劉定相 張 倩 張 田 余 霞

（1.安順市疾病預防控制中心，貴州 安順 561000）

（2.關嶺自治縣疾病預防控制中心，貴州 安順 561300）

前言

霍亂弧菌（Vibrio cholerae）是革蘭氏陰性菌，菌體短小呈逗點狀，有單鞭毛、菌毛，部分有莢膜，共分為139個血清群，其中O1群和O139群可引起霍亂，分布于水生環(huán)境、魚蝦中，能夠導致魚類等水生動物的死亡，人可通過食用霍亂弧菌污染的魚蝦引起霍亂。氣單胞菌屬廣泛分布于自然界，可從水源、土壤以及人的糞便中分離，一定條件下能夠感染水產動物，導致出血病、潰瘍綜合征、赤皮、腸炎等疾病，對水產養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經濟損失，也可引起人類腹瀉等多種感染。近年來貴州省外仍有水產動物養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中存在霍亂弧菌、氣單胞菌污染的報道。貴州省內有市售水產品中霍亂弧菌污染方面的報道，并無水產養(yǎng)殖霍亂弧菌、氣單胞菌污染的調查報道。

目前，關嶺自治縣正大力發(fā)展水產養(yǎng)殖，積極探索鄉(xiāng)村振興策略，為了解關嶺縣水產養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中霍亂弧菌、氣單胞菌污染狀況，為本地區(qū)水產養(yǎng)殖業(yè)防治霍亂弧菌、氣單胞菌和降低因食用污染的水產動物引起食源性疾病風險提供科學依據。

1.材料與方法

1.1 標本來源

實驗樣本來自關嶺自治縣城區(qū)周邊水產動物養(yǎng)殖戶池塘或水庫的養(yǎng)殖水體、污泥及水產動物樣本共計62份。

1.2 方法

依據國家食品安全評估中心發(fā)布的《2020年國家食品污染物和有害因素風險監(jiān)測工作手冊》中《霍亂弧菌檢驗標準操作程序》和《致病性嗜水氣單胞菌檢驗方法》（GB/T 18652-2002）對樣本進行霍亂弧菌、氣單胞菌的培養(yǎng)、分離，結合梅里埃公司VITEK 2 Compact30全自動微生物生化鑒定系統對細菌進行鑒定；運用實時熒光PCR技術測定霍亂弧菌CTXAB毒力基因。

1.3 主要儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱、生物安全柜、生物顯微鏡、VITEK 2 Compact30全自動微生物生化鑒定系統、LightCycler 480實時熒光定量PCR儀。

1.4 主要試劑

3%氯化鈉堿性蛋白胨水、氧化酶試紙、嗜鹽性胰胨水（含氯化鈉0%、6%、8%、10%）、革蘭染液（由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產），科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基（由上海欣中生物工程有限公司生產），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產），GN鑒定卡（梅里埃生物科技有限公司生產），霍亂弧菌診斷血清（由杭州天潤生物制品公司生產），霍亂弧菌CTXAB核酸檢測預分裝試劑盒（由深圳生科原生物有限公司生產），所使用試劑均在有效期內。

1.5 統計分析

將調查監(jiān)測結果錄入計算機建立數據庫，利用SPSS 24.0對水產養(yǎng)殖水、污泥、水產動物樣本中霍亂弧菌、氣單胞菌的檢出率進行統計分析。

2.結果

2.1 霍亂弧菌檢測情況

2020-2021年關嶺自治縣城區(qū)周邊水產動物養(yǎng)殖戶池塘養(yǎng)殖水、污泥、水產動物樣本進行霍亂弧菌檢測，不同水產養(yǎng)殖樣本霍亂弧菌檢出情況見表1。

表1 不同水產養(yǎng)殖樣本中霍亂弧菌檢測情況

數據顯示，養(yǎng)殖水、污泥、水產動物62份樣本中有2份檢出霍亂弧菌，總檢出率3.23%（2/62）。23份養(yǎng)殖水中1份檢出霍亂弧菌，檢出率4.35%（1/23）；23份污泥樣本中1份檢出霍亂弧菌，檢出率4.35%（1/23），水產動物樣本中未檢出霍亂弧菌。養(yǎng)殖水、污泥、水產動物三類樣本中霍亂弧菌的檢出率存在統計學差異（χ2=6.000，P=0.05）。

2.2 氣單胞菌檢測情況

對2020-2021年關嶺自治縣城區(qū)周邊水產動物養(yǎng)殖戶池塘養(yǎng)殖水、污泥、水產動物樣本進行氣單胞菌檢測，不同水產養(yǎng)殖樣本氣單胞菌檢出情況見表2。

表2 不同水產養(yǎng)殖樣本中氣單胞菌檢測情況

監(jiān)測數據顯示，養(yǎng)殖水、污泥、水產動物62份樣本中有2份檢出氣單胞菌，總檢出率3.23%（2/62）。23份養(yǎng)殖水中2份檢出氣單胞菌，檢出率8.70%（2/23）；污泥、水產動物樣本中均未檢出氣單胞菌。養(yǎng)殖水、污泥、水產動物樣本中氣單胞菌的檢出率存在統計學差異（χ2=6.000，P=0.05）。

