嚴潔萍， 韓臻平， 李婷婷， 王思懿， 高立， 羅雙， 李漢兵， 黃萍，3

穩(wěn)定低表達細胞系Neuro-2a的構(gòu)建及其對-亞硝基化的影響*

嚴潔萍1，2，3△， 韓臻平1， 李婷婷2， 王思懿1， 高立2， 羅雙2， 李漢兵1， 黃萍2，3

（1浙江工業(yè)大學藥學院，浙江 杭州 310014；2浙江省人民醫(yī)院/杭州醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院臨床藥學中心藥學部，浙江 杭州 310014；3浙江省內(nèi)分泌腺體疾病診療重點實驗室，浙江 杭州 310014）

探討轉(zhuǎn)染慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定低表達-亞硝基谷胱甘肽還原酶（-nitrosoglutathione reductase，）的小鼠神經(jīng)母細胞瘤Neuro-2a細胞系，并考察穩(wěn)定低表達對-亞硝基化修飾水平的影響。構(gòu)建靶向的慢病毒載體，用LipoFiter?脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Neuro-2a細胞，并用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定低表達的細胞系。光鏡觀察Neuro-2a細胞的形態(tài)變化，CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染不同時間后的細胞活力，RT-qPCR和Western blot檢測GSNOR的mRNA和蛋白表達水平。生物素轉(zhuǎn)換法檢測轉(zhuǎn)染后Neuro-2a細胞內(nèi)總-亞硝基化蛋白水平。HBLV-m-ADH5-shRNA1-PURO慢病毒載體序列與目的序列結(jié)果一致，提示慢病毒載體構(gòu)建成功。嘌呤霉素篩選后，光鏡觀察Neuro-2a細胞形態(tài)良好，CCK-8實驗結(jié)果顯示在24、48、72和96 h時點細胞活力無顯著差異，提示轉(zhuǎn)染對細胞活力無明顯影響。轉(zhuǎn)染第2、4和6代后細胞內(nèi)GSNOR mRNA水平分別是空載病毒組的37.02%、40.66%和30.13%，均顯著降低（<0.01），GSNOR蛋白表達水平較空載病毒組亦顯著下降（<0.01）。此外，穩(wěn)定低表達的Neuro-2a細胞中蛋白-亞硝基化修飾水平顯著上調(diào)（<0.01）。穩(wěn)定低表達的Neuro-2a細胞系構(gòu)建成功，低表達可上調(diào)胞內(nèi)總蛋白的-亞硝基化修飾水平。

-亞硝基谷胱甘肽還原酶；慢病毒；Neuro-2a細胞；-亞硝基化

-亞硝基谷胱甘肽還原酶（-nitrosoglutathione reductase， GSNOR）被認為是乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase， ADH）家族成員之一，為主要代謝乙醇的酶系。是編碼GSNOR的基因，位于人類4號染色體上（4q23-Chr4： 99993567-10000985）［1-2］。GSNOR的底物相較于其它類型的ADH有顯著區(qū)別，其主要底物是-亞硝基谷胱甘肽（-nitrosoglutathione， GSNO）和-羥甲基谷胱甘肽（-hydroxymethylglutathione， HMGSH）［3］。

-亞硝基化（-nitrosylation）是由一氧化氮（nitric oxide， NO）介導的基于氧化還原反應的一種修飾，作用位點在半胱氨酸（cysteine， Cys）巰基（?SH），Cys巰基被氧化修飾為-亞硝基硫醇（-nitrosothiols， SNOs），是一種常見的蛋白翻譯后信號轉(zhuǎn)導機制［3］。GSNO是機體-亞硝基化的主要調(diào)控因子。GSNOR介導的去亞硝基化就是NO基團從Cys巰基脫離，是NO信號通路的重要組分。GSNOR由NADH供能將GSNO催化轉(zhuǎn)換為中間產(chǎn)物GSNHOH，進一步轉(zhuǎn)換為二硫鍵形式的氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione， GSSG），GSSG再次還原為含疏基形式的谷胱甘肽（glutathione， GSH），這一過程被稱為去亞硝基化［1， 4］。-亞硝基化水平因生理刺激而發(fā)生變化，一般由細胞表面受體轉(zhuǎn)導，信號介導的NOS激活與蛋白-亞硝基化程度增加之間的關(guān)聯(lián)廣泛存在。內(nèi)源性-亞硝基化具有很高的時空特異性，使有游離巰基的蛋白發(fā)生翻譯后-亞硝基化修飾，具有激活特定蛋白活性、核質(zhì)分布、蛋白穩(wěn)定性以及蛋白間相互作用，參與損傷修復、應激狀態(tài)激活信號通路等生物活性，參與心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤等眾多疾病的發(fā)生、發(fā)展過程［1-2］。

