1-Y)測定丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)由Microsoft Excel 2016錄入。柱圖、盒須圖、線圖、相關(guān)性熱圖由GraphPad Prism 8繪制。柱圖、線圖數(shù)據(jù)為3次生物學(xué)重復(fù)的算數(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。盒須圖上、下須表示最大、最小值,植株數(shù)n=30。主成分分析圖由OriginPro 2019b繪制。圖注由Adobe Photoshop CS5標(biāo)注。樣本均值的多重比較分析(最小顯著性差異法)和t測驗(yàn)分析采用IBM SPSS Statistics 24分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙草胺對萌發(fā)期幼苗生物性狀的影響

在3個(gè)處理組中,兩個(gè)品種的直立苗表型差異顯著(圖1),耐藥品種‘Norin 41’的直立苗率顯著高于敏感品種‘Dong Hae 1’(圖1b)。在0.06%處理組,耐藥品種的直立苗率在90%以上,而敏感品種的直立苗率低于50%。在0.08%處理組,耐藥品種的直立苗率為72.8%,而敏感品種直立苗率為34.7%。乙草胺處理不影響發(fā)芽率和萌發(fā)曲線。各試驗(yàn)組第3天的萌發(fā)率均已達(dá)90%以上,在第8天的發(fā)芽率達(dá)96%以上,兩個(gè)品種表現(xiàn)一致,沒有顯著差異(圖2)。對照組中，敏感品種和耐藥品種的鮮重分別是0.058 g和0.060 g;在0.03%和0.06%處理組,兩個(gè)品種的鮮重表型差異顯著(圖3a),耐藥品種和敏感品種的鮮重約是對照的50%。在3個(gè)處理組中,兩個(gè)品種的根-莖比表型差異顯著(圖3b),耐藥品種的根-莖比從對照組的4.490降至處理組的1.663～1.950；敏感品種則從對照組的3.097降至處理組的1.083～1.290。耐藥品種‘Norin 41’表現(xiàn)出整株鮮重高,根-莖比值大和直立苗率高的表型,表明耐藥品種整體生長和根部抗倒伏性更強(qiáng)。

圖1 乙草胺處理后不同油菜品種萌發(fā)期幼苗的直立表型Fig.1 Erect phenotypes of seedlings of different rapeseed varieties treated with acetochlor at germination stage

圖2 乙草胺處理后不同油菜品種萌發(fā)曲線Fig.2 Germination curves of different rapeseed varieties treated with acetochlor

圖3 乙草胺處理后不同油菜品種萌發(fā)期幼苗的生物學(xué)表型Fig.3 Biological phenotypes of seedlings of different rapeseed varieties treated with acetochlor at germination stage

2.2 乙草胺對萌發(fā)期幼苗生理性狀的影響

3個(gè)處理組中,敏感品種‘Dong Hae 1’的GST活性只在0.08%處理濃度下顯著升高,而耐藥品種‘Norin 41’的GST活性隨處理濃度升高而升高,且比敏感品種高1.2～1.8倍(P<0.05,圖4a)。兩個(gè)品種的GSSG含量和GSH含量的比值隨處理濃度升高呈現(xiàn)出上升的趨勢(圖4b),在對照組、0.03%和0.06%處理組,耐藥品種GSSG和GSH含量的比值比敏感品種高1.3～1.7倍(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明,耐藥品種‘Norin 41’消耗GSH和合成GSSG能力更強(qiáng),具有更強(qiáng)的乙草胺和活性氧解毒能力。

圖4 乙草胺處理后不同油菜品種谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性和氧化型-還原型谷胱甘肽比Fig.4 The GST activity and GSSG-to-GSH ratio in different rapeseed varieties treated with acetochlor

隨著處理濃度的升高,兩個(gè)品種的SOD活性都呈現(xiàn)出下降的趨勢,處理組耐藥品種‘Norin 41’的SOD活性約是敏感品種‘Dong Hae 1’的1.2倍(P<0.05,圖5a)。兩個(gè)品種的CAT活性都呈現(xiàn)出升高的趨勢(圖5b),在0.06%和0.08%處理組,耐藥品種的CAT活性為敏感品種的1.2倍(P<0.05)。兩個(gè)品種的POD活性都呈現(xiàn)出升高的趨勢(圖5c),在對照組和0.06%處理組,耐藥品種的POD活性為敏感品種的78%～86%,在0.03%和0.08%處理組,兩個(gè)品種的POD活性處于同一水平。敏感品種膜脂過氧化副產(chǎn)物MDA含量變化呈現(xiàn)“廠”形曲線,處理組MDA含量顯著高于對照組(圖5d)。耐藥品種MDA含量變化呈現(xiàn)“凵”形曲線,0.03%和0.06%處理組的耐藥品種的氧化損傷較少,其MDA含量為敏感品種的72%～76%,而在對照組和0.08%處理組,兩個(gè)品種的MDA含量處于同一水平。這些數(shù)據(jù)表明,不同油菜品種的代謝酶活性存在差異,耐藥品種‘Norin 41’具有更強(qiáng)的抗氧化能力。

圖5 乙草胺處理后不同油菜品種抗氧化酶活性與丙二醛含量Fig.5 The antioxidant enzyme activity and MDA content in different rapeseed varieties treated with acetochlor