2.3 霍亂弧菌相關檢測情況

使用霍亂弧菌診斷血清對環(huán)境樣本分離的霍亂弧菌進行血清學分型，運用實時熒光定量PCR技術對霍亂弧菌是否攜帶CTXAB毒力基因進行定性測定。

2.3.1 霍亂弧菌血清學分型。對同一個養(yǎng)殖點環(huán)境樣本中分離的2份霍亂弧菌進行血清分型，霍亂弧菌血清學玻片凝集結果顯示，2份霍亂弧菌對多價O1群診斷血清出現凝集現象，稻葉型、小川型、彥島型及O139群診斷血清均未出現凝集現象，菌株鑒定均為O1群非稻葉型、非小川型、非彥島型霍亂弧菌。無菌生理鹽水組無凝集現象。結果見表3。

2.3.2 霍亂弧菌毒力基因檢測。利用實時熒光定量PCR技術對分離出的2份霍亂弧菌進行CTXA毒力基因定性測定，結果均為陰性。無菌生理鹽水組為陰性。結果見表3、表4。

表3 2份霍亂弧菌血清學分型及毒力基因檢測情況

表4 2份霍亂弧菌CTXAB毒力基因實時熒光PCR定性檢測曲線圖

結果顯示，環(huán)境樣本中分離的2份霍亂弧菌為01群霍亂弧菌，均未攜帶CTXAB毒力基因。

3.討論

霍亂弧菌（Vibrio cholerae）是革蘭氏染色陰性，彎曲或呈逗點狀的需氧桿菌，廣泛分布在水生環(huán)境中，是水產動物養(yǎng)殖中常見的致病菌，大量繁殖可導致養(yǎng)殖的水產動物出現病變、死亡，人因食用被污染的水產動物易引起霍亂。本次監(jiān)測的62份樣本中，2份樣本檢出霍亂弧菌（檢出率3.23%），是關嶺縣首次在水產養(yǎng)殖環(huán)境中檢出嗜鹽性弧菌，可能與霍亂弧菌的生長特性有關，霍亂弧菌在無鹽或低鹽、PH8.8-9.0的水環(huán)境中生長良好，關嶺縣屬于淡水較豐富的地區(qū)，多數水環(huán)境pH酸堿度接近中性，養(yǎng)殖環(huán)境仍存在符合霍亂弧菌生長的條件，因此，相關部門應加強對水產養(yǎng)殖的關注。

CTXAB基因是霍亂弧菌霍亂毒素的編碼基因，攜帶CTXAB毒力基因的霍亂弧菌容易導致水產養(yǎng)殖動物病變、死亡，可引起人類腸道疾病霍亂的發(fā)生。本次污染狀況調查發(fā)現，污染養(yǎng)殖環(huán)境中的O1群霍亂弧菌均未攜帶CTXAB毒力基因，說明養(yǎng)殖環(huán)境中霍亂弧菌這與李成偉、李濤、劉祥亮等調查一致。

氣單胞菌廣泛分布于自然界的土壤、水環(huán)境中，屬于條件致病菌，主要感染魚類、兩棲類、爬行類、哺乳類等多種動物，同時也是畜禽、水產等肉類食品重要的傳染源。水產動物因生活在水環(huán)境中，當出現養(yǎng)殖水質惡化、機體損傷等，較易遭受感染。本次調查結果顯示，62份樣本中2份樣本檢出氣單胞菌，檢出率3.23%，污泥、水產動物樣本未檢出氣單胞菌，提示水產動物養(yǎng)殖環(huán)境已被氣單胞菌污染，因此，弄清污染來源對采取針對性防控措施具有重要意義。

如今，國內交通、物流行業(yè)日益發(fā)達，內陸與沿海地區(qū)物品流通頻率高，可能存在從沿海地區(qū)購入水產養(yǎng)殖魚、蝦苗情況，霍亂弧菌可能會從沿海地區(qū)向內陸蔓延，會成為影響關嶺縣食品安全的風險因素。本次對水產養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中養(yǎng)殖水、污泥、水產動物三類樣本進行霍亂弧菌污染狀況的檢驗，2份樣本檢出霍亂弧菌，霍亂弧菌檢出樣本為同一魚類養(yǎng)殖點，為有流動水源少量流入的魚類養(yǎng)殖池塘，采樣前有外購魚苗入塘情況，后續(xù)出現魚類死亡現象。本次調查中，由于未采集到流入水源樣本和魚標本，不能充分分析出霍亂弧菌污染唯一來源，但該養(yǎng)殖池塘的水體、污泥均有檢出霍亂弧菌，說明養(yǎng)殖環(huán)節(jié)存在霍亂弧菌污染的風險。

綜上所述，關嶺縣水產養(yǎng)殖水、污泥等環(huán)境樣本中存在霍亂弧菌、氣單胞菌的污染，相關部門應高度關注，持續(xù)加強對水產養(yǎng)殖各環(huán)節(jié)、水環(huán)境中氣單胞菌、霍亂弧菌污染及毒力狀況、藥物敏感性監(jiān)測，以及時采取措施，減少關嶺縣水產養(yǎng)殖戶的經濟損失，降低因食用霍亂弧菌、氣單胞菌污染的水產動物引起食源性疾病等的傳播風險。