吳華秀，吳新文，毛敏霞，黃永橋

（貴州省檢測(cè)技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州貴陽(yáng) 550014）

茶黃素具有抗氧化、抑菌、抗炎、防癌、抗腫瘤以及防治心血管疾病等功能[1]。其是由多酚類及其衍生物氧化縮合而成，是一類具有苯駢卓酚酮結(jié)構(gòu)的化合物的總稱，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的茶黃素有12種，其中茶黃素TF、茶黃素單沒(méi)食子酸酯TF-3-G、茶黃素單沒(méi)食子酸酯TF-3’-G和茶黃素雙沒(méi)食子酸酯TFDG是4種最主要的茶黃素[2]。茶黃素是紅茶中的主要成分，對(duì)紅茶的色香味及品質(zhì)起著決定性的作用。紅茶中茶黃素含量的高低與用于制作紅茶的茶樹(shù)品種所生長(zhǎng)的環(huán)境有很大的關(guān)系，以碳酸巖為主的地質(zhì)環(huán)境更有利于紅茶的生產(chǎn)[3-5]。

目前有關(guān)茶黃素的測(cè)定一般有分光光度法[6]、毛細(xì)管電泳法[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-10]、高效液相色譜法[11-17]等。在國(guó)標(biāo)和各類文獻(xiàn)[6-17]中對(duì)紅茶樣品中茶黃素的提取和測(cè)定方法條件參數(shù)都各不相同，有利有弊。本文采用高效液相色譜法測(cè)定紅茶中的茶黃素含量，通過(guò)對(duì)提取溶劑、提取時(shí)間、提取溫度等條件進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)化并規(guī)范了測(cè)定紅茶中茶黃素的前處理方法，再對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行對(duì)比分析，找到最優(yōu)的色譜條件，避免了實(shí)際樣品帶來(lái)的雜質(zhì)干擾問(wèn)題，滿足測(cè)定紅茶中茶黃素的定性和定量要求，保證了茶黃素含量分析的準(zhǔn)確性。采用該方法對(duì)全國(guó)10種紅茶及貴州喀斯特山區(qū)12個(gè)茶樹(shù)品種紅茶中的茶黃素含量進(jìn)行測(cè)定，為分析貴州喀斯特山區(qū)紅茶品質(zhì)提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

貴州生產(chǎn)加工的12個(gè)茶樹(shù)品種紅茶；其他地區(qū)品種紅茶（正山小種紅茶、祁門工夫、滇紅工夫、川紅工夫、寧紅工夫、閩紅工夫、湖紅工夫、宜紅工夫、越紅工夫以及九曲紅梅）均購(gòu)于貴陽(yáng)市各大型超市。

乙腈（色譜純），德國(guó)Merck公司；甲醇（分析純）、乙酸乙酯（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；冰乙酸（色譜純）、茶黃素（TF）、茶黃素單沒(méi)食子酸酯（TF-3’-G）、茶黃素單沒(méi)食子酸酯（TF-3’-G）、茶黃素雙沒(méi)食子酸酯（TFDG）（純度均大于98%）以及0.22 μm PTFE針式濾膜，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

Agilent 1290高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測(cè)器），美國(guó)Agilent公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省常州市金壇區(qū)水北科普實(shí)驗(yàn)儀器廠；LT2002電子天平，常熟市天量?jī)x器有限公司；離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Milli-Q超純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取4種茶黃素化合物標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.000 1 g）于10 mL容量瓶中，甲醇溶液溶解并定容至刻度，配制成濃度均為1.00 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃保存。分別取4種茶黃素化合物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各2.00 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成200.00 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：2%乙酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈+乙酸乙酯（42+3）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；DAD檢測(cè)器波長(zhǎng)：280 nm；梯度洗脫：0～16 min，15% B；16～25 min，20% B；25～35 min，20%→24% B；35～37 min，24%→15% B；37～40 min，15% B。

