張 寧，劉怡文，原 翔，孔金玉，楊 洪，梁夢夏，周福有

1)河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院；河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院分子生物實(shí)驗(yàn)室；河南科技大學(xué)腫瘤研究所；河南省腫瘤表觀遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南洛陽 471000 2)河南科技大學(xué)體育學(xué)院 河南洛陽 471000 3)河南科技大學(xué)附屬安陽市腫瘤醫(yī)院胸外二病區(qū);河南省食管癌精準(zhǔn)防治醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南安陽 455000

食管癌具有極高發(fā)病率及死亡率[1]，全球每年新增約50萬例，超一半發(fā)生在我國[2]。鱗狀細(xì)胞癌(鱗癌)是食管癌中最為常見的組織學(xué)類型，占食管癌總數(shù)95%以上。食管鱗癌預(yù)后極差，雖然傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療以及靶向治療、免疫治療等手段不斷更新，但中晚期食管鱗癌5 a生存率仍低于20%[3]。食管鱗癌的病因至今尚不完全明確，其危險(xiǎn)因素主要包括吸煙、飲酒、飲食、慢性感染、免疫功能紊亂及遺傳易感性等。

研究[4-6]表明，多種病原微生物均可通過長期定植于機(jī)體促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展；而清除病原微生物有助于控制腫瘤的惡性進(jìn)展。具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n)作為定植于口腔的條件致病菌，其數(shù)量改變可引起微生態(tài)失衡[7]。由于口腔頜面部靜脈瓣膜缺如，F(xiàn)n可隨血液循環(huán)輕易播散至全身，參與多種疾病進(jìn)程[8]，且與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。研究[10]顯示，食管癌前病變組織中Fn含量豐富，且有Fn感染的食管鱗癌患者生存期顯著縮短[11]，F(xiàn)n與食管鱗癌的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。前期關(guān)于Fn感染與食管鱗癌的相關(guān)研究大都集中在癌細(xì)胞自身，有關(guān)腫瘤微環(huán)境的作用則探討不多。實(shí)際上，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)[12-13]。腫瘤微環(huán)境不僅為腫瘤的惡性行為提供了豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)，且能調(diào)控免疫細(xì)胞，使其無法發(fā)揮正常功能，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[14]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)所介導(dǎo)的免疫抑制是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的重要機(jī)制之一，更是腫瘤免疫治療中的關(guān)鍵障礙[15-16]。Treg是具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，在維持機(jī)體免疫耐受和調(diào)控免疫應(yīng)答水平方面發(fā)揮了重要作用[17]。臨床資料[18-21]顯示，多種腫瘤中病原微生物均能招募Treg。因此推測Fn可能通過招募Treg而使癌細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，從而促進(jìn)食管鱗癌的惡性進(jìn)展。

本研究分別采用RNAscope及免疫組化法檢測食管鱗癌組織中Fn感染及Treg浸潤情況，分析Fn對Treg的招募效應(yīng)及其與臨床病理特征和生存預(yù)后的相關(guān)性，為食管鱗癌的治療提供新策略和治療手段。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2013年7月至2014年6月安陽市腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的食管鱗癌患者癌組織石蠟包埋標(biāo)本。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前均未接受放化療或免疫治療。②治療性食管鱗癌切除術(shù)后。③術(shù)后病理診斷明確為食管鱗癌。④病歷資料全面。⑤隨訪時(shí)間60個(gè)月。患者術(shù)后常規(guī)進(jìn)行化療，均未接受放療或免疫治療。本研究經(jīng)安陽市腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，并于術(shù)前獲得患者書面知情同意。

1.2 主要儀器與試劑Fn(16S rRNA)特異性探針與RNAscope試劑盒(美國ACD公司)，光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)，SP-9000免疫組化試劑盒(中國北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，CD4、CD25與FoxP3兔多克隆抗體(美國Abcam公司)，檸檬酸抗原修復(fù)液、PBS、DAB顯色劑(中國上海索萊寶生物技術(shù)有限公司)。

1.3 食管鱗癌組織中Fn感染的RNAscope檢測實(shí)驗(yàn)流程參考文獻(xiàn)[22]。取常規(guī)石蠟包埋的食管鱗癌組織標(biāo)本塊，以3 μm厚連續(xù)切片；60 ℃溶蠟，二甲苯脫蠟，制備靶標(biāo)修復(fù)試劑，RNAscope雙氧水處理，畫疏水圈，RNAscope蛋白酶Plus處理，進(jìn)行RNAscope雜交顯色。