GSNOR是目前腦中ADH主要成員，其參與大腦發(fā)育、神經(jīng)分化、血管生成及損傷保護等眾多病理生理過程。研究表明，過度表達可導致幼年和成年小鼠神經(jīng)元分化減少，這與組蛋白脫乙酰酶2（histone deacetylase 2， HDAC2）的去亞硝基化作用相關(guān)［5］；過表達通過調(diào)控神經(jīng)生長因子（nerve growth factor， NGF）抑制神經(jīng)突觸生長，降低神經(jīng)細胞分化比例；相反，敲除促進神經(jīng)元分化，間接調(diào)節(jié)染色質(zhì)重塑和控制神經(jīng)元分化的基因表達［6］。上述研究均提示GSNOR參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展和預后，提示GSNOR可作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的重要潛在靶點。

Neuro-2a細胞來源于小鼠神經(jīng)母細胞瘤，具有神經(jīng)生物學特性和內(nèi)分泌功能，一般用于毒性篩選、神經(jīng)分化、細胞損傷和藥物干預的體外模型［7］。GSNOR調(diào)控去亞硝基化的作用，已見文獻報道其下游靶蛋白參與神經(jīng)發(fā)育、分化及損傷調(diào)控等重要過程［8-9］。本研究通過細胞轉(zhuǎn)染和藥物篩選等方法，獲得穩(wěn)定低表達的Neuro-2a細胞系，對細胞系中GSNOR表達進行驗證，并檢測轉(zhuǎn)染后Neuro-2a細胞內(nèi)S-亞硝基化水平，為進一步深入發(fā)掘GSNOR的調(diào)控靶蛋白，研究其調(diào)控靶蛋白、細胞損傷保護和毒性篩選等作用機制提供體外細胞模型。

材料和方法

1　主要試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)液購自Gibco；和胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；PBS購自浙江森瑞生物技術(shù)有限公司；胰酶-EDTA購自HyClone；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）購自Sigma；LipoFiter?轉(zhuǎn)染試劑和嘌呤霉素購自漢恒生物技術(shù)（上海）有限公司；Cell Counting Kit-8 （CCK-8）、RNA快速提取試劑盒和SYBR Green qPCR Mix等購自上海奕杉生物科技有限公司；支原體預防去除試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Biotin Switch Assay Kit （-nitrosylation）和抗GSNOR抗體購自Abcam；抗β-actin抗體和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）標記的Ⅱ抗購自Cell Signaling Technology。

倒置顯微鏡（Nikon）；Synergy LX酶標儀（BioTek）；RT-qPCR儀（Roche）；高速低溫離心機（Thermo Fisher）；Ion Torrent 3500基因測序儀（Thermo Fisher Scientific）；電泳儀電源和凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad）。

2　細胞系和質(zhì)粒

小鼠Neuro-2a細胞系（批號：CCL-131）購自中國科學院上海細胞所。pHBLV-U6-MCS-PGK-PURO載體、psPAX2載體、pMD2G載體、基因干擾慢病毒及引物序列均由漢恒生物技術(shù)（上海）有限公司提供。

3　主要方法

3.1pHBLV-U6-MCS-PGK-PURO質(zhì)粒的提取與鑒定將pHBLV-U6-MCS-PGK-PURO載體、psPAX2載體和pMD2G載體共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染后分別在48和72 h收集病毒上清液，并將病毒上清液超速離心，得到最終的慢病毒保存液，于-80 ℃冰箱保存。采用Ion Torrent 3500基因測序儀對質(zhì)粒進行測序，并與目標基因片進行比對。