2.3 表型性狀的相關(guān)性分析

針對耐藥品種和敏感品種表型性狀的相關(guān)性分析表明，乙草胺耐藥性主要表型直立苗率與根-莖比(r=0.602,P<0.01)、鮮重(r=0.592,P<0.01)、SOD活性(r=0.824,P<0.01)呈極顯著正相關(guān)(圖6)。其中與直立苗率正相關(guān)性最明顯的為SOD活性,表明SOD在抗脅迫過程中發(fā)揮了重要作用。MDA含量與SOD活性(r=-0.704,P<0.01)呈極顯著負(fù)相關(guān),表明SOD酶活越高,活性氧清除速度越快,膜脂過氧化程度越低。

2.4 表型性狀的主成分分析

針對耐藥品種和敏感品種表型性狀的主成分分析表明，主成分1(principal component 1, PC1)和主成分2(PC2)的貢獻(xiàn)率分別為57.08%和22.24%,累計(jì)貢獻(xiàn)率為79.32%,特征值均大于1(表1),是反映乙草胺耐藥性狀的重要主成分,可以代表10項(xiàng)性狀大部分信息。特征向量(表2, 圖7)表明,直立苗率、根-莖比、鮮重、SOD活性與PC1正相關(guān)性較強(qiáng)。PC1主要反映了生長狀況,樣品點(diǎn)的PC1值越大,生長狀況越好。MDA含量與PC2正相關(guān)性較強(qiáng)，而GST活性與PC2負(fù)相關(guān)性較強(qiáng)。PC2主要反映了氧化損傷和解毒狀況,樣品點(diǎn)的PC2值越大,氧化損傷越嚴(yán)重,解毒狀況越差。主成分分析雙坐標(biāo)軸雙序圖(圖7)表明,同一品種的處理組距離較近,而不同品種的處理組距離較遠(yuǎn),表明品種差異是決定乙草胺耐藥性的關(guān)鍵因素。反映品種耐藥性的主要因素是直立苗率、根-莖比、鮮重、SOD活性、GST活性和MDA含量(表2, 圖7)。

圖6 乙草胺處理后不同油菜品種性狀間的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis of different phenotypic traits of rapeseed treated with acetochlor

表1 乙草胺處理后不同油菜品種表型性狀的主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

表2 乙草胺處理后不同油菜品種表型性狀的特征向量的主成分特征值

圖7 乙草胺處理后不同油菜品種表型性狀的主成分分析雙坐標(biāo)軸雙序圖Fig.7 PCA biplot of phenotypic traits in different rapeseed varieties treated with acetochlor

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)直立苗率、根-莖比、鮮重、SOD活性、GST活性和MDA含量是反映油菜品種耐藥性的主要因素,這些性狀可以為非轉(zhuǎn)基因耐乙草胺的油菜新種質(zhì)選育提供理論參考,培育的新種質(zhì)在雜交制種中能保持耐乙草胺父本純度。有機(jī)質(zhì)是影響土壤對農(nóng)藥吸附作用的關(guān)鍵因子,通常土壤中有機(jī)質(zhì)會(huì)吸附、固定農(nóng)藥從而減少作物對土壤中農(nóng)藥的吸收[17]。土壤微生物是影響乙草胺持效性的主要因素[18-19],適宜微生物生長和促進(jìn)其代謝的環(huán)境因子會(huì)促進(jìn)微生物對乙草胺的降解、轉(zhuǎn)化,從而縮短乙草胺持效期。謝湘波[20]的研究表明,在湖南試驗(yàn)點(diǎn)油菜移栽后3 d,噴施0.125%乙草胺(有效成分含量)1次,施藥2 h后地表土(0～10 cm)的乙草胺原始沉積量為2.41 mg/kg,土壤和油菜植株的乙草胺半衰期分別為5.2 d和2.3 d。在同等乙草胺施用劑量下,由于試驗(yàn)培養(yǎng)基質(zhì)和土壤在理化性質(zhì)、微生物豐度以及乙草胺施用方式等方面存在不同,培養(yǎng)基質(zhì)的乙草胺有效含量和半衰期會(huì)高于表層土壤。試驗(yàn)考察的生物、生理性狀選擇范圍有局限性,因此只揭示了一部分乙草胺響應(yīng)過程。作物對非生物脅迫的生理響應(yīng)過程涉及遺傳背景(基因組)、基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄組)、蛋白質(zhì)表達(dá)(蛋白組)和代謝產(chǎn)物調(diào)控(代謝組)。隨著基因組技術(shù)[21]、轉(zhuǎn)錄組技術(shù)[22]、蛋白組技術(shù)[23]和代謝組技術(shù)[24]在油菜的成功應(yīng)用,后續(xù)研究可以開展乙草胺耐藥品種的多組學(xué)分析和高通量數(shù)據(jù)解析,在生物學(xué)功能、細(xì)胞過程和代謝通路等方面相互驗(yàn)證基因產(chǎn)物的調(diào)控變化,從而進(jìn)一步發(fā)掘耐藥品種的乙草胺響應(yīng)過程的相關(guān)代謝物、酶及調(diào)控基因。通過發(fā)掘作物的除草劑耐藥基因,以分子標(biāo)記和育種工程選育的耐除草劑作物品種是實(shí)現(xiàn)高效除草并保障作物正常生長的有效途徑。