賴崇熙，劉喚明，唐金燕

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524088)

耐高溫微生物是一類最適生長溫度大于50 ℃微生物的總稱，其通常分布在地質(zhì)結(jié)構(gòu)活躍的酸性硫磺區(qū)、淡水溫泉和間歇噴泉深?；鹕娇诘?。雖然目前耐高溫菌株的探究并不多，但是在實(shí)際的工業(yè)生產(chǎn)中已經(jīng)有各種各樣的研究應(yīng)用，例如詹亞斌等運(yùn)用耐高溫油脂降解菌株降解廚余垃圾，加快堆肥腐熟的過程；劉輝等用耐高溫的釀酒酵母進(jìn)行釀酒，提高乙醇的生產(chǎn)效率，降低成本，提高乙醇的穩(wěn)定性；侯世杰利用耐高溫復(fù)合菌劑對有機(jī)廢棄物進(jìn)行堆肥處理，實(shí)現(xiàn)廢棄物的資源化回收；溫俊麗研究發(fā)現(xiàn)新的高溫產(chǎn)電厚壁菌門細(xì)菌為高溫燃料電池的研發(fā)提供了新的思路；Seesatat等用嗜熱木質(zhì)纖維素分解菌對稻稈進(jìn)行發(fā)酵并且在15 d達(dá)到了產(chǎn)甲烷和沼氣的最大值；Liu等研究發(fā)現(xiàn)嗜熱細(xì)菌+ 0.2 g/g VSS烷基聚葡萄糖可以有效降解海洋養(yǎng)殖中產(chǎn)生的廢棄物等。耐高溫微生物與常規(guī)的微生物相比存在極大的優(yōu)勢，耐高溫的特性使其在發(fā)酵工業(yè)、廢水處理、工業(yè)生產(chǎn)等方面都有廣泛的應(yīng)用前景。耐高溫微生物產(chǎn)生的酶系具有催化效率高、對反應(yīng)冷卻系統(tǒng)要求低、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、節(jié)約能源、專一性強(qiáng)等特點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)使得耐高溫酶系一度成為人們的研究熱點(diǎn)，其中以蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶尤為突出。Darwesh等使用G550菌株產(chǎn)生的耐高溫堿性蛋白酶作為生物防治劑抑制線蟲的繁殖；Liu等使用耐高溫的纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇并且生產(chǎn)率達(dá)0.112 g/g干物底；Vaikundamoorthy等研究表明海洋細(xì)菌蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生的耐高溫淀粉酶對海洋生物膜形成的細(xì)菌銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出良好的抗生物膜活性，具有成為良好抗菌劑的潛力。這些都表明耐高溫的微生物及其酶系已經(jīng)成為人們的研究熱點(diǎn)，但是目前所發(fā)現(xiàn)的耐高溫的微生物及其酶系并不多，需要人們不斷地探索，才能滿足人們的生產(chǎn)以及科研的要求。

湖光巖坐落于我國大陸南端，具有特殊的瑪珥火山地貌，是世界兩大瑪珥湖之一?，旂砗怯捎诨鹕奖l(fā)導(dǎo)致底層塌陷形成盆地，而火山的噴發(fā)物在附近形成“圍墻”將其與周圍環(huán)境分隔開，盆地形成積水最后變成湖。也正是如此使得湖光巖瑪珥湖可以記錄下其氣候的變化、季風(fēng)的演變，而其土壤和湖水中很好地保存了各種各樣的古細(xì)菌、耐高溫菌、甲烷微菌、藻類、浮游植物等。湖光巖的特殊地貌使得在這里生長的微生物與其他地區(qū)的微生物存在一定程度上的差別，有的學(xué)者也進(jìn)行了關(guān)于湖光巖的微生物的多樣性研究，但是目前鮮見湖光巖耐高溫微生物相關(guān)方面的研究。因此該研究通過對湖光巖耐高溫微生物的多樣性分析以及產(chǎn)酶特性的研究，為湖光巖的菌株開發(fā)利用提供參考，為耐高溫微生物以及耐高溫酶的豐富發(fā)展提供助力。

1 材料與方法

試材。土壤樣品，取自湛江市湖光巖風(fēng)景區(qū)10 cm以下；革蘭氏染色液試劑盒，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；2×MightyAmp Buffer Ver.2、MightyAmp DNA 聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司；16S rRNA 細(xì)菌通用引物1492R、16S rRNA 細(xì)菌通用引物27F、DL 2000 DNA Marker、ddHO， 生工生物工程(上海)股份有限公司；核酸染色液，北京索萊寶科技有限公司；6×loading buffer、瓊脂糖，廣州艾基生物技術(shù)有限公司。