3.2pHBLV-U6-MCS-PGK-PURO質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及嘌呤霉素篩選將生長狀態(tài)良好的Neuro-2a細胞接種到12孔板，每孔1×105個，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細胞匯合率為30%～50%，加入50 μL病毒進行感染，同時加入適量聚凝胺。感染約24 h后，棄去含有病毒的培養(yǎng)液，換上常規(guī)細胞培養(yǎng)液。感染48 h后，加入嘌呤霉素（4.0 mg/L）篩選。慢病毒感染48～72 h后，感染效率約在80%左右，且細胞狀態(tài)穩(wěn)定，匯合率在60%～70%時，加入嘌呤霉素（4.0 mg/L）進行處理。加藥約48 h后觀察對照組細胞的存活率，若對照組細胞死亡率在90%以上，撤掉嘌呤霉素換新鮮的培養(yǎng)液培養(yǎng)。

3.3穩(wěn)定低表達的Neuro-2a細胞活力的檢測將生長狀態(tài)良好的Neuro-2a細胞經(jīng)胰酶消化后，以6×107/L的密度重懸接種于96孔板。貼壁培養(yǎng)24 h后按照CCK-8試劑盒說明書操作，并在450 nm處檢測吸光度（）值。

3.4RT-qPCR法檢測GSNOR的mRNA表達采用RNA快速提取試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。加40 μL DEPC水（即濃度為10 mg/L）于cDNA，取2 μL加入八聯(lián)管中，再加上、下游引物（序列見表1）各0.5 μL，SYBR Green 5 μL，DEPC水2 μL。94 ℃變性10 min；40個循環(huán)依次做94 ℃變性10 s、60 ℃退火15 s和72 ℃延伸20 s；最后在72 ℃延伸90 s，并根據(jù)產(chǎn)物的溶解曲線，得到Ct值。用2-ΔΔCt法計算GSNOR mRNA的相對表達水平。

表1　RT-qPCR引物序列

3.5Western blot法檢測GSNOR的蛋白表達采用細胞蛋白裂解液對細胞裂解，進行SDS-PAGE分離（10%分離膠），將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，搖床1～2 h，分別加入抗GSNOR（1∶500）和抗β-actin（1∶3 000）抗體，搖床4 ℃過夜；再用T-TBS洗滌3次，每次10 min；加入Ⅱ抗。ECL顯色曝光。

3.6生物素轉(zhuǎn)換法檢測-亞硝基化水平轉(zhuǎn)染后細胞用不含二硫蘇糖醇（1，4-dithio-DL-threitol， DTT）的細胞裂解液裂解，按生物素轉(zhuǎn)換法試劑盒說明書操作。通過離心清洗細胞并使其成沉淀。加入封閉緩沖液A，在4 ℃下離心30 min。取上清液，用冷丙酮沉淀。沉淀物用含有還原和標記試劑的緩沖液B重懸后，再用冷丙酮沉淀，重懸后HRP標記的Ⅱ抗進行Western blot。

4　統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用檢驗或單因素方差分析。以<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1　pHBLV-U6-MCS-PGK-PURO質(zhì)粒鑒定結(jié)果

基因測序結(jié)果顯示質(zhì)粒序列中包含5'-GATCCGACGAATTTGTGACCGGCAATCTCGAGATTGCCGTCACAAATTCGTCTTTTTTG-3'的堿基序列，結(jié)果與目的序列一致，提示質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖1。

Figure 1.　Sanger sequencing peak map of lentivirus transfer vector shRNA1-ADH5 fragment. DNA sequencing showed the sequence of recombinant plasmids of HBLV-m-ADH5 shRNA1 Puro lentivirus vector accorded with ADH5 gene sequence.

2　轉(zhuǎn)染后細胞形態(tài)及活力的變化

細胞轉(zhuǎn)染后，通過光鏡觀察細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)第2、4和6代的轉(zhuǎn)染細胞形態(tài)與對照組均無明顯差異，見圖2A。CCK-8結(jié)果顯示在24、48、72及96 h時點細胞活力無顯著差異，見圖2B。

Figure 2.　Morpholocical observation and cell viability were measured in the Neuro-2a cells after HBLV-m-ADH5-shRNA1 transfection. A： light microscopic micrographs were performed at the 2nd （P2）， 4th （P4） and 6th （P6） passages； B： cell viability was assessed at the designated time points （24， 48，72 and 96 h） by CCK-8 assay. Mean±SD. n=6.