1.4 食管鱗癌組織中Treg浸潤情況的免疫組化檢測取常規(guī)石蠟包埋的食管鱗癌組織標(biāo)本塊，3 μm厚連續(xù)切片；60 ℃溶蠟后立即放入二甲苯脫蠟(3次，10 min/次)，依次梯度乙醇(體積分?jǐn)?shù)100%、95%、90%、85%)水化各5 min后流水沖洗1 min；94～98 ℃檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)15 min，PBS沖洗(3次，3 min/次)；過氧化物酶阻斷劑封閉10 min，PBS沖洗(3次，3 min/次)；滴加正常山羊血清避光封閉30 min；取3張連續(xù)切片，分別加入CD4、CD25及FoxP3特異性一抗(按1∶200稀釋)各50 μL，4 ℃孵育過夜；次日復(fù)溫1 h，PBS沖洗(3次，3 min/次)；滴加山羊抗鼠/兔聚合物室溫下孵育30 min；PBS沖洗(3次，3 min/次)；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶室溫下封閉；PBS沖洗(3次，3 min/次)；DAB顯色，蒸餾水終止顯色；蘇木精復(fù)染；梯度乙醇脫水(體積分?jǐn)?shù)85%、90%、95%、100%)各1 min；二甲苯透明(3次，3 min/次)；風(fēng)干后中性樹膠封片。

1.5 結(jié)果判讀RNAscope結(jié)果判定[22]：Fn(16S rRNA)信號表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中，呈紅色顆粒狀。每個(gè)細(xì)胞中紅色顆粒≥8個(gè)或有成簇的信號為陽性細(xì)胞；每張切片中陽性細(xì)胞百分比≥30%為陽性標(biāo)本。

免疫組化結(jié)果判定[23]：以兩位資深病理科醫(yī)生共同判定的陽性切片為陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照。于光學(xué)顯微鏡下選取5個(gè)400倍視野，觀察3張食管鱗癌組織連續(xù)切片中同一位置。出現(xiàn)淺黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為Treg浸潤陽性。取5個(gè)視野評分的均值為最終免疫組化評分，0分定義為陰性，1～12分定義為陽性。

分組：4張連續(xù)切片中Fn、CD4、CD25及FoxP3同時(shí)判定為陽性的標(biāo)本，為Fn招募Treg(Fn+Treg)陽性；不滿足同時(shí)陽性者為陰性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。①應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析食管鱗癌組織中Fn感染與Treg浸潤的關(guān)聯(lián)性以及Fn+Treg陽性組與陰性組食管鱗癌患者臨床病理特征。②生存曲線繪制采用Kaplan-Meier法。③生存分析采用Log-rank檢驗(yàn)。④利用Cox回歸分析食管鱗癌患者預(yù)后影響因素。⑤檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。本研究中124例食管鱗癌患者的生存時(shí)間為入院時(shí)間至最后一次隨訪日期或死亡；刪失數(shù)據(jù)為隨訪至60個(gè)月仍存活的患者，未刪失數(shù)據(jù)為由食管鱗癌導(dǎo)致的死亡患者。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌患者的一般資料本研究共納入124例食管鱗癌患者，其中男82例，女42例；≤60歲70例，>60歲54例；有吸煙史63例；有飲酒史60例；低分化26例，中高分化98例；侵及外膜85例，未侵及外膜39例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移70例；臨床分期Ⅰ/Ⅱ期48例，Ⅲ/Ⅳ期76例。

2.2 食管鱗癌組織中Fn感染及Treg浸潤情況見圖1。食管鱗癌組織中可見癌細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)紅色顆粒，為Fn感染陽性；右側(cè)連續(xù)切片中可見同一位置淋巴細(xì)胞胞膜(CD4與CD25)或胞核(FoxP3)同時(shí)出現(xiàn)棕黃色顆粒，為Treg浸潤陽性；且Fn感染與Treg浸潤有關(guān)(表1)。

2.3 Fn+Treg陽性組與陰性組食管鱗癌患者臨床病理特征比較見表2。

2.4 食管鱗癌患者預(yù)后影響因素的Cox回歸分析124例食管鱗癌患者成功完成術(shù)后隨訪。以食管鱗癌導(dǎo)致的死亡為終點(diǎn)事件，以Fn+Treg(陽性=1，陰性=0)、性別(“男”=1,“女”=0)、年齡(“>60歲”=1，“≤60 歲”=0)、吸煙(“有”=1，“無”=0)、飲酒(“有”=1,“無”=0)、分化程度(“低分化”=1，“中高分化”=0)、浸潤深度(“侵及外膜”=1，“未侵及外膜”=0)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(“有”=1,“無”=0)、臨床分期(“Ⅲ/Ⅳ期”=1，“Ⅰ/Ⅱ期”=0)為自變量。納入混雜因素(性別與年齡)，并選擇單因素分析中與食管鱗癌有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)的變量進(jìn)行多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及Fn+Treg陽性是影響食管鱗癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)(表3)。