培養(yǎng)基。羥甲基纖維素納培養(yǎng)基，參考張進(jìn)良的方法，即NaCl 6 g、CaCl0.1 g、MgSO·7HO 0.1 g、KHPO0.5 g、KHPO2 g、(NH)SO2 g、CMC-Na(羧甲基纖維素鈉)10 g、瓊脂15 g,蒸餾水1 000 mL。脫脂牛奶培養(yǎng)基：脫脂奶粉100 g、瓊脂20 g、水1 000 mL，將配好的瓊脂和奶粉進(jìn)行分開滅菌，防止奶粉發(fā)生變性，瓊脂121 ℃滅菌20 min，脫脂奶粉100 ℃,5 min。可溶性淀粉培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、KNO1 g、NaCl 0.5 g、KHPO0.5 g、MgSO0.5 g、FeSO10 mg、瓊脂20 g，水1 000 mL。營養(yǎng)瓊脂：瓊脂20.0 g、牛肉膏 3.0 g、氯化鈉 5.0 g、蛋白胨10.0 g。

儀器。AUY220 電子天平，日本島津企業(yè)管理(中國)有限公司；SW-CI-2F 潔凈工作臺、BXP-280S 微生物培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；A300 梯度PCR儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；LS-B50L 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；H6-1 微型電泳槽，上海精益電器廠有限公司；DYY-8C 電泳儀，北京六一生物科技有限公司；JY3002 精密電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；L1100A 生物顯微鏡，廣州粵顯光學(xué)儀器有限公司；ZF-20D 暗箱式紫外分析儀，孔義市子華儀器有限責(zé)任公司。

湖光巖風(fēng)景區(qū)耐高溫微生物的分離純化。稱取10 g的土壤樣品加至90 mL的無菌水中，振蕩20 min使樣品與無菌水充分混勻，配制成10的稀釋液。取1 mL的稀釋液加至9 mL的無菌水中依次配制成10、10稀釋度的稀釋液。取分別100 μL的10、10稀釋菌液在營養(yǎng)平板上進(jìn)行涂布分離，將涂布完成的平板在培養(yǎng)箱中正面放置10 min，待菌懸液吸收完全后再倒置進(jìn)行50 ℃培養(yǎng)24 h，通過此法分離出的菌株為耐高溫微生物。挑取涂布平板內(nèi)菌落特征不一樣的菌落用四分法劃線于營養(yǎng)瓊脂平板內(nèi)，對菌株進(jìn)行多次純化直到分出單個菌落為止，并且制作成斜面進(jìn)行菌種保藏。

耐高溫菌株的鑒定。

形態(tài)學(xué)鑒定。從分離出的耐高溫微生物菌種斜面上取一環(huán)菌株在營養(yǎng)瓊脂上進(jìn)行劃線，在50 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察并且記錄菌株的菌落形態(tài)，通過革蘭氏染色進(jìn)行制片，然后用顯微鏡進(jìn)行觀察，記錄染色結(jié)果。

分子生物學(xué)鑒定。采用16S rRNA進(jìn)行鑒定，對分離出的菌株進(jìn)行劃線，得到單菌落，采用細(xì)菌的DNA作為模板，用通用引物27F(- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -)和1492R(- GGTTACCTTGTTACGACTT -)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系30 μL：2×MightyAmp buffer 15.00 μL，MightyAmp DNA聚合酶0.75 μL，引物27F(10 μmol/μL) 0.75 μL，引物1492R(10 μmol/μL) 0.75 μL，ddHO 12.75 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸90 s，進(jìn)行40個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)保存。取4 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL的6×loading buffer混合在1%的凝膠中電泳，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列檢測。將檢測結(jié)果與EzBioCloud和NCBI中的堿基序列數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast對比，搜索出同源相關(guān)性最高的標(biāo)準(zhǔn)參考序列，對其構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并且進(jìn)行多樣性分析。

產(chǎn)酶能力測定。

產(chǎn)蛋白酶能力。將篩選出的菌株挑取單菌落于脫脂奶粉平板上，50 ℃培養(yǎng)24 h，水解圈越大，產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。

產(chǎn)淀粉酶能力。將篩選出的菌株挑取單菌落于可溶性淀粉平板上，50 ℃培養(yǎng)24 h，滴加盧戈氏碘液觀察水解圈大小，水解圈越大，產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。

產(chǎn)纖維素酶能力。將篩選出的菌株挑取單菌落于羧甲基纖維素鈉平板上，50 ℃培養(yǎng)5 d，加入1%剛果紅溶液，使剛果紅溶液覆蓋整個平板等待15 min左右，用1 mol/L氯化鈉溶液洗去剛果紅溶液，觀察水解圈大小，水解圈越大，產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