3　RT-qPCR法檢測GSNOR的mRNA表達水平

RT-qPCR結(jié)果顯示，與對照組相比，第2、4和6代細胞系中GSNOR mRNA的表達量分別為空載病毒組的37.02%、40.66%和30.13%，均顯著降低（<0.01），見圖3。

Figure 3.　The mRNA expression of GSNOR was determined by RT-qPCR. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs sh-Control group.

4　Western blot檢測GSNOR的蛋白表達水平

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，第2、4和6代細胞系中GSNOR蛋白的表達量均顯著降低（<0.01），見圖4。

Figure 4.　The protein expression of GSNOR in transfected Neuro-2a cells at the 2nd （P2）， 4th （P4） and 6th （P6） passages was detected by Western blot. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs sh-Control group.

5　胞內(nèi)S-亞硝基化水平變化

生物素轉(zhuǎn)換法結(jié)果顯示，與sh-Control組相比，sh-ADH5轉(zhuǎn)染后Neuro-2a細胞胞內(nèi)-亞硝基化水平顯著上調(diào)（<0.01），見圖5。

Figure 5.　Cellular S-nitrosylation level was upregulated in transfected Neuro-2a cells. The S-nitrosylation level was detected by biotin switch method. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs sh-Control group.

討論

GSNOR介導的去亞硝基化是一種細胞受特殊刺激而產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導方式，其可維持蛋白-亞硝基化的平衡，從而維持機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，成為研究神經(jīng)退行性疾病關(guān)注的熱點之一。有研究報道敲除可顯著上調(diào)GSNO水平，從而影響-亞硝基化水平［10］。內(nèi)源性NO可促使一些特殊靶蛋白發(fā)生-亞硝基化，從而影響神經(jīng)元的活性和功能。

GSNOR作為腦中主要的ADH成員，對大腦發(fā)育和神經(jīng)分化過程十分重要。研究表明，過表達導致幼年和成年小鼠神經(jīng)元分化減少，降低神經(jīng)細胞分化比例，抑制神經(jīng)突觸生長；而低表達促進神經(jīng)元分化，其調(diào)控機制均由-亞硝基化修飾異常導致［5］。GSNOR還可間接調(diào)節(jié)染色質(zhì)重塑和控制神經(jīng)元分化的基因表達［6］。這些研究均提示，GSNOR參與神經(jīng)發(fā)育、分化及神經(jīng)病變過程。

雖然GSNOR介導特殊靶蛋白-亞硝基化的調(diào)控機制及特異性還未完全闡明，但越來越多的研究表明，parkin、Drp-1和CaMKIIα等蛋白的-亞硝基化已經(jīng)成為神經(jīng)退行性疾病病變過程的重要參與者。研究報道，老年人群的海馬體中GSNOR蛋白表達顯著上調(diào)，而衰老小鼠海馬中CaMKIIα Cys280和Cys289位點-亞硝基化水平降低，并導致其在海馬突觸體中的累積量減少，上述現(xiàn)象可通過在小鼠模型上敲除得到逆轉(zhuǎn)［11］。另有研究報道，阿爾茨海默病患者大腦和外周血液中均存在Drp1的-亞硝基化，Drp1 Cys644位點的-亞硝基化激活GTP水解酶并形成二聚體，導致線粒體的過度碎片化，因能量代謝失調(diào)而最終導致樹突棘丟失和神經(jīng)元死亡［12］。此外，帕金森?。≒arkinson disease， PD）小鼠模型中parkin蛋白-亞硝基化上調(diào)Drp-1蛋白表達，Drp-1及parkin的-亞硝基化修飾參與PD病變過程［13］。在PD細胞模型中，敲除可降低SH-SY5Y神經(jīng)細胞毒性，起神經(jīng)保護作用［14］。上述研究均提示，進一步探討GSNOR介導去亞硝基化修飾的分子機制研究，將有助于挖掘神經(jīng)退行性疾病的潛在新靶點。