1.2.3 樣品前處理

稱0.5 g（精確至0.001 g）樣品，加入10 mL 70%甲醇水溶液，在80 ℃水浴中提取10 min，取出冷卻至室溫，離心，取上清液，于25 mL容量瓶中，重復(fù)提取1次，合并上清液于容量瓶中，加70%甲醇溶液定容至刻度，混勻，過(guò)膜，上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溶劑濃度對(duì)茶黃素提取率的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用一定濃度的甲醇溶液為提取溶劑時(shí)，在一定溫度的水浴中直接提取的前處理方法的提取效率更高。本文選擇50%、60%、70%、80%、90%以及100%的甲醇溶液，在相同溫度水浴中提取10 min，提取2次，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，不同濃度的甲醇對(duì)茶黃素的提取率影響較大，甲醇濃度太低時(shí)，茶黃素在溶劑中的溶解度較低，提取速率變慢，造成茶黃素的提取率偏低；隨著甲醇濃度的提高，茶黃素的提取率不斷提高。甲醇濃度在60%～80%時(shí)，茶黃素的含量基本保持不變，當(dāng)甲醇濃度達(dá)到90%后，由于水分含量太低，不利于樣品快速軟化溶解，導(dǎo)致茶黃素提取困難，提取率開(kāi)始降低，同時(shí)隨著甲醇濃度的提高，樣品雜質(zhì)干擾也越來(lái)越嚴(yán)重。因此，甲醇濃度為70%時(shí)，既能保證較高的提取率，樣品雜質(zhì)干擾也較少。

圖1 提取溶劑濃度的選擇

2.1.2 提取溫度對(duì)茶黃素提取率的影響

提取溫度的高低會(huì)直接影響茶黃素的提取效率，試驗(yàn)選擇70%的甲醇為提取溶劑，分別在60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃以及85 ℃水浴中提取10 min，提取2次，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)提取溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，繼續(xù)提高提取溫度，茶黃素提取率無(wú)明顯增加，這是由于提取溫度過(guò)高，提取溶劑會(huì)沸騰，不利于試驗(yàn)的進(jìn)行。另外，溫度過(guò)高會(huì)加速茶黃素的氧化分解，不利于試驗(yàn)的控制。綜合考慮，提取溫度選擇80 ℃時(shí)為最佳。

圖2 提取溫度的選擇

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)茶黃素提取率的影響

提取時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響茶黃素的提取效果，試驗(yàn)選擇70%的甲醇為提取溶劑，在80 ℃的水浴中分別提取5 min、10 min、15 min、20 min、25 min以及30 min，提取2次，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，提取時(shí)間低于10 min時(shí)，茶黃素提取不充分，茶黃素提取率低；提取時(shí)間達(dá)到10～15 min時(shí)，茶黃素含量增長(zhǎng)緩慢，隨著提取時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，提取效率逐漸降低。因此，提取時(shí)間選擇15 min為最佳。

圖3 提取時(shí)間的選擇

2.2 樣品前處理正交設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)試驗(yàn)有影響的提取溶劑濃度（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）這3個(gè)因子進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)，以茶黃素總含量為考察指標(biāo)，正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，經(jīng)極差分析（R）分析可知，影響紅茶中姜黃素總含量的因素大小為A＞C＞B，即提取溶劑濃度和提取時(shí)間是影響紅茶中茶黃素提取率的關(guān)鍵性因子，而提取溫度對(duì)其的影響最小。從表2可以看出，茶黃素總含量最高的組合為A3B3C2，結(jié)果為0.849%；由K值分析得到的最佳組合為A3B2C3，即用70%的甲醇為提取溶劑，在75 ℃的水浴中提取15 min，提取2次，得到最佳條件下，茶黃素總含量為0.853%，高于組合A3B3C2。因此，試驗(yàn)得到的最佳組合為A3B2C3。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 流動(dòng)相的選擇與優(yōu)化

文獻(xiàn)表明[12]，在流動(dòng)相中加入乙酸乙酯對(duì)目標(biāo)物的分離度有較大影響。通過(guò)改變乙酸乙酯的濃度可以調(diào)節(jié)4種茶黃素的分離度、峰形及保留時(shí)間，通過(guò)優(yōu)化最后選擇A：2%乙酸水溶液、B：乙腈+乙酸乙酯（42+3）作為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)物分離度、峰形等均為最佳。標(biāo)準(zhǔn)溶液及實(shí)際樣品圖譜如圖4所示，分析時(shí)間為40 min，縮短了分析時(shí)間，實(shí)際樣品測(cè)定中雜質(zhì)干擾小、出峰順序及保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液出峰順序及保留時(shí)間保持一致。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）及實(shí)際樣品（B）圖譜