從湖光巖的土壤樣品中，通過高溫培養(yǎng)分離出10株細(xì)菌，編號為S～S，對其進(jìn)行純化，根據(jù)菌落的顏色、菌落的形態(tài)特征、菌落的干濕黏稠特征、菌落的大小、邊緣分布特征、有無光圈等記錄其菌落特征，結(jié)果如表1所示。其中S和S菌株表現(xiàn)出淡黃色，其余8株均為白色；細(xì)菌形態(tài)為圓形的共有7株，分別為S、S、S、S、S、S、S，剩余的S為不規(guī)則形狀，S為點(diǎn)狀，S為線狀；只有S菌株不易挑起；只有S和S菌株邊緣不完整，其中S邊緣呈不規(guī)則，S邊緣呈嚙蝕狀；只有S菌株表面不光滑；所有菌株都沒有光澤。

經(jīng)革蘭氏染色以及鏡檢檢測，10株有耐高溫特點(diǎn)的菌株有一株為革蘭氏陰性菌，編號為S，其余9株均為革蘭氏陽性菌。10株菌株的形態(tài)全部呈桿狀，其中，S、S為長桿菌，其余8株為短桿菌。

將10株耐高溫菌株進(jìn)行16S rRNA序列檢測，采用NCBI、EZBioCloud、GenBank等公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性搜索，把與檢測出的基因序列相似性較高的已取得證書的模式菌株的基因序列下載下來，對它們的類別進(jìn)行區(qū)分以及統(tǒng)計它們之間的相似性，結(jié)果見表2。從表2可以看出，這10株細(xì)菌被分為3個類群，S、S、S、S、S、S、S為芽孢桿菌()類群，而S、S為短芽孢桿菌()類群，S為解脲芽孢桿菌()類群。其中屬的菌株有7株，占耐高溫菌株的70%，占絕對優(yōu)勢，屬于優(yōu)勢菌群。

表1 耐高溫菌株的菌落形態(tài)

表2 所篩選細(xì)菌與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切的典型菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

把送檢得出的樣品的基因序列與相似性較高的已取得證書的模式菌株的基因序列采用MEGA 7.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，這10株菌株均與不同的典型菌株聚在一起，再結(jié)合表2細(xì)菌序列比對結(jié)果，這些從湖光巖風(fēng)景區(qū)篩選出的有50 ℃耐高溫特性的菌株與其相關(guān)的已知物種的典型菌株的16S rDNA基因序列相似性在98.6%～99.8%，說明這些菌株由湖光巖風(fēng)景區(qū)篩選出的有50 ℃ 耐高溫特性的菌株與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最密切的相關(guān)菌株之間存在不同程度的遺傳差異。

由表3可知，有4株菌株具有產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶的能力，其中菌株S的產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，這些菌株將在工業(yè)生產(chǎn)中有巨大的應(yīng)用前景。菌株S只具備產(chǎn)蛋白酶的能力，有5株菌株均不具有產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶的能力。

圖1 依據(jù)16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA sequence

3 討論與結(jié)論

微生物具有生長范圍廣、繁殖快等特點(diǎn)，因此微生物制劑被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、食品以及醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)領(lǐng)域。但是隨著工業(yè)的發(fā)展，人們對于生產(chǎn)效率的要求不斷提高，酶制劑就出現(xiàn)在人們的眼前，通過微生物的發(fā)酵產(chǎn)生大量的生物酶再將其分離制作成酶制劑，酶制劑具有微量高效、專一性強(qiáng)、節(jié)能環(huán)保、綠色無毒、反應(yīng)條件溫和的優(yōu)點(diǎn)，這使得其在基礎(chǔ)研究、醫(yī)藥、養(yǎng)殖、日常生活、環(huán)保、飼料工業(yè)、皮革工業(yè)、食品領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

酶制劑在實(shí)際生產(chǎn)中往往是以一種或幾種單一酶制劑為主體,與其他單一酶制劑混合而成的，這樣使得復(fù)合酶制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用變得比較煩瑣。蛋白酶在洗滌劑、皮革、醫(yī)療、食品等工業(yè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用；纖維素酶被廣泛應(yīng)用在食品、造紙、發(fā)酵、紡織、農(nóng)業(yè)、制藥、生物燃料等行業(yè)；淀粉酶在從食品、飲料、紡織等不同過程中都有出色的應(yīng)用市場，這些酶的運(yùn)用領(lǐng)域都是相關(guān)聯(lián)的，因此探究發(fā)現(xiàn)能同時產(chǎn)生大量蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶的微生物就顯得十分有必要，這樣就可以直接解決工業(yè)上多種酶的需求，節(jié)約生產(chǎn)流程和成本。

表3 菌株產(chǎn)酶能力

經(jīng)過耐高溫的分離培養(yǎng)、純化得到10株耐高溫微生物，對其進(jìn)行16S rRNA鑒定發(fā)現(xiàn)其中有7株菌株屬于，2株菌株屬于，1株屬于。通過測定分離菌株的產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶能力可以得知，菌株S的產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，能同時產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶，相信該菌株的探索研究能為湖光巖的菌株開發(fā)利用提供參考。