構(gòu)建穩(wěn)定低表達神經(jīng)細胞模型有助于深入探討GSNOR調(diào)控神經(jīng)的生物學特性及-亞硝基化異常表達疾病的機制研究。短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA， shRNA）由含有特定核苷酸片段的質(zhì)粒表達，進入細胞內(nèi)隨著細胞增殖而復制，在細胞中穩(wěn)定表達［15］。與小干擾RNA（small interfering RNA， siRNA）相比，其優(yōu)點在于能穩(wěn)定表達特異性核苷酸干擾片段，使得細胞特定基因和蛋白穩(wěn)定低表達，適用于靶蛋白的后續(xù)研究［16］。本研究中，基因測序結(jié)果證實質(zhì)粒包含干擾序列后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Neuro-2a細胞中，GSNOR的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，表明穩(wěn)定低表達的Neuro-2a細胞系構(gòu)建成功。該細胞模型將為研究GSNOR調(diào)控神經(jīng)的生物學特性和神經(jīng)疾病模型的探索提供穩(wěn)定的體外模型。同時，表達shRNA-的Neuro-2a細胞系呈現(xiàn)總蛋白-亞硝基化修飾水平上調(diào)，為-亞硝基化修飾異常修飾參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究提供了潛在的細胞模型［17-18］。

本研究采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，基因測序結(jié)果證實質(zhì)粒包含干擾序列后將shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Neuro-2a細胞，構(gòu)建的Neuro-2a細胞系能穩(wěn)定低表達并易化細胞內(nèi)-亞硝基化水平，可用于后續(xù)GSNOR調(diào)控去亞硝基化的生物學作用及下游信號通路的研究。

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Construction ofknockdown stable Neuro-2a cell line and its effect on-nitrosylation

YAN Jie-ping1，2，3△， HAN Zhen-ping1， LI Ting-ting2， WANG Si-yi1， GAO Li2， LUO Shuang2， LI Han-bing1， Huang Ping2，3

（1，，，310014，2，，，，310014，3，310014，）

To construct a mouse neuroblastoma Neuro-2a cell line with stable knockdown of-nitrosoglutathione reductase （）， and to investigate its effect on-nitrosylation.The Neuro-2a cells were transfected with lentivirus-mediated short hairpin RNA （shRNA） targetingby LipoFiter? liposomes， and those with stable knockdown ofwere screened with puromycin. Morphological changes of the cells were observed by light microscopy. The cell viability was detected by CCK-8 assay. The mRNA and protein expression levels of GSNOR were revealed by RT-qPCR and Western blot. Biotin switch method was used to detect the intracellular total-nitrosylation level in the cells.The fragment sequence inserted in the recombinant lentivirus was identical to the designed oligo sequence， and the HBLV-m-ADH5-shRNA1-PURO lentiviral vector was successfully constructed. After puromycin screening， transfected Neuro-2a cells were observed with normal morphological characteristics under light microscope. No significant difference in cell viability was observed at the time points of 24， 48， 72 and 96 h. The mRNA levels of GSNOR at the 2nd， 4th and 6th passages were 37.02%， 40.66% and 30.13% of those in the scrambled group， respectively （<0.01）， and GSNOR protein expression was significantly lower than that in the scrambled group （<0.01）. Moreover，shRNA significantly increased intracellular-nitrosylation levels in Neuro-2a cells （<0.01）.The Neuro-2a cell line with stable low expression ofwas successfully constructed. Knockdown ofin Neuro-2a cells increased-nitrosylation levels of intracellular total protein.

-Nitrosoglutathione reductase； Lentivirus； Neuro-2a cells；-Nitrosylation

1000-4718（2022）09-1547-06

2022-04-24

2022-06-23

0571-85893117； E-mail： yanjieping@hmc.edu.cn

R741.02； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.09.002

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（No. 81903597）；浙江省自然科學基金資助項目（No. LQ16H310003）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（No. 2021KY016； No. 2022KY061）

（責任編輯：宋延君，李淑媛）