2.3.2 色譜柱的選擇

流動(dòng)相的pH值在2左右，ZORBAX SB-C18能耐受的pH值范圍為1～8，在保證具有良好的分離度和峰型的同時(shí)，該色譜柱能耐受較低pH值的流動(dòng)相，在分析樣品時(shí)可以保證色譜柱不被損壞，保證色譜柱的正常使用壽命，所以最后選擇該色譜柱。

2.3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

用DAD檢測(cè)器對(duì)4種茶黃素進(jìn)行光譜掃描，4種茶黃素均在波長(zhǎng)為280 nm左右處有最大吸收值，4種茶黃素的響應(yīng)值最佳，干擾較小。因此，選擇280 nm作為4種茶黃素的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低檢出限

配制質(zhì)量濃度為2.00～200.00 μg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積和濃度計(jì)算回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表3，在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2＞0.999；通過(guò)S/N=3計(jì)算得出茶黃素（TF）、茶黃素單沒(méi)食子酸酯（TF-3-G）、茶黃素單沒(méi)食子酸酯（TF-3’-G）以及茶黃素雙沒(méi)食子酸酯（TFDG）的檢出限結(jié)果。

表3 檢出限和線性范圍

2.5 精密度及加標(biāo)回收試驗(yàn)

選擇3個(gè)添加水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平做6次加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4，平均回收率均在95.9%～98.2%，精密度在1.5%～4.7%，說(shuō)明該方法具有較好的重復(fù)性與準(zhǔn)確性。

表4 回收率和精密度（n=6）

2.6 紅茶樣品的測(cè)定

2.6.1 貴州茶樹(shù)品種紅茶中茶黃素的含量

采用建立的分析方法對(duì)貴州12種茶樹(shù)品種的27批次紅茶進(jìn)行茶黃素含量的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。不同品種紅茶中4種茶黃素及茶黃素總量的含量存在一定差異。其中，TF含量為0.01%～0.17%，TF-3-G含 量 為0.10%～0.26%，TF-3’-G含 量 為0.04%～0.14%，TFDG含 量 為0.16%～0.64%。TFDG含量高于其他3種茶黃素，金牡丹二葉中4種茶黃素及茶黃素總量均為最高，分別為0.17%、0.26%、0.14%、0.43%及1.00%；丹桂-2和古樹(shù)-1的茶黃素總量含量最低，均為0.46%。

表5 貴州12個(gè)茶樹(shù)品種紅茶中茶黃素的含量

2.6.2 其他地區(qū)10種紅茶中茶黃素的含量

采用建立的分析方法對(duì)其他10種紅茶中茶黃素的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。湖紅工夫中茶黃素總量高于其他幾種紅茶，為0.73%；九曲紅梅中茶黃素總量最低，為0.38%；寧紅工夫和湖紅工夫中TFDG的含量為10種紅茶中最高，為0.37%。

表6 其他10種紅茶中茶黃素的含量

綜上，不同品種紅茶中4種茶黃素及茶黃素總量的含量存在一定差異，貴州茶樹(shù)品種紅茶中茶黃素總量在0.46%～1.00%，其他地區(qū)紅茶品種茶黃素總量在0.38%～0.73%，且貴州茶樹(shù)品種紅茶中平均茶黃素總量高于其他地區(qū)紅茶品種；TFDG含量高于其他3種茶黃素，TF含量均為最低，金牡丹二葉中茶黃素總量含量最高，九曲紅梅中茶黃素總量含量最低，419-3茶中TFDG含量為所測(cè)紅茶中最高，為0.64%。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)前處理方法和儀器條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了高效液相色譜測(cè)定紅茶中茶黃素的分析方法，方法線性和精密度良好，可用于實(shí)際樣品檢測(cè)。采用該方法對(duì)貴州茶樹(shù)品種紅茶中和其他地區(qū)紅茶品種中茶黃素的含量進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)全國(guó)10種紅茶中4中茶黃素的含量在0.38%～0.73%，平均含量為0.57%；貴州喀斯特山區(qū)12個(gè)茶樹(shù)品種紅茶中，4種茶黃素的含量在0.46%～1.00%，平均含量為0.67%。結(jié)果表明，不同品種紅茶中4種茶黃素及茶黃素總量的含量存在一定差異，貴州喀斯特山區(qū)中的茶樹(shù)生產(chǎn)出來(lái)的紅茶比其他地區(qū)10種紅茶中茶黃素總量的平均含量要高出0.10%，這可能與貴州喀斯特山區(qū)以碳酸巖為主的地質(zhì)背景有關(guān)。