表3 食管鱗癌患者預(yù)后影響因素的Cox回歸分析

2.5 Fn+Treg陽性組與陰性組食管鱗癌患者5 a生存預(yù)后相關(guān)性分析結(jié)果兩組患者生存曲線見圖2。Fn+Treg陽性組5 a生存率及中位生存時(shí)間[15.79%、24.50(14.17,40.75)個(gè)月]低于陰性組[37.21%、44.00(24.75,60.00)個(gè)月]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.234，P<0.001)。

圖2 Fn+Treg陽性組與陰性組食管鱗癌患者生存曲線

3 討論

食管鱗癌的發(fā)病率與病死率較高，早期診斷困難，預(yù)后極差。因此，尋找精準(zhǔn)的早期指標(biāo)、有效的預(yù)防措施及靶向治療方法尤為重要。長期以來，腫瘤研究中與病原微生物有關(guān)的慢性感染探討的不多。實(shí)際上，多種病原微生物均可通過重塑宿主免疫微環(huán)境，在腫瘤細(xì)胞中長期定植，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸，促進(jìn)其惡性進(jìn)展[24]。而Fn作為毒力最強(qiáng)的口腔致病菌之一[25]，其內(nèi)毒素能抑制機(jī)體免疫應(yīng)答，從而長期定植于機(jī)體，促進(jìn)口腔鱗癌、食管鱗癌以及結(jié)腸癌等多種腫瘤的惡性進(jìn)展[26]。

病原微生物對腫瘤微環(huán)境的重塑機(jī)制至今尚未完全明確，但多數(shù)可招募Treg，通過細(xì)胞間抑制機(jī)制以及分泌免疫抑制分子，使機(jī)體抗腫瘤免疫失能，從而長期定植并協(xié)助腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[27-28]。幽門螺桿菌感染陽性的胃癌患者胃黏膜中Treg數(shù)量多于正常人群，使機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)[29]，促進(jìn)癌細(xì)胞惡性增殖；乙肝病毒感染的肝癌患者的癌細(xì)胞可通過上調(diào)TGF-β蛋白，大量招募Treg，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞免疫逃逸[30]；EB病毒感染陽性的霍奇金淋巴瘤患者的癌細(xì)胞可通過EB病毒核心抗原EBNA1而使趨化因子CCL20高表達(dá)，從而招募Treg[31]，協(xié)助癌細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。

本研究發(fā)現(xiàn)：食管鱗癌組織中Fn感染與Treg浸潤有關(guān)，提示Fn可能通過招募Treg，抑制免疫反應(yīng)，從而長期定植。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)n+Treg陽性組多為吸煙、飲酒的男性患者，表明長期吸煙、飲酒導(dǎo)致口腔環(huán)境惡劣，F(xiàn)n更容易感染并定植，從而招募大量Treg；低分化食管鱗癌組織中Fn+Treg陽性率高于中高分化組織，提示Fn對Treg的招募效應(yīng)可能與腫瘤的惡性程度相關(guān)；同時(shí)該效應(yīng)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，提示該效應(yīng)可能促進(jìn)了腫瘤的惡性進(jìn)展。本研究還發(fā)現(xiàn)分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及Fn+Treg陽性是影響食管鱗癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素，且Fn+Treg陽性組患者5 a生存率及中位生存時(shí)間均低于陰性組，提示有效清除Fn并抑制Treg富集可能會(huì)延長食管鱗癌患者生存期。

由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的演變過程，F(xiàn)n的具體致病機(jī)制有待進(jìn)一步探討，但打破Fn在宿主體內(nèi)持久定植的現(xiàn)狀，并有效抑制Treg的大量富集，對于延緩食管鱗癌惡性進(jìn)展并延長患者生存期具有非常重要的意義。

綜上所述，在食管鱗癌組織中Fn可能通過誘導(dǎo)或招募Treg，為自身持續(xù)感染提供有利微環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。有效清除Fn并抑制Treg富集可能延長食管鱗癌患者的生存期，在食管鱗癌的臨床治療方面具有十分重要的理論意義和廣泛的應(yīng)用前景。